EP2757899A1 - Verfahren zur herstellung von peptidfraktionen und deren verwendung - Google Patents

Verfahren zur herstellung von peptidfraktionen und deren verwendung

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EP2757899A1
EP2757899A1 EP12777851.2A EP12777851A EP2757899A1 EP 2757899 A1 EP2757899 A1 EP 2757899A1 EP 12777851 A EP12777851 A EP 12777851A EP 2757899 A1 EP2757899 A1 EP 2757899A1
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EP
European Patent Office
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chromatography
peptides
fractions
peptide
resins
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Withdrawn
Application number
EP12777851.2A
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English (en)
French (fr)
Inventor
Hans-Jürgen DANNEEL
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Hochschule Ostwestfalen Lippe
Original Assignee
Hochschule Ostwestfalen Lippe
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Filing date
Publication date
Application filed by Hochschule Ostwestfalen Lippe filed Critical Hochschule Ostwestfalen Lippe
Publication of EP2757899A1 publication Critical patent/EP2757899A1/de
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    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C07K1/22—Affinity chromatography or related techniques based upon selective absorption processes
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    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23J—PROTEIN COMPOSITIONS FOR FOODSTUFFS; WORKING-UP PROTEINS FOR FOODSTUFFS; PHOSPHATIDE COMPOSITIONS FOR FOODSTUFFS
    • A23J3/00—Working-up of proteins for foodstuffs
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    • A23J3/32—Working-up of proteins for foodstuffs by hydrolysis using chemical agents
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    • A23J3/341—Working-up of proteins for foodstuffs by hydrolysis using chemical agents using enzymes of animal proteins
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C07K1/20—Partition-, reverse-phase or hydrophobic interaction chromatography

Definitions

  • the invention relates to a process for the preparation of enriched peptide fractions from proteinaceous
  • protease-containing microorganisms The proteins in the raw materials are usually mixtures of polyamides from twenty different ⁇ -L-amino acids with chain lengths between 100 and several 1000 monomer building blocks, whose
  • Some peptides may have pronounced hydrophilic and hydrophobic regions and are therefore surface active. They are suitable as surfactants or surfactant building blocks and can have foam-stabilizing, emulsifying, antistatic or cleaning properties.
  • Some peptides may be per se aromatic substances or serve as a basis for the production of reaction flavors. Some peptides may have their reducing or
  • Some peptides have antimicrobial effects.
  • Some peptides have anabolic or lipid metabolism-activating, immunomodulating, or hypotensive effects.
  • Hydrolysis of proteinaceous raw materials can be achieved by proteases, individually and in combination,
  • peptide blends are prepared, some of which are described in the literature, some commercially available e.g. are offered as feed or food and have some properties which, because of them, can be used as functional additives in food, cosmetic and pharmaceutical products. Enrichment of the functional peptides or separation of undesirable secondary components is carried out according to the prior art in individual cases
  • Ligand chromatography can be detected. Physiological effects have been tested in animal studies or other suitable bioassays.
  • Peptides in protein hydrolysates have physicochemical and physiological properties that predestine them as active components in a variety of applications in the feed, food, cosmetics and pharmaceutical industries.
  • the functional peptides in protein hydrolysates are usually present in such low proportions that their effect can not be clearly manifested or, if it does appear, other components of the mixture are affected by undesirable properties such as e.g. Color or odor prevent an application.
  • undesirable properties such as e.g. Color or odor prevent an application.
  • the invention makes it its task to peptide-containing mixtures
  • Hydrolysates such as e.g. Separate colors, off-flavors and / or salts. This technical problem is solved by a process for the preparation of enriched peptide fractions from proteinaceous raw materials, in which according to claim 1 is based on the fact that protein hydrolysates
  • Phenol-formaldehyde polycondensates e.g. the product series Amberlite of the company Dow Chemicals or the product series
  • peptide fragments were more preferably obtained from one to one hundred, especially from two to twenty amino acids.
  • the hydrolysates can in the usual way, for example.
  • Evaporation further concentrated, adjusted to the desired pH, optionally clarified by, for example. Filtration and added with up to 0.3 bed volume, BV, preferably 0.1 bed volume on the filled with the stationary phases chromatography columns.
  • Such application solutions preferably have a concentration of 5% to 50%.
  • the elution is preferably carried out with pure water without further additives, but possibly also with mostly low
  • Separating resins are used, in particular, it is for the chromatography as stationary phases
  • Polymer resins preferably having degrees of crosslinking permitting partial penetration up to a molecular size of 10,000 Da and a gel filtration effect of between 300 Da and 10,000 Da.
