WO2004108272A1

WO2004108272A1 - 吸着剤、吸着装置および吸着装置の製造方法

Info

Publication number: WO2004108272A1
Application number: PCT/JP2004/008364
Authority: WO
Inventors: Shintaro Kobayashi; Tsuneo Okuyama
Original assignee: Pentax Corporation
Priority date: 2003-06-09
Filing date: 2004-06-09
Publication date: 2004-12-16
Also published as: US20070181478A1; EP1649927A4; JPWO2004108272A1; US7919432B2; JP4870429B2; EP1649927A1

Abstract

本発明の吸着剤は、少なくとも表面付近がCa10(PO4)6((OH)1-xAx)2[ただし、Aはハロゲン元素を示し、0≦x≦1である]で表されるアパタイトで構成され、このアパタイトが有するリン酸基に、3価の金属イオンが結合してなることを特徴とする。また、3価の金属イオンは、Fe3+であるのが好ましい。本発明によれば、目的とする化合物を特異的に吸着し得る吸着剤を提供することができる。また、目的とする化合物を容易かつ確実に分離・精製することができる吸着装置、およびかかる吸着装置を容易かつ短時間で製造することができる吸着装置の製造方法を提供することができる。

Description

p及着剤、吸着装置および吸着装置の製造方法技術分野

本発明は、吸着剤、吸着装置および吸着装置の製造方法に関するものである。背景技術

タンパク質研究の分野においては、タンパク質の構造や機能を解析する手法として、 c D NAを用いてタンパク質を多量に発現させ、得られたリコンビナントタンパク質を分離 ·精製することが行われている。

また、遺伝子によって翻訳されたタンパク質はリン酸化、糖鎖の付加のように種々の修飾を受け、その機能が調節される。この翻訳後の修飾は、細胞内情報伝達、細胞周期の調節、代謝調節等に関与しており、細胞調節機構として重要である。このようなタンパク質の調節機構を研究するため、未修飾のタンパク質と修飾されたタンパク質とを分離 ·精製する手法の開発が求められている。

ここで、ハイドロキシアパタイトは、生体親和性に優れることから、従来から、タンパク質等を吸着 ·分離する液体クロマトグラフィー用カラム（吸着装置）に使用する吸着剤として広く利用されている（例えば、特開平 9一 1 7 5 8 0 5号公報参照）。

ところが、ハイドロキシアパタイト製の吸着剤は、各種タンパク質を非特異的に吸着してしまい、特定のタンパク質を選択的に吸着させることが困難であるという問題があり、前述したような未修飾のタンパク質と修飾されたタンパク質とを分離 ·精製する目的での使用には適さない。発明の開示

本発明は、上記問題点に鑑みなされたもので、その目的は、目的とする化合物を特異的に吸着し得る吸着剤、目的とする化合物を、容易かつ確実に分離 ·精製することができる吸着装置、および、かかる吸着装置を容易かつ短時間で製造することができる吸着装置の製造方法を提供することにある。

上記目的を達成するために、本発明は、少なくとも表面付近が C a 。（P〇 ₄ ) ₆ ( (OH) ！ _ _x A_x ) ₂ [ただし、 Aはハロゲン元素を示し、 0≤χ≤1 である] で表されるアパタイトで構成され、前記アパタイトが有するリン酸基に、 3価の金属イオンが結合してなることを特徴とする吸着剤に関する。

このような構成により、 3価の金属イオンに対して高い親和性（高い結合力）で結合し得る部分を有する化合物（目的とする化合物）が、特異的に吸着するようになる。

本発明では、前記 3価の金属イオンは、 F e ³ +であることが好ましい。これは、 F e ^{3 +}は、リン酸基との結合能（親和性）に極めて優れているからである。

また、前記 3価の金属イオンの結合量は、前記アパタイト 1 gに対して、 0 . 1 〜1 0 O m gであることが好ましい。これにより、目的とする化合物の特異的吸着能が好適に発揮される。

また、本発明の吸着剤は、リン酸基を有する化合物を吸着するのに適している。これは、リン酸基が 3価の金属イオンとの間に配位結合を形成（キレートを形成）するため、リン酸基を有する化合物は、特に強固に吸着剤に吸着されるからである _c この場合、前記化合物は、リン酸化タンパク質であることが好ましい。リン酸化タンパク質は、タンパク質自体がアパタイトへの吸着性が高いことから、極めて高い選択性をもつて吸着される。

