JP4870429B2

JP4870429B2 - 吸着剤、吸着装置および吸着装置の製造方法

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Publication number: JP4870429B2
Application number: JP2005506861A
Authority: JP
Inventors: 伸太郎小林; 典生奥山
Original assignee: Hoya Corp
Current assignee: Hoya Corp
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Filing date: 2004-06-09
Publication date: 2012-02-08
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Description

【技術分野】
【０００１】
本発明は、吸着剤、吸着装置および吸着装置の製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質研究の分野においては、タンパク質の構造や機能を解析する手法として、ｃＤＮＡを用いてタンパク質を多量に発現させ、得られたリコンビナントタンパク質を分離・精製することが行われている。
【０００３】
また、遺伝子によって翻訳されたタンパク質はリン酸化、糖鎖の付加のように種々の修飾を受け、その機能が調節される。この翻訳後の修飾は、細胞内情報伝達、細胞周期の調節、代謝調節等に関与しており、細胞調節機構として重要である。このようなタンパク質の調節機構を研究するため、未修飾のタンパク質と修飾されたタンパク質とを分離・精製する手法の開発が求められている。
【０００４】
ここで、ハイドロキシアパタイトは、生体親和性に優れることから、従来から、タンパク質等を吸着・分離する液体クロマトグラフィー用カラム（吸着装置）に使用する吸着剤として広く利用されている（例えば、特開平９−１７５８０５号公報参照）。
【０００５】
ところが、ハイドロキシアパタイト製の吸着剤は、各種タンパク質を非特異的に吸着してしまい、特定のタンパク質を選択的に吸着させることが困難であるという問題があり、前述したような未修飾のタンパク質と修飾されたタンパク質とを分離・精製する目的での使用には適さない。
【発明の開示】
本発明は、上記問題点に鑑みなされたもので、その目的は、目的とする化合物を特異的に吸着し得る吸着剤、目的とする化合物を、容易かつ確実に分離・精製することができる吸着装置、および、かかる吸着装置を容易かつ短時間で製造することができる吸着装置の製造方法を提供することにある。
【０００６】
上記目的を達成するために、本発明は、リン酸基を有するリン酸化タンパク質を吸着し、少なくとも表面がＣａ_１０（ＰＯ_４）_６（（ＯＨ）_１−ｘＡ_ｘ）_２［ただし、Ａはハロゲン元素を示し、０．３≦ｘ≦１である］で表されるアパタイトで構成され、前記アパタイトが有するリン酸基に、前記アパタイト１ｇに対して、０．１〜１００ｍｇのＦｅ ^３＋が３価の金属イオンとして結合してなることを特徴とする吸着剤に関する。
【０００７】
このような構成により、３価の金属イオンに対して高い親和性（高い結合力）で結合し得る部分を有するリン酸化タンパク質が、特異的に吸着するようになる。
また、前記３価の金属イオンの結合量は、前記アパタイト１ｇに対して、０．１〜１００ｍｇであることにより、リン酸化タンパク質の特異的吸着能が好適に発揮される。
また、Ｆｅ ^３＋は、リン酸基との結合能（親和性）に極めて優れていることから、前記３価の金属イオンとして用いられる。
【００１４】