  • stationary phase also advantageous technical adsorber can be used without functionalization, for example, from the adsorber known grain coals or pyrolysed
  • Adsorbing properties such as grain carbons may have.
  • Chromatography cycles a binding equilibrium preferably adsorbed peptides from the mixtures, which significantly affect the separation process by different affinities for unbound peptides. Further process parameters are a flow rate of
  • the result of a chromatography is an enrichment of the peptides for predeterminable functional properties and / or the purification of the peptides from undesired secondary substances such as, for example, dyes, bitter substances or
  • the resulting peptide mixture can be replaced by further
  • chromatographic purification steps are further fractionated to an arbitrarily high degree of enrichment of one or more peptides, which as
  • Wheat protein hydrolyzate with about 90% proportion of peptides with molecular weights between 250 and 2500 Da, a composition profile is created via an analytical separation column using an HPLC system.
  • the wheat protein hydrolyzate is adjusted to 50% (w / w) aqueous solution and a pH of 4.5, filtered and exemplified for some properties as follows: Conductivity based on% dry matter
  • Foaming behavior of a 1% solution (foam volume after 1 min frit gasification 0.1 sample volume / s)
  • a double-walled glass column ID: 35 mm, length: 1000 mm, is filled with a DVB-crosslinked, macroporous, sulfonated polystyrene resin in calcium form, monodisperse and of a particle size of 0.4 ⁇ m.
  • the double jacket is heated to 85 ° C by means of a circulating thermostat.
  • the wheat protein hydrolyzate is added at a concentration of 50% (w / w) and a volume of 50 ml, corresponding to 0.1
  • Regeneration of the release resin is repeated at least 10 times, which is basically possible as often as desired.
  • the eluate from each chromatography cycle is collected in 15 fractions of 100 ml.
  • the peptide composition profiles of the individual fractions were recorded by the abovementioned HPLC method.
  • the HPLC profiles of the individual fractions differ significantly from one another and individual peptides accumulate visibly in different fractions. Furthermore, the characterization of the individual fractions.
  • Peptide size of 1500 Da is characterized as described in Example 1 and prepared for chromatography.
  • the chromatography is exemplified in two different
  • a double-walled glass column ID: 10 mm, length: 300 mm, is treated with a DVB-crosslinked polystyrene-vinyl alcohol
  • Soy protein hydrolyzate is added to the column at a concentration of 35% (w / w) and a volume of 3 ml (0.1 BV), with distilled water and a
  • the process is repeated three times without regeneration of the release resin.
  • the eluate is divided into 15 fractions of 3 ml
  • composition profiles are exemplified by the above
  • HPLC profiles of the individual fractions differ significantly from one another and individual peptides accumulate visibly in different fractions.
  • pH 5.0 a completely different
  • the eluate fractions differ from one another in terms of their color components, their foaming behavior and their
  • Example 3 From an enzymatic collagen hydrolyzate with peptide sizes ⁇ 2000 Da is introduced via an analytical separation column
  • composition profile created by means of a HPLC system The collagen hydrolyzate is dissolved to 40% (w / w) in water, adjusted to pH 8.0 and characterized as described in Example 1.
  • a double-jacketed glass column ID: 35 mm, length: 1000 mm, is sulfonated with a DVB-crosslinked macroporous
  • the double jacket is heated to 85 ° C by means of a circulating thermostat.
  • the collagen hydrolyzate is applied to the column at a concentration of 40% (w / w) and a volume of 50 ml (0.1 BV) and chromatographed with hot deionized water and a volume flow of 1 BV / h. After 1.5 BV elution volume, a renewed application of 0.1 BV collagen hydrolyzate and renewed elution with water. The process is repeated at least 10 times without regeneration of the release resin.
  • the eluate is divided into 15 fractions per 100 ml per cycle
  • HPLC profiles of the individual fractions also differ significantly in this example and individual peptides visibly accumulate in different
  • the inventive method provides in each
  • Embodiment Peptide fractions which are novel in their form, have advantageous functional properties and have a significantly higher application value than the raw materials used. Also, the above-described separation methods in their presented combinations and
  • the elutions of the chromatographic separations are usually carried out with water without further additives, a Regeneration of the chromatography columns with chemicals is not necessary.
  • Both the separation resins used for the chromatographies known for their use, for example, in water treatment, as well as the enzymes used in the feed and food applications are commercially available.