また、本発明では、前記 Aは、フッ素元素であることが好ましい。これにより、アパタイト（吸着剤）の耐久性および耐溶剤性（特に耐酸性）をより向上させることができる。

また、本発明では、前記 Xは、 0 . 3〜1であることが好ましい。 Xが小さ過ぎると、ハロゲン元素 Xの種類等によっては、吸着剤の耐久性ゃ耐溶剤性を十分に向上させることができないおそれがあるからである。

本発明の他の態様は、カラムの吸着剤充填空間に、上述した吸着剤が充填されてなることを特徴とする吸着装置に関する。このような吸着装置によれば、 3価の金属イオンに対して高い親和性（高い結合力）で結合し得る部分を有する化合物（目的とする化合物）を、容易かつ確実に分離，精製すること、すなわち、高収率かつ高純度で回収することができる。

この場合、前記吸着剤が前記吸着剤充填空間にほぼ満量充填されていることが好ましい。このような構成により、目的とする化合物の分離 ·精製能をより向上させることができる。

また、前記吸着剤は、前記吸着剤充填空間の各部において、ほぼ同一の組成をなしていることが好ましい。これにより、目的とする化合物の分離 ·精製能が特に優れたものとなる。

また、前記吸着剤は、粒状をなしていることが好ましい。このように吸着剤を粒状とすることにより、その表面積を増大させることができ、目的とする化合物の吸着量をより増大させることができる。

また、粒状の前記吸着剤は、その平均粒径が 0 . 5〜1 0 0 mであることが好ましい。このような平均粒径の吸着剤を用いることにより、吸着装置がフィルタ部材を備える場合、フィルタ部材の目詰まりを確実に防止しつつ、吸着剤の表面積を十分に確保することができる。

本発明のさらに別の態様は、カラムの吸着剤充填空間に、 C _{a i Q} ( P〇₄ ) ₆ ( (OH) ! _ _x A_x ) ₂ [ただし、 Aはハロゲン元素を示し、 0≤χ≤1である] で表されるアパタイトを充填した状態で、前記吸着剤充填空間に、 3価の金属イオンを含む溶液を通液することにより、前記アパタイトが有するリン酸基に、 3 価の金属イオンを結合させることを特徴とする吸着装置の製造方法に関する。この吸着剤の製造方法によれば、容易かつ短時間で、吸着装置を製造することができる < この場合、前記 3価の金属ィォンを含む溶液 1 L中における前記 3価の金属ィォンの含有量は、前記アパタイト 1 m o 1に対して、 1〜5 O m o 1であることが好ましい。これにより、アパタイトが有するリン酸基に 3価の金属イオンを効率よく結合させることができる。

また、前記 3価の金属イオンを含む溶液の総通液量は、 l〜5 0 mLであることが好ましい。これにより、アパタイトが有するリン酸基に 3価の金属イオンを効率よく結合させることができる。

また、前記 3価の金属イオンを含む溶液の通液速度は、 0 . l〜1 0 mLZm i nであることが好ましい。これにより、アパタイトが有するリン酸基に 3価の金属イオンを効率よく結合させることができる。

上述したまたはそれ以外の本発明の目的、構成および効果は、図面を参照して行う以下の実施形態の説明からより明らかとなるであろう。図面の簡単な説明

図 1は、本発明の吸着装置の実施形態を示す縦断面図である。

図 2は、実施例 1において、ハイドロキシアパタイト粉末が有するリン酸基への

F e ³ +の結合の程度を確認する際に、分取した F e C 1 3溶液の各画分の F e濃度の変化を示すグラフである。

図 3は、実施例 1の吸着装置におけるォバルブミンの溶出パターンを示すグラフである。

図 4は、比較例の吸着装置におけるォバルブミンの溶出パターンを示すグラフである。 ' 発明を実施するための最良の形態

以下、本発明の吸着剤、吸着装置および吸着装置の製造方法の好適な実施形態について詳細に説明する。

図 1は、本発明の吸着剤を吸着装置に適用した場合の実施形態を示す縦断面図である。なお、以下の説明では、図 1中の上側を「流入側」、下側を「流出側」と言ラ。

ここで、流入側とは、目的とする化合物を分離，精製する際に、例えば試料、溶出液等の液体を、本発明の吸着装置に供給する側のことを言い、一方、流出側とは、前記流入側と反対側、すなわち、前記液体が本発明の吸着装置から流出する側のことを言う。