本発明の他の態様は、カラムの吸着剤充填空間に、上述した吸着剤が充填されてなることを特徴とする吸着装置に関する。このような吸着装置によれば、３価の金属イオンに対して高い親和性（高い結合力）で結合し得る部分を有する化合物（目的とする化合物）を、容易かつ確実に分離・精製すること、すなわち、高収率かつ高純度で回収することができる。
【００１９】
本発明のさらに別の態様は、リン酸基を有するリン酸化タンパク質を吸着する吸着剤が、カラムの吸着剤充填空間に充填された吸着装置の製造方法であって、前記カラムの吸着剤充填空間に、Ｃａ_１０（ＰＯ_４）_６（（ＯＨ）_１−ｘＡ_ｘ）_２［ただし、Ａはハロゲン元素を示し、０．３≦ｘ≦１である］で表されるアパタイトを充填した状態で、前記吸着剤充填空間に、Ｆｅ ^３＋を３価の金属イオンとして含む溶液を通液することにより、前記アパタイトが有するリン酸基に、前記アパタイト１ｇに対して、０．１〜１００ｍｇのＦｅ ^３＋を結合させることを特徴とする吸着装置の製造方法に関する。この吸着剤の製造方法によれば、容易かつ短時間で、吸着装置を製造することができる。
【００２０】
この場合、前記３価の金属イオンを含む溶液１Ｌ中における前記３価の金属イオンの含有量は、前記アパタイト１ｍｏｌに対して、１〜５０ｍｏｌであることが好ましい。これにより、アパタイトが有するリン酸基に３価の金属イオンを効率よく結合させることができる。
【００２１】
また、前記３価の金属イオンを含む溶液の総通液量は、１〜５０ｍＬであることが好ましい。これにより、アパタイトが有するリン酸基に３価の金属イオンを効率よく結合させることができる。
【００２２】
また、前記３価の金属イオンを含む溶液の通液速度は、０．１〜１０ｍＬ／ｍｉｎであることが好ましい。これにより、アパタイトが有するリン酸基に３価の金属イオンを効率よく結合させることができる。
【００２３】
上述したまたはそれ以外の本発明の目的、構成および効果は、図面を参照して行う以下の実施形態の説明からより明らかとなるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
図１は、本発明の吸着装置の実施形態を示す縦断面図である。
図２は、実施例１において、ハイドロキシアパタイト粉末が有するリン酸基へのＦｅ^３＋の結合の程度を確認する際に、分取したＦｅＣｌ_３溶液の各画分のＦｅ濃度の変化を示すグラフである。
図３は、実施例１の吸着装置におけるオバルブミンの溶出パターンを示すグラフである。
図４は、比較例の吸着装置におけるオバルブミンの溶出パターンを示すグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
以下、本発明の吸着剤、吸着装置および吸着装置の製造方法の好適な実施形態について詳細に説明する。
【００２６】
図１は、本発明の吸着剤を吸着装置に適用した場合の実施形態を示す縦断面図である。
なお、以下の説明では、図１中の上側を「流入側」、下側を「流出側」と言う。
【００２７】
ここで、流入側とは、目的とする化合物を分離・精製する際に、例えば試料、溶出液等の液体を、本発明の吸着装置に供給する側のことを言い、一方、流出側とは、前記流入側と反対側、すなわち、前記液体が本発明の吸着装置から流出する側のことを言う。
【００２８】
図１に示す吸着装置１は、カラム２と、粒状の吸着剤３と、２枚のフィルタ部材４、５とを有している。
【００２９】
カラム２は、カラム本体２１と、このカラム本体２１の流入側端部および流出側端部に、それぞれ装着されるキャップ（蓋体）２２、２３とで構成されている。
【００３０】
カラム本体２１は、例えば円筒状の部材で構成されている。カラム本体２１を含めカラム２を構成する各部（各部材）の構成材料としては、例えば、各種ガラス材料、各種樹脂材料、各種金属材料、各種セラミックス材料等が挙げられる。
【００３１】
カラム本体２１には、その流入側開口および流出側開口を、それぞれ塞ぐようにフィルタ部材４、５を配置した状態で、その流入側端部および流出側端部に、それぞれキャップ２２、２３が螺合により装着される。
