JPH01297553A - 液体クロマトグラフィーを用いた蛋白質及び生理活性物質の分離方法 - Google Patents
液体クロマトグラフィーを用いた蛋白質及び生理活性物質の分離方法Info
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- JPH01297553A JPH01297553A JP63127985A JP12798588A JPH01297553A JP H01297553 A JPH01297553 A JP H01297553A JP 63127985 A JP63127985 A JP 63127985A JP 12798588 A JP12798588 A JP 12798588A JP H01297553 A JPH01297553 A JP H01297553A
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Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
「利用分野」
本発明は、液体クロマトグラフィーを用いて蛋白質及び
酵素、核酸などの生理活性物質を分離する方法に関する
。
酵素、核酸などの生理活性物質を分離する方法に関する
。
「従来技術及びその問題点」
従来、液体クロマトグラフィー用充填剤としては、シリ
カゲルや高分子ゲルが一般的に使用されてきたが、近年
、アパタイトの優れた生体親和性を利用して、蛋白質、
核酸、糖、配糖体などの生体高分子を分離する液体クロ
マトグラフィーにアパタイトが用いられるようになった
。
カゲルや高分子ゲルが一般的に使用されてきたが、近年
、アパタイトの優れた生体親和性を利用して、蛋白質、
核酸、糖、配糖体などの生体高分子を分離する液体クロ
マトグラフィーにアパタイトが用いられるようになった
。
アパタイトを充填剤としたカラムを用いて液体クロマト
グラフィーを行う場合には、通常１０ｍＭリン酸緩衝液
をカラムに通液しながら試料を保持させた後、高濃度（
４００ｍＭ）リン酸緩衝液を用いてステップ法あるいは
グラジェント法で溶離する。その際、リン酸緩衝液の使
用ｐＨ範囲は、６．５〜７．５程度であり、−船釣には
６．８である。
グラフィーを行う場合には、通常１０ｍＭリン酸緩衝液
をカラムに通液しながら試料を保持させた後、高濃度（
４００ｍＭ）リン酸緩衝液を用いてステップ法あるいは
グラジェント法で溶離する。その際、リン酸緩衝液の使
用ｐＨ範囲は、６．５〜７．５程度であり、−船釣には
６．８である。
しかしながら、このような従来方法では、低濃度のリン
酸緩衝液で溶出してしまい、カラムに保持されない場合
があり、また、リン酸濃度を１＋ｎＭ程度に下げると、
緩衝能が低下し、安定した分離を行うことができなくな
る。さらに、蛋白質や生理活性物質を含む試料をクロマ
トグラフィー分離する場合には、使用ｐＨ範囲で蛋白質
や生理活性物質が変性又は失活してしまうことがある。
酸緩衝液で溶出してしまい、カラムに保持されない場合
があり、また、リン酸濃度を１＋ｎＭ程度に下げると、
緩衝能が低下し、安定した分離を行うことができなくな
る。さらに、蛋白質や生理活性物質を含む試料をクロマ
トグラフィー分離する場合には、使用ｐＨ範囲で蛋白質
や生理活性物質が変性又は失活してしまうことがある。
また、ｐＨ６，５〜７．５のリン酸緩衝液に難溶性の物
質の分離には、アパタイトカラムを使用できないという
問題点もある。
質の分離には、アパタイトカラムを使用できないという
問題点もある。
「発明の目的」
本発明は、蛋白質及び生理活性物質を変性又は失活せず
にアパタイトカラムを用いて液体クロマトグラフィーに
より分離しうる蛋白質及び生理活性物質の分離方法を提
供することを目的とする。
にアパタイトカラムを用いて液体クロマトグラフィーに