図 1に示す吸着装置 1は、カラム 2と、粒状の吸着剤 3と、 2枚のフィルタ部材 4、 5とを有している。

カラム 2は、カラム本体 2 1と、このカラム本体 2 1の流入側端部および流出側端部に、それぞれ装着されるキャップ（蓋体） 2 2、 2 3とで構成されている。

カラム本体 2 1は、例えば円筒状の部材で構成されている。カラム本体 2 1を含めカラム 2を構成する各部（各部材）の構成材料としては、例えば、各種ガラス材料、各種樹脂材料、各種金属材料、各種セラミックス材料等が挙げられる。

カラム本体 2 1には、その流入側開口および流出側開口を、それぞれ塞ぐようにフィル夕部材 4、 5を配置した状態で、その流入側端部および流出側端部に、それぞれキヤップ 2 2、 2 3が螺合により装着される。

このような構成のカラム 2では、カラム本体 2 1と各フィルタ部材 4、 5とにより、吸着剤充填空間 2 0が画成されている。そして、この吸着剤充填空間 2 0に吸着剤 3が充填されている。

また、カラム本体 2 1に各キャップ 2 2、 2 3を装着した状態で、これらの間の液密性が確保されるように構成されている。

各キャップ 2 2、 2 3のほぼ中央には、それぞれ、流入管 2 4および流出管 2 5 が液密に固着（固定）されている。この流入管 2 4およびフィルタ部材 4を介して吸着剤 3に、例えば試料、溶出液等の液体が供給される。また、吸着剤 3に供給された液体は、吸着剤 3同士の間（間隙）を通過して、フィルタ部材 5および流出管 2 5を介して、カラム 2外へ流出する。このとき、試料に含まれる各成分（化合物）は、吸着剤 3に対する吸着性の差異に基づいて相互に分離される。

各フィルタ部材 4、 5は、それぞれ、吸着剤充填空間 2 0から吸着剤 3が流出するのを防止する機能を有するものである。これらのフィル夕部材 4、 5は、それぞれ、例えば、ポリウレタン、ポリビニルアルコール、ポリプロピレン、ポリェ一テルポリアミド、ボリエチレンテレフ夕レート、ポリブチレンテレフ夕レート等の合成樹脂からなる不織布、発泡体（連通孔を有するスポンジ状多孔質体）、織布、メッシュ等、あるいは、ステンレス鋼のような金属材料からなるメッシュ等で構成されている。

さて、本発明では、吸着剤充填空間 2 0に充填された吸着剤 3の構成に特徴を有する。以下、この点（特徴）について詳述する。

本発明の充填剤 3は、その少なくとも表面付近が C a ₀ ( P〇₄ ) ₆ ( (〇 H) ！ _ _x A_x ) ₂ [ただし、 Aはハロゲン元素を示し、 0≤χ≤1である] で表されるアパタイトで構成され、このアパタイトが有するリン酸基に、 3価の金属ィオンが結合してなるものである。なお、 3価の金属イオンは、リン酸基に対して 1対 1で結合（イオン結合）していてもよく、複数のリン酸基に結合（配位結合）していてもよい。

このような構成により、 3価の金属イオンに対して高い親和性（高い結合力）で結合し得る部分を有する化合物が、特異的に吸着剤 3に吸着するようになる。

ここで、 3価の金属イオンに対して特異的に吸着（結合）する化合物としては、リン酸基を有するものが挙げられる。このものは、リン酸基が 3価の金属イオンとの間に配位結合を形成（キレートを形成）する。この結合は、通常の吸着（電気的な結合）より強固なものとなるため、本発明の吸着剤 3を用いることにより、吸着装置 1は、前記化合物を確実に吸着させ、他の化合物と相互に分離して、精製すること（単離すること）ができる。

また、リン酸基を有する化合物には、各種のものがあるが、特に、リン酸化タンパク質は、タンパク質自体がアパタイトへの吸着性が高いことから、極めて高い選択性をもって、本発明の吸着剤 3に吸着される。