【００３２】
このような構成のカラム２では、カラム本体２１と各フィルタ部材４、５とにより、吸着剤充填空間２０が画成されている。そして、この吸着剤充填空間２０に吸着剤３が充填されている。
【００３３】
また、カラム本体２１に各キャップ２２、２３を装着した状態で、これらの間の液密性が確保されるように構成されている。
【００３４】
各キャップ２２、２３のほぼ中央には、それぞれ、流入管２４および流出管２５が液密に固着（固定）されている。この流入管２４およびフィルタ部材４を介して吸着剤３に、例えば試料、溶出液等の液体が供給される。また、吸着剤３に供給された液体は、吸着剤３同士の間（間隙）を通過して、フィルタ部材５および流出管２５を介して、カラム２外へ流出する。このとき、試料に含まれる各成分（化合物）は、吸着剤３に対する吸着性の差異に基づいて相互に分離される。
【００３５】
各フィルタ部材４、５は、それぞれ、吸着剤充填空間２０から吸着剤３が流出するのを防止する機能を有するものである。これらのフィルタ部材４、５は、それぞれ、例えば、ポリウレタン、ポリビニルアルコール、ポリプロピレン、ポリエーテルポリアミド、ポリエチレンテレフタレート、ポリブチレンテレフタレート等の合成樹脂からなる不織布、発泡体（連通孔を有するスポンジ状多孔質体）、織布、メッシュ等、あるいは、ステンレス鋼のような金属材料からなるメッシュ等で構成されている。
【００３６】
さて、本発明では、吸着剤充填空間２０に充填された吸着剤３の構成に特徴を有する。
以下、この点（特徴）について詳述する。
【００３７】
本発明の充填剤３は、その少なくとも表面付近がＣａ_１０（ＰＯ_４）_６（（ＯＨ）_１−ｘＡ_ｘ）_２［ただし、Ａはハロゲン元素を示し、０≦ｘ≦１である］で表されるアパタイトで構成され、このアパタイトが有するリン酸基に、３価の金属イオンが結合してなるものである。
【００３８】
なお、３価の金属イオンは、リン酸基に対して１対１で結合（イオン結合）していてもよく、複数のリン酸基に結合（配位結合）していてもよい。
【００３９】
このような構成により、３価の金属イオンに対して高い親和性（高い結合力）で結合し得る部分を有する化合物が、特異的に吸着剤３に吸着するようになる。
【００４０】
ここで、３価の金属イオンに対して特異的に吸着（結合）する化合物としては、リン酸基を有するものが挙げられる。このものは、リン酸基が３価の金属イオンとの間に配位結合を形成（キレートを形成）する。この結合は、通常の吸着（電気的な結合）より強固なものとなるため、本発明の吸着剤３を用いることにより、吸着装置１は、前記化合物を確実に吸着させ、他の化合物と相互に分離して、精製すること（単離すること）ができる。
【００４１】
また、リン酸基を有する化合物には、各種のものがあるが、特に、リン酸化タンパク質は、タンパク質自体がアパタイトへの吸着性が高いことから、極めて高い選択性をもって、本発明の吸着剤３に吸着される。
【００４２】
３価の金属イオンとしては、例えば、Ｆｅ^３＋、Ｓｃ^３＋、Ｙ^３＋、Ｌａ^３＋、Ｃｅ^３＋、Ｐｒ^３＋、Ｎｄ^３＋、Ｐｍ^３＋、Ｓｍ^３＋、Ｅｕ^３＋、Ｇｄ^３＋、Ｔｂ^３＋、Ｄｙ^３＋、Ｈｏ^３＋、Ｅｒ^３＋、Ｔｍ^３＋、Ｙｂ^３＋、Ｌｕ^３＋、Ａｃ^３＋、Ｐｕ^３＋、Ａｍ^３＋、Ｃｍ^３＋、Ｂｋ^３＋、Ｃｆ^３＋、Ｃｒ^３＋、Ｒｈ^３＋、Ａｌ^３＋、Ｇａ^３＋、Ｉｎ^３＋、Ｔｌ^３＋、Ｓｂ^３＋、Ｂｉ^３＋等が挙げられ、これらのうちの１種または２種以上を組み合わせて用いることができる。これらの３価の金属イオンは、いずれも、安定して存在し得ることから好ましい。
【００４３】