Abstract

Bei einem Verfahren zur Herstellung von angereicherten Peptidfraktionen aus proteinhaltigen Rohstoffen werden Proteinhydrolysate durch Chromatographie über stationäre Phasen mit einer wässrigen Lösung als Elutionsmittel nach ihren physikochemischen Eigenschaften getrennt.

Description

Verfahren zur Herstellung von Peptidfraktionen und deren Verwendung
Beschreibung :
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von angereicherten Peptidfraktionen aus proteinhaltigen
Rohstoffen und deren Verwendung.
Mischungen von Peptiden entstehen bei der enzymatischen
Hydrolyse von Eiweißstoffen sowohl bei der natürlichen tierischen und mikrobiologischen Verdauung als auch bei der technischen Behandlung von proteinhaltigen Rohstoffen mit
Proteasen oder proteasehaltigen Mikroorganismen. Die Proteine in den Rohstoffen sind in der Regel Mischungen von Polyamiden aus zwanzig verschiedenen α-L-Aminosäuren mit Kettenlängen zwischen 100 und mehreren 1000 Monomerbausteinen, deren
Reihenfolge von Protein zu Protein stark variiert.
Entsprechend entstehen bei der proteolytischen Behandlung von Proteinmischungen und selbst von reinen einzelnen Proteinen eine sehr große Vielzahl von Polymerbruchstücken. Die bei den enzymatisch-technischen Hydrolyseprozessen entstehenden Peptidmischungen unterscheiden sich in
Abhängigkeit von den verwendeten Rohstoffen, von den
verwendeten Enzymen und von dem eingestellten Hydrolysegrad in ihrer Zusammensetzung. Unter gleichen Hydrolysebedingungen ist die Zusammensetzung jedoch gleichartig reproduzierbar.
Für sehr viele Peptide aus Proteinhydrolysaten, zum Teil sogar in den Originalhydrolysaten ohne Anreicherung, sind spezielle funktionelle Eigenschaften und biologische
Aktivitäten nachgewiesen worden:
|Bestätigungskopie Einige Peptide können ausgeprägte hydrophile und hydrophobe Bereiche besitzen und sind daher oberflächenaktiv. Sie eigenen sich als Tenside oder Tensidbausteine und können schaumstabilisierende, emulgierende, antistatische oder reinigende Eigenschaften aufweisen.
Einige Peptide können per se aromagebende Substanzen sein oder als Basis zur Herstellung von Reaktionsaromen dienen. Einige Peptide können über ihre reduzierenden oder
oxidierenden Eigenschaften den Grad der Disulfidvernetzung von Proteinen beeinflussen.
Einige Peptide haben antimikrobielle Wirkungen.
Einige Peptide lösen Repairmechanismen an Haar und
Bindegewebe aus .
Einige Peptide besitzen anabole oder den Fettstoffwechsel aktivierende, immunmodulierende oder den Blutdruck senkende Wirkungen .
Durch eine Hydrolyse von proteinhaltigen Rohstoffen können mit Hilfe von Proteasen, einzeln und in Kombination,
praktisch in unbegrenzter Variation, Peptidmischungen hergestellt werden, von denen einige in der Literatur beschrieben sind, einige kommerziell z.B. als Futtermittel oder Nahrunsmittel angeboten werden und einige Eigenschaften besitzen, derer wegen sie als funktionelle Zusatzstoffe in Lebensmittel-, Kosmetik-, und Pharmaprodukten Anwendung finden können. Eine Anreicherung der funktionellen Peptide oder Abtrennung von unerwünschten Nebenbestandteilen erfolgt nach Stand der Technik in Einzelfällen durch
Fällungsverfahren oder Ultrafiltrationen. Beide Methoden sind relativ unspezifisch und erlauben pro Verfahrensschritt nur eine Trennung in zwei Fraktionen. Sehr hochpreisige Peptide für Pharmaanwendungen werden nach dem Stand der Technik auch chromatographisch fraktioniert, jedoch sind die verwendeten Harze sehr teuer, mechanisch in großen Trennsäulen nicht stabil und als Elutionsmittel werden teure organische Lösungsmittel verwendet . Insgesamt kommen diese Verfahren daher für eine wirtschaftliche großtechnische Gewinnung von Peptidmischungen für z.B.