3価の金属イオンとしては、例えば、 Fe^{3 +} 、 S c^{3 +} 、 Y^{3 +} 、 La^{3 +} 、 Ce^{3 +} 、 P r^{3 +} 、 Nd^{3 +} 、 Pm^{3 +} 、 Sm^{3 +} 、 Eu^{3 +} 、 Gd^{3 +} 、 T b^{3 +} 、 Dy^{3 +} 、 Ho^{3 +} 、 E r^{3 +} 、 Tm³ +、 Yb^{3 +} 、 Lu^{3 +} 、 Ac ³ +、 Pu³ +、 Am³ +、 Cm^{3 +} 、 Bk^{3 +} 、 C f ^{3 +} 、 C r^{3 +} 、 Rh³ +、 A l ^{3 +} 、 Ga^{3 +} 、 I n^{3 +} 、 T l ^{3 +} 、 Sb^{3 +} 、 B i ^{3 +}等が挙げられ、これらのうちの 1種または 2種以上を組み合わせて用いることができる。これらの 3価の金属イオンは、いずれも、安定して存在し得ることから好ましい。

これらの中でも、 3価の金属イオンとしては、特に、 Fe^{3 +}が好適である。 F e³ +は、リン酸基との結合能（親和性）に極めて優れる。このため、 3価の金属イオンとして Fe^{3 +} を用いることにより、吸着剤 3は、その吸着能が長期に亘って維持（保持）されるとともに、リン酸基を有する化合物（特に、リン酸ィ匕タンパク質）の特異的吸着能が極めて高いものとなる。

このような 3価の金属ィオンは、前述したような化合物の特異的吸着能が好適に発揮される程度に、前記アパタイトに結合していればよく、その結合量は、特に限定されないが、ァパタイト 1 gに対して、 0.1〜10 Omg程度であるのが好ましく、 0. 5〜25mg程度であるのがより好ましい。また、前記組成式で表されるアパタイトは、水酸基が無置換のものであってもよいが、その少なくとも一部が八ロゲン基ひ、ロゲン元素 A) で置換されているのが好ましい。これにより、アパタイトを構成する各元素（イオン）の間の結合力が増大し、アパタイト（吸着剤 3 ) の耐久性および耐溶剤性（特に耐酸性）を向上させることができる。

前記ハロゲン元素 Aは、 F (フッ素元素）が好適である。フッ化物イオンは、他のハロゲン化物イオンと比較して、電気陰性度が高いため、水酸基の少なくとも一部をフルォロ基で置換することにより、前記効果をより向上させることができる。前記組成式中の x、すなわち、ハロゲン元素 Aの置換率も、できるだけ大きい方が好ましく、特に限定されるものではないが、 0 . 3〜1程度であるのが好ましく、 0 . 5〜1程度であるのがより好ましい。前記 Xが小さ過ぎると、ハロゲン元素 A の種類等によっては、吸着剤 3の耐久性ゃ耐溶剤性を十分に向上させることができないおそれがある。

以上のような吸着剤 3の形態（形状）は、図 1に示すように、粒状（顆粒状）のものであるのが好ましいが、その他、例えばペレット状（小塊状）、ブロック状 (例えば、隣接する空孔同士が互いに連通する多孔質体、八二カム形状）等とすることもできる。吸着剤 3を粒状とすることにより、その表面積を増大させることができ、前述した化合物の吸着量をより増大させることができる。

粒状の吸着剤 3の平均粒径は、特に限定されないが、 0 . 5〜1 0 0 m程度であるのが好ましく、 1 0〜4 0 x m程度であるのがより好ましい。このような平均粒径の吸着剤 3を用いることにより、前記フィル夕部材 5の目詰まりを確実に防止しつつ、吸着剤 3の表面積を十分に確保することができる。

なお、吸着剤 3は、その全体が前記組成式で表されるアパタイトで構成されたものであってもよく、その表面付近のみが前記組成式で表されるァパタイトで構成されたものであってもよい。

また、本発明の吸着装置 1では、カラム 2の吸着剤充填空間 2 0の一部にのみ吸着剤 3が充填されているものであってもよいが、図 1に示すように、吸着剤充填空間 2 0に吸着剤 3がほぼ満量充填されているのが好ましい。このような構成により、例えば、吸着剤充填空間 2 0の一部にのみ吸着剤 3を充填し、残りの部分にハイド口キシァパタイトで構成される吸着剤を充填した構成の吸着装置等と比較して、前述した化合物の分離 ·精製能をより向上させることができる。