より分離しうる蛋白質及び生理活性物質の分離方法を提
供することを目的とする。
「発明の構成」
本発明による液体クロマトグラフィーを用いた蛋白質及
び生理活性物質の分離方法は、−形式： ％式％（ 〔式中ＡはＣａ、ＰｂＳＳｎ、Ｍｎ、Ｆｅ、Ｂａ、Ｎｉ
。
び生理活性物質の分離方法は、−形式： ％式％（ 〔式中ＡはＣａ、ＰｂＳＳｎ、Ｍｎ、Ｆｅ、Ｂａ、Ｎｉ
。
Ｍｇ５Ｃｄ、Ｚｎ、Ｓｒなどの２価の金属のうちの１種
以上を示し、ＭはＰＳＡｓ、Ｖ、Ｓ及びＳｔのうちの１
種以上を示し、Ｘはハロゲン原子又は水酸基を示す〕で
表わされるアパタイト構造を有する充填剤を充填したカ
ラムを用いて液体クロマトグラフィーにより蛋白質及び
生理活性物質を分離するに当たり、リン酸塩を含まない
ｐ）１３〜１２の範囲の緩衝液を用いて試料を保持させ
、該緩衝液にリン酸塩を添加した溶液を溶離液として用
いて緩衝液の最適ｐＨ範囲内で溶離を行うことを特徴と
する。
以上を示し、ＭはＰＳＡｓ、Ｖ、Ｓ及びＳｔのうちの１
種以上を示し、Ｘはハロゲン原子又は水酸基を示す〕で
表わされるアパタイト構造を有する充填剤を充填したカ
ラムを用いて液体クロマトグラフィーにより蛋白質及び
生理活性物質を分離するに当たり、リン酸塩を含まない
ｐ）１３〜１２の範囲の緩衝液を用いて試料を保持させ
、該緩衝液にリン酸塩を添加した溶液を溶離液として用
いて緩衝液の最適ｐＨ範囲内で溶離を行うことを特徴と
する。
本発明の方法は、上記のように、−形式［１］で表わさ
れるアパタイト構造を有する充填剤を充填したカラムを
用いる。本発明に使用しうる一般式（Ｉｌで表わされる
アパタイト構造を有する充填剤としては、例えばＣａｔ
ｓ（Ｐ ０４）６（ＯＨ）Ｚ、Ｃａｔｓ（Ｐ ０４）６
（ＯＨ）Ｃｅ、Ｃａｔｓ（Ｐ Ｏ，）−Ｃｌｚ、Ｃａｔ
ｓ（Ｐ ０４）６（ＯＨ） Ｆ 、 Ｃａｔｓ（Ｐ ０
４）１．Ｆ ｚ、さらにこれらのアパタイトのＣａ原子
の一部又は全部がＰｂ、Ｓｎ、Ｍｎ、Ｆｅ、Ｂａなどの
２価の金属で置換されたものなどが挙げられる。
れるアパタイト構造を有する充填剤を充填したカラムを
用いる。本発明に使用しうる一般式（Ｉｌで表わされる
アパタイト構造を有する充填剤としては、例えばＣａｔ
ｓ（Ｐ ０４）６（ＯＨ）Ｚ、Ｃａｔｓ（Ｐ ０４）６
（ＯＨ）Ｃｅ、Ｃａｔｓ（Ｐ Ｏ，）−Ｃｌｚ、Ｃａｔ
ｓ（Ｐ ０４）６（ＯＨ） Ｆ 、 Ｃａｔｓ（Ｐ ０
４）１．Ｆ ｚ、さらにこれらのアパタイトのＣａ原子
の一部又は全部がＰｂ、Ｓｎ、Ｍｎ、Ｆｅ、Ｂａなどの
２価の金属で置換されたものなどが挙げられる。
本発明の方法を実施するには、まず、上記のような充填
剤を充填したカラムに、リン酸塩を含まないｐ１１３〜
１２の範囲の緩衝液中に試料を溶解した試料溶液を通液
することにより充填剤に試料を保持させる。ここで、リ
ン酸塩を含まない緩衝液としては、例えば、トリス−塩
酸緩衝液やトリス−マレイン酸緩衝液のようなトリス緩
衝液、ドータイトＭＥＳ、ビス−トリス、ＭＯＰＳのよ
うな各種のドータイト・グッド緩衝液、酢酸−酢酸ナト
リウムあるいは酢酸アンモニウムのような酢酸緩衝液な
どが挙げられるが、蛋白質及び生理活性物質を変性した
り、失活したすせず、リン酸塩を含まないｐ１１３〜１
２の範囲の緩衝液であれば、各種の緩衝液を使用するこ
とができる。
剤を充填したカラムに、リン酸塩を含まないｐ１１３〜
１２の範囲の緩衝液中に試料を溶解した試料溶液を通液
することにより充填剤に試料を保持させる。ここで、リ
ン酸塩を含まない緩衝液としては、例えば、トリス−塩
酸緩衝液やトリス−マレイン酸緩衝液のようなトリス緩
衝液、ドータイトＭＥＳ、ビス−トリス、ＭＯＰＳのよ
うな各種のドータイト・グッド緩衝液、酢酸−酢酸ナト
リウムあるいは酢酸アンモニウムのような酢酸緩衝液な
どが挙げられるが、蛋白質及び生理活性物質を変性した
り、失活したすせず、リン酸塩を含まないｐ１１３〜１
２の範囲の緩衝液であれば、各種の緩衝液を使用するこ