Lebensmittelanwendungen nicht in Frage. Verfahren zur Ermittlung, Verfolgung und Quantifizierung der Wirksamkeiten der Peptide in den Rohlösungen und in den angereicherten Fraktionen gehören zum Stand der Technik. So können Aromaeigenschaften per se oder nach standardisierter Reaktion sensorisch geprüft werden, antibiotische
Eigenschaften mit der Agardiffusionsmethode,
Repaireigenschaften an Haaren mit Zugdehnungsmessungen oder spezifische Bindungseigenschaften durch
Ligandenchromatographie nachgewiesen werden. Physiologische Wirkungen sind im Tierversuch oder mit anderen geeigneten Bioassays überprüft worden.
Peptide in Proteinhydrolysaten besitzen physikochemische und physiologische Eigenschaften, die sie als Wirkkomponenten in einer Vielzahl von Anwendungen im Feed- , Food-, Kosmetik-, und Pharmabereich prädestinieren. Nur liegen die funktionalen Peptide in Proteinhydrolysaten in der Regel neben einem sehr großen Überschuss an unwirksamen Peptiden zu so geringem Anteil vor, dass ihre Wirkung nicht deutlich zutage treten kann, oder, wenn sie zutage tritt, andere Bestandteile der Mischung durch unerwünschte Eigenschaften wie z.B. Farbe oder Geruch eine Anwendung verhindern. Von Ausnahmen abgesehen, in denen mit einer sehr hochpreisigen Technologie oder aufgrund sehr spezieller Löslichkeitseigenschaften bestimmte Peptide isolierbar sind, existiert keine wirtschaftliche Methode, mit der sich generell Proteinhydrolysate in einem großtechnischen Maßstab in Fraktionen mit gesuchten chemischen oder
physikalischen Eigenschaften trennen lassen. Aber aufgrund der Forschungserkenntnisse der vergangenen Jahre wird den funktionellen Peptiden ein sehr großes
Anwendungspotential vorhergesagt. Ein Hinderungsgrund für eine Vermarktung funktioneller Peptide im großtechnischen Maßstab besteht jedoch darin, dass die funktionellen Peptide in den Proteinhydrolysaten entweder nur in sehr geringen Konzentrationen vorkommen oder aber von unerwünschten
Nebenkomponenten begleitet werden wie beispielsweise
Farbstoffen, Bitterstoffen oder Geruchsstoffen.
Zwar sind aus dem Bereich der Zuckergewinnung und der
Wasseraufbereitung großtechnische prozesschromatographische Verfahren bekannt, in denen eine Chromatographie in Säulen von mehr als 100 m3 für Stofftrennungen und
Stoffaufreinigungen betrieben wird. Diese großtechnischen Verfahren sind jedoch nur für sehr grobe Fraktionierungen geeignet, da die verwendeten Chromatographieharze in ihrem Adsorptionsverhalten als nicht sehr selektiv gelten und ihr chromatographisches Trennverhalten über diese bekannten technischen Anwendungen hinaus auch nicht bekannt ist.
Vor diesem technischen Hintergrund macht die Erfindung es sich zur Aufgabe, Peptide enthaltende Mischungen
wirtschaftlich im großem Maßstab zu fraktionieren, auf diese Weise erhaltene Peptide anzureichern und von unwirksamen Peptiden oder weiteren unerwünschten Komponenten der
Hydrolysate wie z.B. Farben, Fehlaromen und/oder Salzen abzutrennen. Gelöst wird diese technische Problematik durch ein Verfahren zur Herstellung von angereicherten Peptidfraktionen aus proteinhaltigen Rohstoffen, bei dem gemäß des Anspruchs 1 darauf abgestellt ist, dass Proteinhydrolysate durch
Chromatographie über stationäre Phasen mit einer wässrigen Lösung als Elutionsmittel nach ihren physikochemischen
Eigenschaften getrennt werden. Es wurde überraschender Weise gefunden, dass auch einige in der großtechnischen Prozesschromatographie wie in der
Zuckertechnologie, in der Abwasseraufbereitung oder in der chemischen Großtechnik eingesetzte stationäre Phasen
ausreichender Porosität durchaus in der Lage sind, Peptide bis zu einer Molekülgröße von etwa 50 Aminosäuren nach den Kriterien Basizität, Acidität, Hydrophobizität, Molekülgröße und gegenseitiger spezifischer Wechselwirkungen zu
fraktionieren, um so entsprechend ihren physikochemischen Eigenschaften angereicherte Peptidfraktionen zu erhalten.