さらに、吸着剤 3は、吸着剤充填空間 2 0の各部において、ほぼ同一の組成をなしているのが好ましい。これにより、吸着装置 1は、前述した化合物の分離 ·精製能が特に優れたものとなる。

このような吸着装置 1は、例えばカラム 2の吸着剤充填空間 2 0に、 0 (P 0₄ ) ₆ ( (OH) _x _ _x A_x ) ₂ [ただし、 Aはハロゲン元素を示し、 0≤ x≤lである] で表されるアパタイト粉体を充填した状態で、吸着剤充填空間 2 0 に、 3価の金属イオンを含む溶液を通液する方法により製造することができる。

かかる方法によれば、容易かつ短時間で、吸着剤 3を得て、吸着装置 1を製造することができる。

また、本発明の吸着装置 1では、前述したように、吸着剤 3は、そのほぼ全てが同一の構成（特に、吸着剤充填空間 2 0の各部において、ほぼ同一の組成）とされているのが好ましいが、前記の方法を用いることにより、吸着剤 3の構成（組成）にバラツキが生じるのを防止することができるという利点もある。

この方法において、前記溶液 1 L中における 3価の金属イオンの含有量（濃度）は、吸着剤充填空間 2 0に充填されたァパタイト粉体 1 m o 1に対して、 1〜5 O m o 1程度であるのが好ましく、 5〜3 0 m o 1程度であるのがより好ましい。含有量が少な過ぎると、用いる溶液量が増大すること等により、アパタイト粉体に 3価の金属イオンを結合させるのに要する時間が必要以上に長くなるおそれがあり、一方、含有量を前記上限値を超えて多くしても、それ以上の 3価の金属イオンの吸着量の増大が期待できない。

前記溶液の総通液量は、特に限定されないが、 3価の金属イオンの含有量を前記範囲とする場合、 1〜5 O mL程度であるのが好ましく、 5〜3 0 mL程度であるのがより好ましい。総通液量が少な過ぎると、 3価の金属イオンの含有量等によつては、ァパタイト粉体への 3価の金属イオンの吸着が十分に行われない場合があり、一方、総通液量を前記上限値を超えて多くしても、アパタイト粉体に 3価の金属ィオンを結合させるのに要する時間が必要以上に長くなるだけで、それに見合った吸着量の増大は見込めない。また、前記溶液の通液速度は、 0 . 1〜1 O mLZm i n程度であるのが好ましく、 l〜5 mLZm i n程度であるのがより好ましい。通液速度が遅過ぎると、ァパタイト粉体に 3価の金属イオンを結合させるのに要する時間が必要以上に長くなり、一方、通液速度が速過ぎると、 3価の金属イオンの含有量等によっては、ァパタイト粉体への 3価の金属イオンの吸着が十分に行われない場合がある。

このような方法によれば、前記溶液の条件（イオンの含有量、総通液量、通液速度）を適宜設定することにより、アパタイト粉体への 3価の金属イオンの結合量を、所望のものにコントロールすることができる。

また、この方法において、前記溶液の通液方向は、任意である。すなわち、例えば、前記溶液を、連続的または間欠的に、流入側から流出側に向う一方向にのみ吸着剤充填空間 2 0に通液することができ、また、所定量の前記溶液を流入側から流出側に向かって吸着剤充填空間 2 0に通液した後、通液方向を変更し、所定量の前記溶液を吸着剤充填空間 2 0に通液することができる。また、後者の場合、このような通液操作を、複数回繰り返し行ってもよい。

なお、前記溶液としては、 3価の金属イオンを含むものであれば、いかなるものを用いてもよいが、例えば、フッ化物、塩化物、臭化物、ヨウ化物のようなハロゲン化物、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩、水酸化物等の溶液を用いることができる。

次に、本発明の吸着装置の使用方法の一例について、リン酸化タンパク質を分離 ·精製する場合を代表に説明する。

まず、試料として、リン酸ィ匕タンパク質およびリン酸化されていないタンパク質の複数種のタンパク質を緩衝液に溶解した溶液を用意する。そして、この試料を、流入管 2 4およびフィルタ部材 4を介して吸着剤 3に供給して、カラム 2内を通過させる。これにより、吸着剤 3に吸着しない成分（リン酸化されていないタンパク質）は、フィルタ 5および流出管 2 5を介してカラム 2内から流出し、吸着剤 3に選択的に吸着した成分（リン酸化タンパク質）は、カラム 2内に保持される。