とができる。
次に、充填剤に保持された試料成分を溶離するが、本発
明の方法において溶離液としては、上記のリン酸塩を含
まないｐＨ３〜１２の範囲の緩衝液にリン酸塩を添加・
溶解した溶液を用いる。この溶離は、ステップ法あるい
はグラジェント法で実施することができ、４００ｍＭ程
度まで高濃度のリン酸塩を添加して実施することができ
る。
明の方法において溶離液としては、上記のリン酸塩を含
まないｐＨ３〜１２の範囲の緩衝液にリン酸塩を添加・
溶解した溶液を用いる。この溶離は、ステップ法あるい
はグラジェント法で実施することができ、４００ｍＭ程
度まで高濃度のリン酸塩を添加して実施することができ
る。
本発明の方法を実施する際には、使用最適ｐＨ範囲及び
使用最適濃度で蛋白質及び生理活性物質の変性や失活を
起こさない緩衝液を選択し、その緩衝液の緩衝能の高い
ｐＨで用いて実施する。
使用最適濃度で蛋白質及び生理活性物質の変性や失活を
起こさない緩衝液を選択し、その緩衝液の緩衝能の高い
ｐＨで用いて実施する。
発明の実施例Ｊ
次に、実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、
本発明はこれに限定されるものではない。
本発明はこれに限定されるものではない。
実施例１
平均粒径２μｍ％のハイドロキシアパタイトから成る充
填剤を内径７．５肋、長さ１００ａ＋ａ＋のステンレス
カラムに充填し、１０ＩＩＩＭトリスー塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ８，０）を通液しながらウシ血清アルブミン（ＢＳＡ
）、リゾチーム及びチトクロームＣを充填剤に保持させ
、次に０〜４００ｍＭのリン酸ナトリウムを上記のトリ
ス−塩酸緩衝液に溶解した溶液を移動相とし、１．０ｄ
／分の流速で３０分間、リニアグラジェント法によりＢ
ＳＡ、リゾチーム及びチトクロームＣの分離を行ったと
ころ、第１図に示すようなりロマトグラムが得られた。
填剤を内径７．５肋、長さ１００ａ＋ａ＋のステンレス
カラムに充填し、１０ＩＩＩＭトリスー塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ８，０）を通液しながらウシ血清アルブミン（ＢＳＡ
）、リゾチーム及びチトクロームＣを充填剤に保持させ
、次に０〜４００ｍＭのリン酸ナトリウムを上記のトリ
ス−塩酸緩衝液に溶解した溶液を移動相とし、１．０ｄ
／分の流速で３０分間、リニアグラジェント法によりＢ
ＳＡ、リゾチーム及びチトクロームＣの分離を行ったと
ころ、第１図に示すようなりロマトグラムが得られた。
図面において、■はＢＳＡのピーク、２はリゾチームの
ピーク、３及び４はチトクロームＣのピークを示す。
ピーク、３及び４はチトクロームＣのピークを示す。
実施例２
１０１トリス−塩酸緩衝液の代わりに、１０ｍＭドータ
イトＭＯＰＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ６，８）を用いた
以外は、実施例１と同様にして同し試料を分離したとこ
ろ、第２図に示すクロマトグラムが得られた。このクロ
マトグラムは、実施例１で得たものに比べてＢＳＡ、リ
ゾチーム及びチトクロームの各成分の分離時間が多少、
遅（なっているが、実施例１より高い分離能を示した。
イトＭＯＰＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ６，８）を用いた
以外は、実施例１と同様にして同し試料を分離したとこ
ろ、第２図に示すクロマトグラムが得られた。このクロ
マトグラムは、実施例１で得たものに比べてＢＳＡ、リ
ゾチーム及びチトクロームの各成分の分離時間が多少、
遅（なっているが、実施例１より高い分離能を示した。
比較例１
