DE60218694T2

DE60218694T2 - Verfahren zur verbesserung der extraktion von proteinasehemmern

Info

Publication number: DE60218694T2
Application number: DE60218694T
Authority: DE
Inventors: Rod Des Moines AUSICH; Hal West Des Moines FALLERT; George Evergreen MATHER; Robert Des Moines STOMP; Fayad West Des Moines SHEABAR; Brent Ankeny DAVISON
Original assignee: Kemin Foods LC
Current assignee: Kemin Foods LC
Priority date: 2001-07-06
Filing date: 2002-06-20
Publication date: 2007-12-06
Anticipated expiration: 2022-06-21
Also published as: ATE356146T1; JP2004531582A; ES2283563T3; US20030092152A1; US20050037474A9; EP1414307A4; EP1414307A1; DE60218694D1; US7371418B2; US20030092150A1; US6767566B2; EP1414307B1; JP4072122B2; WO2003003838A1

Description

Hintergrund der Erfindung
1. Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Verbesserung der Extraktion eines Proteinase-Inhibitors und genauer ein Verfahren zur Verbesserung der Ausbeute und Reinheit von Proteinase-Inhibitor II (PI2) extrahiert aus ganzen Kartoffeln.
2. Hintergrund des Standes der Technik
Die Extraktion, Isolierung und Reinigung von Proteinen, die von Pflanzen stammen, ist auf dem Gebiet der Biochemie gut bekannt. 1972 berichteten Melville und Ryan über die großtechnische Herstellung zur Isolierung von Chymotrypsin-Inhibitor I aus Kartoffelknollen (Melville, J.C. und Ryan, C.A., Chymotrypsin inhibitor I from potatoes, J. Biological Chem., 247:3445-3453, 1972). Nach dem Verfahren von Melville und Ryan wurden Kartoffeln mit intakten Schalen geschnitten und in Natriumdithionit-Lösung getränkt, homogenisiert und durch ein Nylontuch gedrückt. Der sich ergebende Saft wurde auf einen pH von 3 eingestellt, bei 1.000 × g für 15 min bei 5°F zentrifugiert und der Überstand gesammelt und mit Ammoniumsulfat fraktioniert.
Die Reinigung wurde durch Wasserwäsche und Wärmebehandlung erreicht, wodurch klare Filtrate von erhitzten Fraktionen gesammelt und gefriergetrocknet wurden. Das Suspendieren des gefriergetrockneten Pulvers in Wasser, das Dialysieren gegen Wasser für 48 h und das Gefriertrocknen des sich ergebenden klaren Filtrats ergaben ein Rohextrakt. Der erneut suspendierte Extrakt wurde dann zentrifugiert und auf eine Säule von Sephadex G-75 aufgebracht. Gesammelte Fraktionen enthaltend den Inhibitor I wurden gesammelt, verdampft und auf einer Säule von Sephadex G-25 entsalzt. Das sich ergebende Gel-filtrierte Inhibitorprodukt wurde als etwa 90% Inhibitor I-Protein gereinigt durch Dissoziation auf einer Sephadex G-75-Säule und entsalzt auf einer Säule aus Sephadex G-25 bestimmt.
Das Labor von Ryan folgte mit dem Bericht der Isolierung und Charakterisierung von Proteinase-Inhibitor II in ziemlich der gleichen Weise wie für Inhibitor I beschrieben (Bryant, J., Green, T.R., Gurusaddaiah, T., Ryna, C.L. Proteinase inhibitor II from potatoes: Isolation and characterization of its protomer components, Biochemistry 15:3418-3424, 1976). Bryant et al. unterteilten die aus Kartoffeln stammenden Proteinase-Inhibitoren in zwei Gruppen auf Basis der betreffenden Stabilitäten bei einer Temperatur von 80°C für 10 min. Proteinase-Inhibitor I (PI₁) ist charakterisiert als tetrameres Protein aus vier hybridisierten Isoinhibitor-Protomer-Spezies mit einem Molekulargewicht von 39.000, während PI₂ als dimerer Inhibitor umfassend vier Isoinhibitor-Promotor-Spezies mit einem Molekulargewicht von 21.000 charakterisiert ist.
Die Extraktion und Gewinnung von Proteinase-Inhibitor-Proteinen aus Kartoffeln wird in WO 99/01474 beschrieben. Protein aus Kartoffelknollen werden in löslicher Form in einem wässrigen/Alkohol-Extraktionsmedium, wie verdünnter Ameisensäure und 20% Ethanol, extrahiert. Der Alkoholextrakt wird auf eine erste Temperatur erwärmt, um den größten Teil der unerwünschten Proteine zu denaturieren, und auf eine zweite Temperatur abgekühlt, um eine Präzipitatphase, die den Abfall bildet, und eine lösliche Phase, welche die wärmestabilen Proteinase-Inhibitor-Proteine enthält, zu bilden. Die wärmestabilen Proteinase-Inhibitor-Proteine werden aus der löslichen Phase durch Dialyse gegen ein geeignetes Dialysemedium, wie verdünnte Ameisensäure, ausgefällt.