ここで、緩衝液には、例えば、 .リン酸緩衝液、 T r i s -H C 1緩衝液、 G o o d b u f f e r等を用いることができる。

次に、流入管 2 4からカラム 2内へ溶出液を供給し、カラム 2の流出管 2 5から流出する溶出液を採取する。この溶出液には、吸着剤 3に吸着したリン酸化夕ンパク質よりも吸着剤 3に対する吸着能が高い物質（競合試薬）、キレート剤等を含有する緩衝液、前記緩衝液より塩濃度の高い緩衝液、前記緩衝液より pHの低い（pH5.5〜10程度）の緩衝液等を用いることができる。また、溶出液は、溶質の濃度を経時的に変化させつつカラム 2内へ供給（吸着剤充填空間 20に通液）するようにしてもよい。

吸着剤 3に溶出液が接触すると、吸着剤 3に選択的に吸着したリン酸化夕ンパク質は、吸着剤 3から離脱して、溶出液中に混入する。

以上、本発明の吸着剤、吸着装置および吸着装置の製造方法について説明したが、本発明はこれに限定されるものではない。実施例

次に、本発明の具体的実施例について説明する。

1. 吸着装置の製造

以下に示す実施例 1、 2および比較例の吸着装置をそれぞれ 5個ずつ製造した。

(実施例 1 )

公知の湿式合成法によりハイドロキシァパタイトを合成し、ハイドロキシァパタィトスラリーを得た。

このハイドロキシァパタイトスラリ一を噴霧乾燥して、平均粒径 40 xmの粉体を得た。その後、この粉体を、大気中、 700°CX4時間で焼成した。

このハイドロキシアパタイト粉体を、 1 OmMリン酸緩衝液に懸濁させ、カラム (内径 4mmX長さ 10 Omm) の吸着剤充填空間に充填した。なお、 2枚のフィル夕部材として、開口径（平均） 2 mのステンレスメッシュを用いた。

また、吸着剤充填空間に充填されたハイドロキシアパタイト粉体の量は、 0. 7 g (約 0. 7mmo l) であった。

次に、カラム内に流入管から 1 OmMの F e C 13溶液を流速 ImL/m i nで 10分間供給し、ハイドロキシァパタイト粉体が有するリン酸基に Fe ³ + を結合させた。これにより、吸着剤を得て、吸着装置を製造した。

ここで、ハイドロキシァパタイト粉末が有するリン酸基への F e ³ +の結合の程度は、次のようにして確認した。すなわち、前記ハイドロキシアパタイト粉体が有するリン酸基に Fe ³ + を結合させる工程において、流出管から流出する FeC 13溶液を 1分毎に分取し、各画分の Fe濃度を測定した。

次に、カラム内に流入管から、洗浄液として、 1 OmMリン酸緩衝液を供給して吸着剤を洗浄して、カラム内から Feの溶出がなくなつたことを確認した後、再度、 1 OmMの F e C 1₃溶液を、流速 lmLZm i nで 10分間供給し、流出管から流出する F e C 13溶液を 1分毎に分取し、各画分の F e濃度を測定した。

なお、この Fe濃度の測定は、原子吸光装置（島津製作所社製、「AA—620 0」）を用いて原子吸光法により行なった。

以上 2回の F e C 13 溶液の通液操作で、分取した F e C 1 a溶液における各画分の Fe濃度の測定結果を、それぞれ図 2に示す。なお、図 2には、カラム内から流出した洗浄液中の F e濃度の測定結果も併せて示した。

図 2に示すように、 1回目より 2回目の F e C 1₃溶液の通液操作において、力ラムから流出する FeC 1₃溶液中の Fe濃度が高くなつている。これは、 1回目の F e C 1₃溶液の通液操作で F e ³ +がハイドロキシァパタイト粉体が有するリン酸基に結合し、 2回目の F e C 13溶液の通液操作において F e ³ +が結合し得るリン酸基の数が減少していることが原因であると推察される。

この結果は、 F e C 1₃溶液の通液操作により、ハイドロキシァパタイト粉体の表面のリン酸基に、容易に Fe³ +が結合し得ることを示唆するものである。

また、原子吸光装置（島津製作所社製、「AA— 6200」）を用いて、粉体の F e量を測定した結果、吸着剤 l gあたり 2. 9mgの Fe^{3 +}が結合していることが確認された。

(実施例 2 )