Typische Vertreter solcher stationärer Phasen sind
Divinylbenzol vernetzte Polystyrolharze mit anionischen oder kationischen Funktionalisierungen, quervernetzte
Vinylalkohol-Styrol-Copolymerisate oder quervernetzte
Phenol-Formaldehyd Polykondensate, z.B. der Produktserie Amberlite der Firma Dow Chemicals oder der Produktserie
Lewatit der Firma Lanxess. Bevorzugt sind die proteinhaltigen Rohstoffe wie auch
kommerziell erhältliche Proteinhydrolysate vorab mit
spezifischen Proteasen bis zu einem definierten Grad
hydrolysiert worden, wodurch Peptidfragmente weiter bevorzugt von einer bis hundert, insbesondere von zwei bis zwanzig Aminosäuren erhalten wurden.
Die Hydrolysate können in üblicher Weise bspw. durch
Eindampfen weiter aufkonzentriert , auf den gewünschten pH-Wert eingestellt, gegebenenfalls durch bspw. Filtration geklärt und mit bis zu 0,3 Bettvolumen, BV, vorzugsweise mit 0,1 Bettvolumen auf die mit den stationären Phasen gefüllten Chromatographiesäulen gegeben werden. Solche Aufgabelösungen weisen bevorzugt eine Konzentration von 5% bis 50%
Trockensubstanz auf .
Die Eluierung erfolgt vorzugsweise mit reinem Wasser ohne weitere Zusätze, ggf. jedoch auch mit zumeist geringen
Zusätzen an Salzen oder Lösungsmitteln. Je nach gewünschter Fraktionierung werden stationäre Phasen verwendet, die hydroxy-funktionalisiert sind, womit eine Trennung nach der Hydrophobizität erfolgt, oder die anionisch oder kationisch funktionalisiert sind, womit eine Trennung nach Ionenausschluss und Ionenaustausch erfolgt.
Es können für die Chromatographie in vielfältiger Weise
Trennharze Verwendung finden, insbesondere handelt es sich bei den für die Chromatographie als stationäre Phasen
verwendeten Trennharzen um makroporöse oder gelförmige
Polymerharze, die bevorzugt Vernetzungsgrade aufweisen, die eine partielle Durchdringung bis zu einer Molekülgröße von 10.000 Da zulassen, und einen Gelfiltrationseffekt zwischen 300 Da und 10.000 Da.
In einigen Fällen können für die Chromatographie als
stationäre Phase auch vorteilhaft technische Adsorber ohne Funktionalisierungen verwendet werden, zum Beispiel aus der Adsorbertechnik bekannte Kornkohlen oder pyrolysierte
Trennharze, die aufgrund der Pyrolyse ähnliche
Adsorbereigenschaften wie Kornkohlen aufweisen können.
Auf den Trennharzen stellt sich im Verlauf mehrerer
Chromatographiezyklen ein Bindungsgleichgewicht bevorzugt adsorbierter Peptide aus den Mischungen ein, die durch unterschiedliche Affinitäten zu ungebundenen Peptiden den Trennungsverlauf wesentlich beeinflussen. Weitere Prozessparameter sind eine Flussrate der
Chromatographie zwischen 0,2 und 4 Bettvolumen pro Stunde bei einer Elutionstemperatur zwischen -4°C und 98°C, insbesondere bei einer Elutionstemperatur zwischen 70°C und 95°C. In dem Eluat der Chromatographiesäulen wird bei der
Etablierung einer neuen Trennung zunächst die gesuchte funktionelle Eigenschaft identifiziert. Die Auswahl des Trennharzes und der Trennbedingungen erfolgt derart, dass Bestandteile mit unerwünschten Eigenschaften möglichst nicht im Bereich der gewünschten Funktionalitäten eluieren. Die Festlegung der Fraktionsbereiche erfolgt nach leicht
messbaren physikochemischen Parametern des Eluates.
Das Ergebnis einer Chromatographie ist eine Anreicherung der Peptide nach vorgebbaren funktionellen Eigenschaften und/oder die Reinigung der Peptide von unerwünschten Nebenstoffen wie beispielsweise Farbstoffen, Bitterstoffen oder
Geruchsstoffen.
Die so erhaltene Peptidmischung kann durch weitere,
insbesondere auch chromatographische Aufreinigungsschritte bis zu einem beliebig hohen Anreicherungsgrad eines oder mehrerer Peptide weiterfraktioniert werden, die als
funktionelle Substanzen in Futtermitteln, Lebensmitteln, Kosmetikprodukten und als pharmazeutische Wirkstoffe
Verwendung finden können. Die nicht funktionellen Fraktionen werden zusammengeführt, konzentriert und ihrer ursprünglichen Verwertung im
Nahrungsmittel-, Futtermittel-, Fermentationsmedien- oder Düngemittelbereich zugeführt. Das Wesen der Erfindung wird anhand von Ausführungsbeispielen weiter erläutert, die keinen die Erfindung abschließenden Charakter haben.