これらの中でも、３価の金属イオンとしては、特に、Ｆｅ^３＋が好適である。Ｆｅ^３＋は、リン酸基との結合能（親和性）に極めて優れる。このため、３価の金属イオンとしてＦｅ^３＋を用いることにより、吸着剤３は、その吸着能が長期に亘って維持（保持）されるとともに、リン酸基を有する化合物（特に、リン酸化タンパク質）の特異的吸着能が極めて高いものとなる。
【００４４】
このような３価の金属イオンは、前述したような化合物の特異的吸着能が好適に発揮される程度に、前記アパタイトに結合していればよく、その結合量は、特に限定されないが、アパタイト１ｇに対して、０．１〜１００ｍｇ程度であるのが好ましく、０．５〜２５ｍｇ程度であるのがより好ましい。
【００４５】
また、前記組成式で表されるアパタイトは、水酸基が無置換のものであってもよいが、その少なくとも一部がハロゲン基（ハロゲン元素Ａ）で置換されているのが好ましい。これにより、アパタイトを構成する各元素（イオン）の間の結合力が増大し、アパタイト（吸着剤３）の耐久性および耐溶剤性（特に耐酸性）を向上させることができる。
【００４６】
前記ハロゲン元素Ａは、Ｆ（フッ素元素）が好適である。フッ化物イオンは、他のハロゲン化物イオンと比較して、電気陰性度が高いため、水酸基の少なくとも一部をフルオロ基で置換することにより、前記効果をより向上させることができる。
【００４７】
前記組成式中のｘ、すなわち、ハロゲン元素Ａの置換率も、できるだけ大きい方が好ましく、特に限定されるものではないが、０．３〜１程度であるのが好ましく、０．５〜１程度であるのがより好ましい。前記ｘが小さ過ぎると、ハロゲン元素Ａの種類等によっては、吸着剤３の耐久性や耐溶剤性を十分に向上させることができないおそれがある。
【００４８】
以上のような吸着剤３の形態（形状）は、図１に示すように、粒状（顆粒状）のものであるのが好ましいが、その他、例えばペレット状（小塊状）、ブロック状（例えば、隣接する空孔同士が互いに連通する多孔質体、ハニカム形状）等とすることもできる。吸着剤３を粒状とすることにより、その表面積を増大させることができ、前述した化合物の吸着量をより増大させることができる。
【００４９】
粒状の吸着剤３の平均粒径は、特に限定されないが、０．５〜１００μｍ程度であるのが好ましく、１０〜４０μｍ程度であるのがより好ましい。このような平均粒径の吸着剤３を用いることにより、前記フィルタ部材５の目詰まりを確実に防止しつつ、吸着剤３の表面積を十分に確保することができる。
【００５０】
なお、吸着剤３は、その全体が前記組成式で表されるアパタイトで構成されたものであってもよく、その表面付近のみが前記組成式で表されるアパタイトで構成されたものであってもよい。
【００５１】
また、本発明の吸着装置１では、カラム２の吸着剤充填空間２０の一部にのみ吸着剤３が充填されているものであってもよいが、図１に示すように、吸着剤充填空間２０に吸着剤３がほぼ満量充填されているのが好ましい。このような構成により、例えば、吸着剤充填空間２０の一部にのみ吸着剤３を充填し、残りの部分にハイドロキシアパタイトで構成される吸着剤を充填した構成の吸着装置等と比較して、前述した化合物の分離・精製能をより向上させることができる。
【００５２】
さらに、吸着剤３は、吸着剤充填空間２０の各部において、ほぼ同一の組成をなしているのが好ましい。これにより、吸着装置１は、前述した化合物の分離・精製能が特に優れたものとなる。
【００５３】
このような吸着装置１は、例えばカラム２の吸着剤充填空間２０に、Ｃａ_１０（ＰＯ_４）_６（（ＯＨ）_１−ｘＡ_ｘ）_２［ただし、Ａはハロゲン元素を示し、０≦ｘ≦１である］で表されるアパタイト粉体を充填した状態で、吸着剤充填空間２０に、３価の金属イオンを含む溶液を通液する方法により製造することができる。
【００５４】
かかる方法によれば、容易かつ短時間で、吸着剤３を得て、吸着装置１を製造することができる。
【００５５】