１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液の代わりに、１０ｍＭリン
酸緩衝液（ｐＨ６，８）を用いた以外は、実施例１と同
様にして同じ試料を分離したところ、第３図に示すクロ
マトグラムが得られた。このクロマトグラムでは、第１
図及び第２図のクロマトグラムに比べてＢＳＡのピーク
がシャープでなく、早く溶離してしまったことが判る。
酸緩衝液（ｐＨ６，８）を用いた以外は、実施例１と同
様にして同じ試料を分離したところ、第３図に示すクロ
マトグラムが得られた。このクロマトグラムでは、第１
図及び第２図のクロマトグラムに比べてＢＳＡのピーク
がシャープでなく、早く溶離してしまったことが判る。
「発明の効果」
本発明の方法によれば、リン酸塩を含まない緩衝液を用
いて試料を固定相に保持させるため、低濃度のリン酸塩
で溶出する試料でもカラムに保持させることができ、緩
衝液の緩衝能の高いｐＨ範囲での保持及び溶離を行うこ
とができ、安定した分離が可能である。また、試料を固
定相に保持させる際に、試料中の蛋白質や生理活性物質
の変性や失活を起こさない緩衝液の種類、ｐＨ及び濃度
を選択することができるため、本発明方法は広範な物質
の分離・精製に適用することができる。さらに本発明の
方法は、リン酸緩衝液以外の緩衝液を用いるので、ｐＨ
６，５〜７．５程度のリン酸緩衝液に難溶であるために
アパタイトカラムを使用できなかった試料の分離・精製
に適用することができる。
いて試料を固定相に保持させるため、低濃度のリン酸塩
で溶出する試料でもカラムに保持させることができ、緩
衝液の緩衝能の高いｐＨ範囲での保持及び溶離を行うこ
とができ、安定した分離が可能である。また、試料を固
定相に保持させる際に、試料中の蛋白質や生理活性物質
の変性や失活を起こさない緩衝液の種類、ｐＨ及び濃度
を選択することができるため、本発明方法は広範な物質
の分離・精製に適用することができる。さらに本発明の
方法は、リン酸緩衝液以外の緩衝液を用いるので、ｐＨ
６，５〜７．５程度のリン酸緩衝液に難溶であるために
アパタイトカラムを使用できなかった試料の分離・精製
に適用することができる。
また、試料を分離・精製する前処理で用いていた緩衝液
を用いて本発明の方法を実施することもでき、これによ
り精製工程の簡略化を図ることができる。
を用いて本発明の方法を実施することもでき、これによ
り精製工程の簡略化を図ることができる。
第１図は実施例１で得られたクロマトグラム、第２図は
実施例２で得られたクロマトグラム、第３図は比較例１
で得られたクロマトグラムを示す。 符号の説明 １・・・ＢＳＡのピーク ２・・・リゾチームのピーク ３及び４・・・チトクロームＣのピーク特許出願人
旭光学工業株式会社
実施例２で得られたクロマトグラム、第３図は比較例１
で得られたクロマトグラムを示す。 符号の説明 １・・・ＢＳＡのピーク ２・・・リゾチームのピーク ３及び４・・・チトクロームＣのピーク特許出願人
旭光学工業株式会社
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、一般式： Ａ＿１＿０（ＭＯ＿４）＿６Ｘ＿２ 〔式中ＡはＣａ、Ｐｂ、Ｓｎ、Ｍｎ、Ｆｅ、Ｂａ、Ｎｉ
、Ｍｇ、Ｃｄ、Ｚｎ、Ｓｒなどの２価の金属のうちの１
種以上を示し、ＭはＰ、Ａｓ、Ｖ、Ｓ及びＳｉのうちの
１種以上を示し、Ｘはハロゲン原子又は水酸基を示す〕
で表わされるアパタイト構造を有する充填剤を充填した
カラムを用いて液体クロマトグラフィーにより蛋白質及
び生理活性物質を分離するに当たり、リン酸塩を含まな
いｐＨ３〜１２の範囲の緩衝液を用いて試料を保持させ
、該緩衝液にリン酸塩を添加した溶液を溶離液として用
いて該緩衝液の最適ｐＨ範囲内で溶離を行うことを特徴
とする液体クロマトグラフィーを用いた蛋白質及び生理
活性物質の分離方法。 ２、リン酸塩を含まない緩衝液として、トリス緩衝液、