Beispiel 1:
Von einem kommerziell erhältlichen enzymatischen
Weizenproteinhydrolysat mit etwa 90% Anteil an Peptiden mit Molekulargewichten zwischen 250 und 2500 Da wird über eine analytische Trennsäule ein Zusammensetzungsprofil mittels einer HPLC-Anlage erstellt. Das Weizenproteinhydrolysat wird auf 50 % (w/w) wässerige Lösung und einen pH-Wert von 4,5 eingestellt, filtriert und beispielhaft hinsichtlich einiger Eigenschaften wie folgt charakterisiert: Leitfähigkeit bezogen auf % Trockensubstanz
Farbanteil (E430 / cm) bezogen auf % Trockensubstanz
Schaumbildungsverhalten einer 1% igen Lösung (Schaumvolumen nach 1 min Frittenbegasung 0,1 Probenvolumen /s)
Schaumstabilität (Halbwertszeit)
Geruch (sensorischer Test)
Geschmack (sensorischer Test)
Repairwirkung auf Licht-, Heißluft- und/oder
Detergenz- exponierte Haare im Zugdehnungstest
Eine Doppelmantel -Glaskolonne, ID: 35 mm, Länge: 1000 mm, wird mit einem DVB-vernetzten, makroporösen, sulfonierten Polystyrolharz in Calciumform, monodispers und von einer Partikelgröße von 0,4 μπι, gefüllt. Der Doppelmantel wird mit Hilfe eines Umlaufthermostaten auf 85 °C aufgeheizt. Das Weizenproteinhydrolysat wird mit einer Konzentration von 50% (w/w) und einem Volumen von 50 ml, entsprechend 0,1
Bettvolumen, BV, auf die Säule aufgegeben und mit heißem Leitungswasser mittlerer Härte und einem Volumenstrom von 1
BV/h chromatographiert . Nach 1,5 BV Elutionsvolumen erfolgt eine erneute Aufgabe von 0,1 BV Weizenproteinhydrolysat und eine erneute Elution mit Wasser. Der Vorgang wird ohne
Regeneration des Trennharzes mindestens 10 mal wiederholt, was grundsätzlich beliebig oft möglich ist. Das Eluat von jedem Chromatographiezyklus wird in 15 Fraktionen ä 100 ml aufgefangen.
Beispielhaft kann durch online Verfolgung des pH-Verlaufs, des Farbverlaufs, der Leitfähigkeit und der Absorbtion bei
214 nm die Anreicherung der Peptide mit den entsprechenden Eigenschaften im Verlauf der Elution abgelesen werden.
Die Peptid-Zusammensetzungsprofile der einzelnen Fraktionen wurden mit der oben genannten HPLC-Methode aufgenommen. Die HPLC-Profile der einzelnen Fraktionen unterscheiden sich deutlich voneinander und einzelne Peptide reichern sich sichtbar in unterschiedlichen Fraktionen an. Desweiteren wurden die zur Charakterisierung des
Weizenproteinhydrolysates betrachteten funktionellen
Eigenschaften auch in einzelnen Fraktionen untersucht und mit der Ausgangslösung verglichen. Die Eluatfraktionen weisen unterschiedliche
E430 / TS - Verhältnisse auf, die Farbanteile reichern sich in einigen Fraktionen an, in anderen entsprechend ab. Einige Fraktionen sind im Gegensatz zur Aufgabelösung farblos, nicht mehr bitter und zeigen bei gleicher Konzentration eine 30fach erhöhte Schaumstabilität. Die schon aus der Aufgabelösung bekannten und nachgewiesenen Haarrepaireigenschaften konnten ebenfalls in einigen Fraktionen wiedergefunden werden, in anderen Fraktionen jedoch nicht. Beispiel 2:
Ein Soj aproteinhydrolysat mit einer durchschnittlichen
Peptidgröße von 1500 Da wird wie in Beispiel 1 beschrieben charakterisiert und für die Chromatographie vorbereitet. Die Chromatographie wird beispielhaft in zwei verschiedenen
Versuchen bei einem pH-Wert von 5,0 und einem pH-Wert von 10,0 durchgeführ .