公知の湿式合成法によりフッ素アパタイト（C_{a i} 。（P〇₄ ) ₆ ( (OH) o . ₇ F。 . ₃ ) ₂ ) を合成し、フッ素アパタイトスラリーを得た。

このフッ素ァパタイトスラリーを噴霧乾燥して、平均粒径 40 mの粉体を得た。その後、この粉体を、大気中、 700^X4時間で焼成した。

このフッ素アパタイト粉体 1 g (約 lmmo l) を用いて、前記実施例 1と同様にして、吸着装置を製造した。なお、前記実施例 1で示した元素分析法により、 Fe量を測定した結果、吸着剤 l gあたり 2.9mgの Fe³ +が結合していることが確認された。

(比較例）

FeC 13 溶液の通液操作を省略した以外は、前記実施例 1と同様にして、吸着装置を製造した。

2. 評価

2-1. リン酸化夕ンパク質の吸着特性

以下に示すようにして、実施例 2および比較例で製造した吸着装置について、それぞれ、リン酸化タンパク質の吸着特性を調べた。

まず、吸着装置のカラム内の液体を、 10mMリン酸緩衝液 (pH6. 8) に置き換えた。

次に、リン酸化されていないォバルブミン（非リン酸化ォバルブミン）、リン酸基を 1つまたは 2つ有するォバルブミン（リン酸化ォバルブミン）を、それぞれ、 5 OmgZmLとなるように、前記と同様のリン酸緩衝液に溶解した試料 2 mLをカラム内に供給して、カラム内を通過させた。

次に、 1 OmMから 30 OmMまで 15分でリン酸緩衝液のグラジェントをかけ、リン酸緩衝液の濃度を上げていった。なお、リン酸緩衝液の流速（f 1 ow r a t e) は、 lmLZmi nとした。そして、 2種類のォバルブミンが、カラム内からそれぞれ溶出を開始する時間（r e t en s i on t ime) を 280 nmの UVモニターで測定（確認）した。

その結果を表 1に示す。なお、表 1中の数値は、実施例 2および比較例において、それぞれ、 5個の吸着装置における平均値である。

表 1

表 1に示すように、実施例 2の吸着装置は、比較例の吸着装置に比べて、リン酸化されていないォバルブミン（非リン酸化ォバルブミン）の溶出開始時間が明らかに速いものであった。

すなわち、実施例 2の吸着装置では、比較例の吸着装置に比べて、リン酸化されたォバルブミン（リン酸化ォバルブミン）とリン酸化されていないォバルブミン

(非リン酸化ォバルブミン）との分離度の向上が図られた。

また、実施例 2の吸着装置から回収されたリン酸緩衝液中には、 Fe³ +の溶出は、ほとんど認められなかった。

2-2. リン酸化タンパク質の分離特性

以下に示すようにして、実施例 1および比較例で製造した吸着装置について、それぞれ、リン酸化タンパク質の分離特性を調べた。

実施例 1および比較例の吸着装置を、それぞれ高速液体クロマトグラフィー（B i o— Rad社製、「Duo— : f l ow」）に取り付け、カラム内の液体を ImM Tr i s— HC 1緩衝液（pH7. 8) に置き換えた。

次に、ォバルブミン（s i gma社製）を 5mg/mLとなるように、前記 T r i s— HC 1緩衝液に溶解して試料溶液を調製した。なお、このォバルブミンは、リン酸化されたものとリン酸化されていないものとの混合物である。

次に、この試料溶液 50 xLを、高速液体クロマトグラフィーに注入した。溶出液は、前記 Tr i s -HC 1緩衝液と 10 mMのリン酸ナトリウム緩衝液との混合比が、 15分間で 100 ： 0~0 ： 100となるように経時的に変化させた。なお、溶出液の流速は 1 m 1 Z分とした。そして、カラム内から流出する溶出液中へのォバルブミンの溶出パターンを調べた。

図 3には、実施例 1の吸着装置におけるォバルブミンの溶出パターンを、図 4には、比較例の吸着装置におけるォバルブミンの溶出パターンを、それぞれ示す。図 3に示すように、実施例 1の吸着装置では、リン酸化されたォバルブミン（リン酸化ォバルブミン）に対する特異的な吸着が生じ、リン酸化されていないォバルブミン（非リン酸化ォバルブミン）は、早期にカラム内から溶出された。