また、本発明の吸着装置１では、前述したように、吸着剤３は、そのほぼ全てが同一の構成（特に、吸着剤充填空間２０の各部において、ほぼ同一の組成）とされているのが好ましいが、前記の方法を用いることにより、吸着剤３の構成（組成）にバラツキが生じるのを防止することができるという利点もある。
【００５６】
この方法において、前記溶液１Ｌ中における３価の金属イオンの含有量（濃度）は、吸着剤充填空間２０に充填されたアパタイト粉体１ｍｏｌに対して、１〜５０ｍｏｌ程度であるのが好ましく、５〜３０ｍｏｌ程度であるのがより好ましい。含有量が少な過ぎると、用いる溶液量が増大すること等により、アパタイト粉体に３価の金属イオンを結合させるのに要する時間が必要以上に長くなるおそれがあり、一方、含有量を前記上限値を超えて多くしても、それ以上の３価の金属イオンの吸着量の増大が期待できない。
【００５７】
前記溶液の総通液量は、特に限定されないが、３価の金属イオンの含有量を前記範囲とする場合、１〜５０ｍＬ程度であるのが好ましく、５〜３０ｍＬ程度であるのがより好ましい。総通液量が少な過ぎると、３価の金属イオンの含有量等によっては、アパタイト粉体への３価の金属イオンの吸着が十分に行われない場合があり、一方、総通液量を前記上限値を超えて多くしても、アパタイト粉体に３価の金属イオンを結合させるのに要する時間が必要以上に長くなるだけで、それに見合った吸着量の増大は見込めない。
【００５８】
また、前記溶液の通液速度は、０．１〜１０ｍＬ／ｍｉｎ程度であるのが好ましく、１〜５ｍＬ／ｍｉｎ程度であるのがより好ましい。通液速度が遅過ぎると、アパタイト粉体に３価の金属イオンを結合させるのに要する時間が必要以上に長くなり、一方、通液速度が速過ぎると、３価の金属イオンの含有量等によっては、アパタイト粉体への３価の金属イオンの吸着が十分に行われない場合がある。
【００５９】
このような方法によれば、前記溶液の条件（イオンの含有量、総通液量、通液速度）を適宜設定することにより、アパタイト粉体への３価の金属イオンの結合量を、所望のものにコントロールすることができる。
【００６０】
また、この方法において、前記溶液の通液方向は、任意である。すなわち、例えば、前記溶液を、連続的または間欠的に、流入側から流出側に向う一方向にのみ吸着剤充填空間２０に通液することができ、また、所定量の前記溶液を流入側から流出側に向かって吸着剤充填空間２０に通液した後、通液方向を変更し、所定量の前記溶液を吸着剤充填空間２０に通液することができる。また、後者の場合、このような通液操作を、複数回繰り返し行ってもよい。
【００６１】
なお、前記溶液としては、３価の金属イオンを含むものであれば、いかなるものを用いてもよいが、例えば、フッ化物、塩化物、臭化物、ヨウ化物のようなハロゲン化物、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩、水酸化物等の溶液を用いることができる。
【００６２】
次に、本発明の吸着装置の使用方法の一例について、リン酸化タンパク質を分離・精製する場合を代表に説明する。
【００６３】
まず、試料として、リン酸化タンパク質およびリン酸化されていないタンパク質の複数種のタンパク質を緩衝液に溶解した溶液を用意する。そして、この試料を、流入管２４およびフィルタ部材４を介して吸着剤３に供給して、カラム２内を通過させる。これにより、吸着剤３に吸着しない成分（リン酸化されていないタンパク質）は、フィルタ５および流出管２５を介してカラム２内から流出し、吸着剤３に選択的に吸着した成分（リン酸化タンパク質）は、カラム２内に保持される。
【００６４】
ここで、緩衝液には、例えば、リン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、Ｇｏｏｄｂｕｆｆｅｒ等を用いることができる。
【００６５】
次に、流入管２４からカラム２内へ溶出液を供給し、カラム２の流出管２５から流出する溶出液を採取する。