Eine Doppelmantel-Glaskolonne, ID: 10 mm, Länge: 300 mm, wird mit einem DVB-vernetzten Polystyrol-Vinylalkohol
copolymerisiertem Trennharz ohne ionische
Funktionalisierungen, monodispers und von einer Partikelgröße von 0,2 μπι, gefüllt. Der Doppelmantel wird mit Hilfe eines Umlaufthermostaten auf 10 °C gekühlt. Das
Soj aproteinhydrolysat wird mit einer Konzentration von 35% (w/w) und einem Volumen von 3 ml (0,1 BV) auf die Säule aufgegeben und mit destillierten Wasser und einem
Volumenstrom von 1 BV/h chromatographiert . Nach 1,5 BV Elutionsvolumen erfolgt eine erneute Aufgabe von 0,1 BV
Weizenproteinhydrolysat und eine erneute Elution mit Wasser.
Der Vorgang wird ohne Regeneration des Trennharzes drei Mal wiederholt. Das Eluat wird in 15 Fraktionen ä 3 ml
aufgefangen. Von den Fraktionen eines Elutionszyklus werden beispielhaft die Zusammensetzungsprofile mit der oben
genannten HPLC-Methode aufgenommen. Außerdem werden die zur Charakterisierung des Sojaproteinhydrolysates betrachteten Eigenschaften auch in den einzelnen Fraktionen untersucht, und mit der Ausgangslösung verglichen.
Die HPLC-Profile der einzelnen Fraktionen unterscheiden sich deutlich voneinander und einzelne Peptide reichern sich sichtbar in unterschiedlichen Fraktionen an. Insbesondere wird in dem Versuch bei pH 5,0 eine vollkommen andere
Fraktionierung erhalten als in dem Versuch bei pH 10,0.
Die Eluatfraktionen unterscheiden sich voneinander durch ihre Farbanteile, ihr Schaumbildungsverhalten und ihre
sensorischen Eigenschaften.
Beispiel 3 : Von einem enzymatischen Collagenhydrolysat mit Peptidgrößen < 2000 Da wird über eine analytische Trennsäule ein
Zusammensetzungsprofil mittels einer HPLC-Anlage erstellt. Das Collagenhydrolysat wird zu 40 % (w/w) in Wasser gelöst, auf einen pH-Wert von 8,0 eingestellt und wie in Beispiel 1 beschrieben charakterisiert.
Eine Doppelmantel -Glaskolonne, ID: 35 mm, Länge: 1000 mm, wird mit einem DVB-vernetzten makroporösen sulfonierten
Polystyrolharz in Natriumform, monodispers und von einer Partikelgröße von 0,4 μπι, gefüllt. Der Doppelmantel wird mit Hilfe eines Umlaufthermostaten auf 85 °C aufgeheizt. Das Collagenhydrolysat wird mit einer Konzentration von 40% (w/w) und einem Volumen von 50 ml (0,1 BV) auf die Säule aufgegeben und mit heißem entionisierten Wasser und einem Volumenstrom von 1 BV/h chromatographiert . Nach 1,5 BV Elutionsvolumen erfolgt eine erneute Aufgabe von 0,1 BV Collagenhydrolysat und eine erneute Elution mit Wasser. Der Vorgang wird ohne Regeneration des Trennharzes mindestens 10 mal wiederholt. Das Eluat wird je Zyklus in 15 Fraktionen ä 100 ml
aufgefangen.
Die HPLC-Profile der einzelnen Fraktionen unterscheiden sich auch bei diesem Beispiel deutlich voneinander und einzelne Peptide reichern sich sichtbar in unterschiedlichen
Fraktionen an.
Das erfindungsgemäße Verfahren liefert in jeder
Ausführungsform Peptidfraktionen, die in ihrer Form neuartig sind, vorteilhafte funktionelle Eigenschaften aufweisen und einen deutlich höheren Anwendungswert besitzen als die verwendeten Rohstoffe. Auch sind die voranstehend erläuterten Trennverfahren in ihren vorgestellten Kombinationen und
Anwendungen in der Lage, das große funktionelle Potential von Proteinhydrolysaten für eine breite Nutzung zu erschließen.
Durch Variation der Prozessparameter und Kombination mehrerer Chromatographien unter unterschiedlichen Bedingungen können immer neue Peptidmischungen bis hin zu reinen Peptiden erzeugt werden. Das erfindungsgemäße Verfahren und die daraus resultierenden Produkte stellen eine erhebliche Wertschöpfung aus Nebenfraktionen der Lebensmittel- und Agrarproduktion dar, die ansonsten nur minderwertig oder gar nicht verwertbar sind. Alle Teilfraktionen, die keine für eine spezifische
Anwendung ausreichenden funktionellen Eigenschaften besitzen, sind mindestens in die ursprüngliche Verwertung der Rohstoffe rückführbar, in der Regel werden auch sie durch den
enzymatischen Aufschluss eine Aufwertung erfahren,
keinesfalls sind sie jedoch wertlos.