ドータイト・グッド緩衝液又は酢酸緩衝液を用いる請求
項１記載の分離方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63127985A JPH01297553A (ja) | 1988-05-25 | 1988-05-25 | 液体クロマトグラフィーを用いた蛋白質及び生理活性物質の分離方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63127985A JPH01297553A (ja) | 1988-05-25 | 1988-05-25 | 液体クロマトグラフィーを用いた蛋白質及び生理活性物質の分離方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01297553A true JPH01297553A (ja) | 1989-11-30 |
Family
ID=14973595
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63127985A Pending JPH01297553A (ja) | 1988-05-25 | 1988-05-25 | 液体クロマトグラフィーを用いた蛋白質及び生理活性物質の分離方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH01297553A (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH03267760A (ja) * | 1990-03-16 | 1991-11-28 | Sekisui Chem Co Ltd | 梅毒抗原の製造法 |
| JPH04188066A (ja) * | 1990-11-21 | 1992-07-06 | Sekisui Chem Co Ltd | 抗体の製造方法 |
| JPH04188067A (ja) * | 1990-11-21 | 1992-07-06 | Sekisui Chem Co Ltd | 抗原の製造方法 |
| WO2004108272A1 (ja) * | 2003-06-09 | 2004-12-16 | Pentax Corporation | 吸着剤、吸着装置および吸着装置の製造方法 |
-
1988
- 1988-05-25 JP JP63127985A patent/JPH01297553A/ja active Pending
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH03267760A (ja) * | 1990-03-16 | 1991-11-28 | Sekisui Chem Co Ltd | 梅毒抗原の製造法 |
| JPH04188066A (ja) * | 1990-11-21 | 1992-07-06 | Sekisui Chem Co Ltd | 抗体の製造方法 |
| JPH04188067A (ja) * | 1990-11-21 | 1992-07-06 | Sekisui Chem Co Ltd | 抗原の製造方法 |
| WO2004108272A1 (ja) * | 2003-06-09 | 2004-12-16 | Pentax Corporation | 吸着剤、吸着装置および吸着装置の製造方法 |
| US7919432B2 (en) | 2003-06-09 | 2011-04-05 | Hoya Corporation | Adsorbent, adsorption apparatus, and method for manufacturing the adsorption apparatus |
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