これに対して、図 4に示すように、比較例の吸着装置では、リン酸基を有するォバルブミンと有さないォバルブミンとの明確な分離が得られず、リン酸基の有無にかかわらず、ォバルブミンを非特異的に吸着した。

なお、実施例 2の吸着装置を用いた場合も、前記実施例 1の溶出パターンと同様の溶出パターンであった。

以上のように、各実施例（本発明）の吸着装置は、リン酸化されたォバルブミン

(リン酸化タンパク質）に対する特異的吸着能に優れるため、リン酸化タンパク質の分離 ·精製に好適に使用することができる。産業上の利用可能性

以上述べたように、本発明によれば、 3価の金属イオンをアパタイトが有するリン酸基に結合させたことにより、 3価の金属イオンに対して親和性を有する化合物 (目的とする化合物）を、高収率かつ高純度で回収することができる。

また、 3価の金属イオンの種類を適宜選択することにより、分離 ·精製を目的とする化合物の種類を選択することができる。例えば、 3価のイオンとして、 F e ³ + を選択することにより、例えばリン酸化タンパク質等のリン酸基を有する化合物に対する特異的吸着能を向上させることができる。

なお、本件出願は、日本国特許願 2 0 0 3— 1 6 4 3 3 6に基づくものであり、当該出願の番号を明記することにより、その開示内容全体が本件出願に組み込まれたものとする。

Claims

請求の範囲

1. 少なくとも表面付近が。（P0₄ ) ₆ ( (OH) ！ _ _x A_x ) ₂ [ただし、 Aはハロゲン元素を示し、 0≤χ≤1である] で表されるアパタイトで構成され、前記アパタイトが有するリン酸基に、 3価の金属イオンが結合してなることを特徴とする吸着剤。

2. 前記 3価の金属イオンは、 Fe³ +である請求の範囲第 1項に記載の吸着剤。

3. 前記 3価の金属イオンの結合量は、前記アパタイト 1 gに対して、 0. 1〜1 0 Omgである請求の範囲第 1項または第 2項に記載の吸着剤。

4. リン酸基を有する化合物を吸着する請求の範囲第 1項ないし第 3項のいずれかに記載の吸着剤。

5. 前記化合物は、リン酸化タンパク質である請求の範囲第 4項に記載の吸着剤。

6. 前記 Aは、フッ素元素である請求の範囲第 1項ないし第 5項のいずれかに記載の吸着剤。

7. 前記 Xは、 0. 3〜1である請求の範囲第 1項ないし第 6項のいずれかに記載の吸着剤。

8. カラムの吸着剤充填空間に、請求の範囲第 1項ないし第 7項のいずれかに記載の吸着剤が充填されてなることを特徴とする吸着装置。

9. 前記吸着剤は、前記吸着剤充填空間に、ほぼ満量充填されている請求の範囲第 8項に記載の吸着装置。

10. 前記吸着剤は、前記吸着剤充填空間の各部において、ほぼ同一の組成をなしている請求の範囲第 8項または第 9項に記載の吸着装置。

11. 前記吸着剤は、粒状をなしている請求の範囲第 8項ないし第 10項のいずれかに記載の吸着装置。

12. 粒状の前記吸着剤は、その平均粒径が 0. 5〜 100 mである請求の範囲第 11項に記載の吸着装置。

13. カラムの吸着剤充填空間に、 C ₁ 。（P0₄ ) ₆ ( (OH) ！ _ _x A_x ) ₂ [ただし、 Aはハロゲン元素を示し、 0≤χ≤1である] で表されるアパタイトを充填した状態で、前記吸着剤充填空間に、 3価の金属イオンを含む溶液を通液することにより、前記アパタイトが有するリン酸基に、 3価の金属イオンを結合させることを特徴とする吸着装置の製造方法。

14. 前記 3価の金属イオンを含む溶液 1 L中における前記 3価の金属イオンの含有量は、前記アパタイト lmo 1に対して、 1〜5 Omo 1である請求の範囲第 1

3項に記載の吸着装置の製造方法。

15. 前記 3価の金属イオンを含む溶液の総通液量は、 l〜50mLである請求の範囲第 13項または第 14項に記載の吸着装置の製造方法。

16. 前記 3価の金属イオンを含む溶液の通液速度は、 0. l〜10mLZmi n である請求の範囲第 13項ないし第 15項のいずれかに記載の吸着装置の製造方法 _c