Die Elutionen der chromatographischen Trennungen erfolgen in aller Regel mit Wasser ohne weitere Zusätze, eine Regeneration der Chromatographiesäulen mit Chemikalien ist nicht notwendig. Sowohl die verwendeten Trennharze für die Chromatographien, bekannt durch ihren Einsatz z.B. in der Wasseraufbereitung, als auch die verwendeten Enzyme aus den Feed- und Foodanwendungen sind kommerziell verfügbar.

Claims

Verfahren zur Herstellung von Peptidfraktionen und deren Verwendung Ansprüche:
1. Verfahren zur Herstellung von angereicherten
Peptidfraktionen aus proteinhaltigen Rohstoffen, dadurch gekennzeichnet, dass Proteinhydrolysate durch
Chromatographie über stationäre Phasen mit einer
wässrigen Lösung als Elutionsmittel nach ihren
physikochemischen Eigenschaften getrennt werden.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass vor der Chromatographie die Rohstoffe in einer Hydrolyse mit spezifischen Proteasen auf Peptidgroßen von 1 bis 100 Aminosäuren eingestellt werden.
3. Verfahren nach einem oder mehreren der vorangehenden
Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass vor einer
Chromatographie eine Einstellung des pH-Wertes, der
Konzentration und/oder eine Klärung der
Proteinhydrolysate erfolgt .
4. Verfahren nach einem oder mehreren der vorangehenden
Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass für die
Chromatographie als stationäre Phase technische Adsorber oder Ionenaustauscher ohne Funktionalisierungen oder mit neutralen hydrophilen, sauren oder basischen
Funktionalisierungen verwendet werden.
5. Verfahren nach einem oder mehreren der vorangehenden
Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass für die
Chromatographie als stationäre Phase als Adsorber
Trennharze Verwendung finden.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Trennharze makroporöse oder gelförmige Polymerharze sind .
7. Verfahren nach einem oder mehreren der vorangehenden
Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass für die
Chromatographie als stationäre Phase die Adsorber
Kornkohlen oder pyrolysierte Trennharze Verwendung finden .
8. Verfahren nach einem oder mehreren der vorangehenden
Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass eine
Aufgabelösung eine Konzentration von 5% bis 50%
Trockensubstanz aufweist.
9. Verfahren nach einem oder mehreren der vorangehenden
Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die stationären Phasen Vernetzungsgrade aufweisen, die einen
Molekularsiebeffekt zwischen 300 Da und 10.000 Da
aufweisen .
10. Verfahren nach einem oder mehreren der vorangehenden
Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Flussrate der Chromatographie zwischen 0,2 und 4 Bettvolumen pro Stunde liegt .
11. Verfahren nach einem oder mehreren der vorangehenden
Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die
Elutionstemperatur zwischen -4°C und 98°C liegt.
12. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Elutionstemperatur zwischen 70°C und 95°C liegt.
13. Verfahren nach einem oder mehreren der vorangehenden
Ansprüche, gekennzeichnet durch reines Wasser als
Elutionsmittel .
14. Verfahren nach einem oder mehreren der vorangehenden Ansprüche 1 bis 11, gekennzeichnet durch verdünnte wässerige Lösungen mit Zusätzen an Salzen, Säuren, Basen oder Lösungsmitteln als Elutionsmittel.
15. Verfahren nach einem oder mehreren der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass in einer
Chromatographie eine Anreicherung der Peptide nach vorgebbaren funktionellen Eigenschaften erfolgt.
16. Verfahren nach einem oder mehreren der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass in einer
Chromatographie eine Reinigung der Peptide von
unerwünschten Nebenbestandteilen erfolgt.
17. Verfahren nach einem oder mehreren der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass eine nach den vorangehenden Ansprüchen hergestellte Peptidmischung durch weitere, insbesondere chromatographische
Aufreinigungsschritte bis zu einem beliebig hohen
Anreicherungsgrad eines oder mehrerer Peptide
weiterfraktioniert wird.
18. Angereicherte Peptidfraktionen, hergestellt nach einem oder mehreren der vorangehenden Ansprüche .
19. Verwendung der nach den vorangehenden Ansprüchen
erhaltenen Peptide als funktionelle Substanzen in
Futtermitteln, Lebensmitteln, Kosmetikprodukten und als pharmazeutische Wirkstoffe.
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