【００６６】
この溶出液には、吸着剤３に吸着したリン酸化タンパク質よりも吸着剤３に対する吸着能が高い物質（競合試薬）、キレート剤等を含有する緩衝液、前記緩衝液より塩濃度の高い緩衝液、前記緩衝液よりｐＨの低い（ｐＨ５．５〜１０程度）の緩衝液等を用いることができる。また、溶出液は、溶質の濃度を経時的に変化させつつカラム２内へ供給（吸着剤充填空間２０に通液）するようにしてもよい。
【００６７】
吸着剤３に溶出液が接触すると、吸着剤３に選択的に吸着したリン酸化タンパク質は、吸着剤３から離脱して、溶出液中に混入する。
【００６８】
以上、本発明の吸着剤、吸着装置および吸着装置の製造方法について説明したが、本発明はこれに限定されるものではない。
【実施例】
【００６９】
次に、本発明の具体的実施例について説明する。
１．吸着装置の製造
以下に示す実施例１、２および比較例の吸着装置をそれぞれ５個ずつ製造した。
【００７０】
（実施例１）
公知の湿式合成法によりハイドロキシアパタイトを合成し、ハイドロキシアパタイトスラリーを得た。
【００７１】
このハイドロキシアパタイトスラリーを噴霧乾燥して、平均粒径４０μｍの粉体を得た。その後、この粉体を、大気中、７００℃×４時間で焼成した。
【００７２】
このハイドロキシアパタイト粉体を、１０ｍＭリン酸緩衝液に懸濁させ、カラム（内径４ｍｍ×長さ１００ｍｍ）の吸着剤充填空間に充填した。なお、２枚のフィルタ部材として、開口径（平均）２μｍのステンレスメッシュを用いた。
【００７３】
また、吸着剤充填空間に充填されたハイドロキシアパタイト粉体の量は、０．７ｇ（約０．７ｍｍｏｌ）であった。
【００７４】
次に、カラム内に流入管から１０ｍＭのＦｅＣｌ_３溶液を流速１ｍＬ／ｍｉｎで１０分間供給し、ハイドロキシアパタイト粉体が有するリン酸基にＦｅ^３＋を結合させた。これにより、吸着剤を得て、吸着装置を製造した。
【００７５】
ここで、ハイドロキシアパタイト粉末が有するリン酸基へのＦｅ^３＋の結合の程度は、次のようにして確認した。
【００７６】
すなわち、前記ハイドロキシアパタイト粉体が有するリン酸基にＦｅ^３＋を結合させる工程において、流出管から流出するＦｅＣｌ_３溶液を１分毎に分取し、各画分のＦｅ濃度を測定した。
【００７７】
次に、カラム内に流入管から、洗浄液として、１０ｍＭリン酸緩衝液を供給して吸着剤を洗浄して、カラム内からＦｅの溶出がなくなったことを確認した後、再度、１０ｍＭのＦｅＣｌ_３溶液を、流速１ｍＬ／ｍｉｎで１０分間供給し、流出管から流出するＦｅＣｌ_３溶液を１分毎に分取し、各画分のＦｅ濃度を測定した。
【００７８】
なお、このＦｅ濃度の測定は、原子吸光装置（島津製作所社製、「ＡＡ−６２００」）を用いて原子吸光法により行なった。
【００７９】
以上２回のＦｅＣｌ_３溶液の通液操作で、分取したＦｅＣｌ_３溶液における各画分のＦｅ濃度の測定結果を、それぞれ図２に示す。なお、図２には、カラム内から流出した洗浄液中のＦｅ濃度の測定結果も併せて示した。
【００８０】
図２に示すように、１回目より２回目のＦｅＣｌ_３溶液の通液操作において、カラムから流出するＦｅＣｌ_３溶液中のＦｅ濃度が高くなっている。これは、１回目のＦｅＣｌ_３溶液の通液操作でＦｅ^３＋がハイドロキシアパタイト粉体が有するリン酸基に結合し、２回目のＦｅＣｌ_３溶液の通液操作においてＦｅ^３＋が結合し得るリン酸基の数が減少していることが原因であると推察される。
【００８１】
この結果は、ＦｅＣｌ_３溶液の通液操作により、ハイドロキシアパタイト粉体の表面のリン酸基に、容易にＦｅ^３＋が結合し得ることを示唆するものである。
【００８２】
また、原子吸光装置（島津製作所社製、「ＡＡ−６２００」）を用いて、粉体のＦｅ量を測定した結果、吸着剤１ｇあたり２．９ｍｇのＦｅ^３＋が結合していることが確認された。
【００８３】
（実施例２）
公知の湿式合成法によりフッ素アパタイト（Ｃａ_１０（ＰＯ_４）_６（（ＯＨ）_０．７Ｆ_０．３）_２）を合成し、フッ素アパタイトスラリーを得た。
【００８４】
このフッ素アパタイトスラリーを噴霧乾燥して、平均粒径４０μｍの粉体を得た。その後、この粉体を、大気中、７００℃×４時間で焼成した。
【００８５】
このフッ素アパタイト粉体１ｇ（約１ｍｍｏｌ）を用いて、前記実施例１と同様にして、吸着装置を製造した。
【００８６】
なお、前記実施例１で示した元素分析法により、Ｆｅ量を測定した結果、吸着剤１ｇあたり２．９ｍｇのＦｅ^３＋が結合していることが確認された。
【００８７】
（比較例）
ＦｅＣｌ_３溶液の通液操作を省略した以外は、前記実施例１と同様にして、吸着装置を製造した。
【００８８】
２．評価
２−１．リン酸化タンパク質の吸着特性
以下に示すようにして、実施例２および比較例で製造した吸着装置について、それぞれ、リン酸化タンパク質の吸着特性を調べた。
【００８９】
まず、吸着装置のカラム内の液体を、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）に置き換えた。
【００９０】
次に、リン酸化されていないオバルブミン（非リン酸化オバルブミン）、リン酸基を１つまたは２つ有するオバルブミン（リン酸化オバルブミン）を、それぞれ、５０ｍｇ／ｍＬとなるように、前記と同様のリン酸緩衝液に溶解した試料２ｍＬをカラム内に供給して、カラム内を通過させた。
【００９１】
次に、１０ｍＭから３００ｍＭまで１５分でリン酸緩衝液のグラジエントをかけ、リン酸緩衝液の濃度を上げていった。なお、リン酸緩衝液の流速（ｆｌｏｗｒａｔｅ）は、１ｍＬ／ｍｉｎとした。そして、２種類のオバルブミンが、カラム内からそれぞれ溶出を開始する時間（ｒｅｔｅｎｓｉｏｎｔｉｍｅ）を２８０ｎｍのＵＶモニターで測定（確認）した。
【００９２】
その結果を表１に示す。なお、表１中の数値は、実施例２および比較例において、それぞれ、５個の吸着装置における平均値である。
【００９３】
【表１】

【００９４】
表１に示すように、実施例２の吸着装置は、比較例の吸着装置に比べて、リン酸化されていないオバルブミン（非リン酸化オバルブミン）の溶出開始時間が明らかに速いものであった。
【００９５】
すなわち、実施例２の吸着装置では、比較例の吸着装置に比べて、リン酸化されたオバルブミン（リン酸化オバルブミン）とリン酸化されていないオバルブミン（非リン酸化オバルブミン）との分離度の向上が図られた。
【００９６】
また、実施例２の吸着装置から回収されたリン酸緩衝液中には、Ｆｅ^３＋の溶出は、ほとんど認められなかった。
【００９７】
２−２．リン酸化タンパク質の分離特性
以下に示すようにして、実施例１および比較例で製造した吸着装置について、それぞれ、リン酸化タンパク質の分離特性を調べた。
【００９８】
実施例１および比較例の吸着装置を、それぞれ高速液体クロマトグラフィー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製、「Ｄｕｏ−ｆｌｏｗ」）に取り付け、カラム内の液体を１ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．８）に置き換えた。
【００９９】
次に、オバルブミン（ｓｉｇｍａ社製）を５ｍｇ／ｍＬとなるように、前記Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液に溶解して試料溶液を調製した。なお、このオバルブミンは、リン酸化されたものとリン酸化されていないものとの混合物である。
【０１００】
次に、この試料溶液５０μＬを、高速液体クロマトグラフィーに注入した。溶出液は、前記Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液と１０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液との混合比が、１５分間で１００：０〜０：１００となるように経時的に変化させた。なお、溶出液の流速は１ｍｌ／分とした。
そして、カラム内から流出する溶出液中へのオバルブミンの溶出パターンを調べた。
【０１０１】
図３には、実施例１の吸着装置におけるオバルブミンの溶出パターンを、図４には、比較例の吸着装置におけるオバルブミンの溶出パターンを、それぞれ示す。
【０１０２】
図３に示すように、実施例１の吸着装置では、リン酸化されたオバルブミン（リン酸化オバルブミン）に対する特異的な吸着が生じ、リン酸化されていないオバルブミン（非リン酸化オバルブミン）は、早期にカラム内から溶出された。
【０１０３】
これに対して、図４に示すように、比較例の吸着装置では、リン酸基を有するオバルブミンと有さないオバルブミンとの明確な分離が得られず、リン酸基の有無にかかわらず、オバルブミンを非特異的に吸着した。
【０１０４】
なお、実施例２の吸着装置を用いた場合も、前記実施例１の溶出パターンと同様の溶出パターンであった。
【０１０５】
以上のように、各実施例（本発明）の吸着装置は、リン酸化されたオバルブミン（リン酸化タンパク質）に対する特異的吸着能に優れるため、リン酸化タンパク質の分離・精製に好適に使用することができる。
【産業上の利用可能性】
【０１０６】
以上述べたように、本発明によれば、３価の金属イオンをアパタイトが有するリン酸基に結合させたことにより、３価の金属イオンに対して親和性を有する化合物（目的とする化合物）を、高収率かつ高純度で回収することができる。
【０１０７】
また、３価の金属イオンの種類を適宜選択することにより、分離・精製を目的とする化合物の種類を選択することができる。例えば、３価のイオンとして、Ｆｅ^３＋を選択することにより、例えばリン酸化タンパク質等のリン酸基を有する化合物に対する特異的吸着能を向上させることができる。
【０１０８】
なお、本件出願は、日本国特許願２００３−１６４３３６に基づくものであり、当該出願の番号を明記することにより、その開示内容全体が本件出願に組み込まれたものとする。

Claims

リン酸基を有するリン酸化タンパク質を吸着し、
少なくとも表面がＣａ_１０（ＰＯ_４）_６（（ＯＨ）_１−ｘＡ_ｘ）_２［ただし、Ａはハロゲン元素を示し、０．３≦ｘ≦１である］で表されるアパタイトで構成され、前記アパタイトが有するリン酸基に、前記アパタイト１ｇに対して、０．１〜１００ｍｇのＦｅ ^３＋が３価の金属イオンとして結合してなることを特徴とする吸着剤。
カラムの吸着剤充填空間に、請求の範囲第１項に記載の吸着剤が充填されてなることを特徴とする吸着装置。
リン酸基を有するリン酸化タンパク質を吸着する吸着剤が、カラムの吸着剤充填空間に充填された吸着装置の製造方法であって、
前記カラムの吸着剤充填空間に、Ｃａ_１０（ＰＯ_４）_６（（ＯＨ）_１−ｘＡ_ｘ）_２［ただし、Ａはハロゲン元素を示し、０．３≦ｘ≦１である］で表されるアパタイトを充填した状態で、前記吸着剤充填空間に、Ｆｅ ^３＋を３価の金属イオンとして含む溶液を通液することにより、前記アパタイトが有するリン酸基に、前記アパタイト１ｇに対して、０．１〜１００ｍｇのＦｅ ^３＋を結合させることを特徴とする吸着装置の製造方法。
前記３価の金属イオンを含む溶液１Ｌ中における前記３価の金属イオンの含有量は、前記アパタイト１ｍｏｌに対して、１〜５０ｍｏｌである請求の範囲第３項に記載の吸着装置の製造方法。
前記３価の金属イオンを含む溶液の総通液量は、１〜５０ｍＬである請求の範囲第３項または第４項に記載の吸着装置の製造方法。
前記３価の金属イオンを含む溶液の通液速度は、０．１〜１０ｍＬ／ｍｉｎである請求の範囲第３項ないし第５項のいずれかに記載の吸着装置の製造方法。