Kürzlich wurde PI2 damit in Zusammenhang gebracht, eine Rolle bei der Verlängerung der Sättigung bei Personen zu spielen, die mit einer Nährtrank-Zusammensetzung enthaltend PI2 versorgt wurden. In der US-Veröffentlichung Nr. US2002119915 wird beschrieben, dass Personen über eine signifikante Verringerung des Hungers für bis zu 3 ½ Stunden nach einer Mahlzeit berichteten, wenn sie mit einer Mahlzeit versorgt wurden, die eine Nährtrankzusammensetzung enthaltend PI2 umfasste. In ähnlicher Weise war die Einschätzung der Sattheit verbessert und jede Testperson verlor im Durchschnitt 2 kg über einen Zeitraum von 30 Tagen, ohne die nachteiligen Nebenwirkungen zu erfahren, die typischerweise mit Appetitzügler-Verbindungen verbunden sind. Mechanistisch wird angenommen, dass PI2 als ein Trypsin- und Chymotrypsin-Inhibitor bei Verzehr durch eine Person die Freisetzung von endogenem Cholecystokinin stimuliert, einem bekannten mutmaßlichen Rückkopplungsmittel, das bei der Verringerung des Wunsches nach der Aufnahme von Lebensmitteln wirksam ist.
Vorhandene Verfahren zur Extraktion von Proteinase-Inhibitoren beinhalten mehrere arbeitsaufwändige und zeitaufwändige Schritte und führen zu Verlusten an Ausbeute und verringerter Reinheit des gewonnenen Proteinase-Inhibitors. Außerdem stützen sich die vielversprechendsten Verfahren nach dem Stand der Technik auf den Einsatz von Ethanol in der Extraktionsmittellösung, was bei den eingesetzten Konzentrationen die Lösung entflammbar macht. Keines der Verfahren nach dem Stand der Technik ist in einem technischen Maßstab demonstriert worden. Dementsprechend besteht Bedarf nach einem Extraktionsverfahren im großen Maßstab zur Extraktion von PI2 in rentabler und effizienter Weise, das industrielle qualitative und quantitative Standards erfüllt.
Zusammenfassung der Erfindung
Kartoffelknollen, die einen gewünschten Proteinase-Inhibitor enthalten, werden mit einer Lösung von einer organischen Säure und einem Salz vereint. Das Material der Kartoffelknolle wird zerkleinert, wobei eine Aufschlämmung in der Säure- und Salzlösung gebildet wird, um die Teilchengröße zu verringern und die Oberfläche der Teilchen zu erhöhen, um die Wirksamkeit der Extraktion zu verbessern. Das Verfahren der Zerkleinerung wird so ausgewählt, um die Teilchengröße zu verringern, ohne den gewünschten Proteinase-Inhibitor durch lokale Aufheizeffekte zu denaturieren. Die Säure- und Salzlösung verbessert die Extraktion des Proteinase-Inhibitors aus dem zerkleinerten Kartoffelknollenmaterial und schützt es gegen den Abbau durch andere Verbindungen, die aus den zerrissenen Pflanzenzellen freigesetzt werden können. Nach Extraktion in die Lösung wird der Proteinase-Inhibitor durch Zentrifugieren, Klärung, Filtration und Trocknung der Extraktlösung isoliert und gereinigt. Die Säure und das Salz werden während der Filtrationsstufe entfernt, um das gereinigte Proteinase-Inhibitor-Produkt nicht zu kontaminieren.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird Proteinase-Inhibitor II (PI2) aus ganzen Kartoffelknollen extrahiert. Organische Säuren, deren Wirksamkeit im Verfahren festgestellt wurde, beinhalten Essig-, Ascorbin-, Citronen- und Ameisensäure. Es wurde festgestellt, dass Ameisensäure die höchste Reinheit und die höchste Ausbeute des PI2-Endprodukts ergibt. Der Ameisensäure-Gehalt der Lösung wird im Bereich von 0,5% bis 2,5% Gew./Gew. eingestellt, wobei ein bevorzugter Gehalt etwa 1,5% ist. Natriumchlorid wird zur Extraktionsmittellösung gegeben, um die Löslichkeit der Kartoffelproteine zu erhöhen. Natriumchlorid-Konzentrationen zwischen 1 N und 3 N werden verwendet, wobei eine bevorzugte Konzentration etwa 1,5 N ist. Die Lösung wird zu den Kartoffeln in einem Gewichtsverhältnis Lösung:Kartoffel, Gew./Gew., zwischen 1:1 und 1:10 gegeben, wobei ein bevorzugtes Verhältnis 1:2,5 ist.
Die Zerkleinerung wird durch Mahlen bewerkstelligt. Eine Zielteilchengröße liegt im Bereich von 100 bis 1.500 μm. In diesem Bereich waren die Produktausbeuten erhöht und die Fließeigenschaften der Aufschlämmung waren akzeptabel. Eine Verringerung der Teilchengröße unter 100 μm führte zu einer geringeren Ausbeute von PI2 und verbesserte die Fließeigenschaften nicht. Das Mahlen über einen verlängerten Zeitraum führte auch zu einer verringerten PI2-Ausbeute, höchstwahrscheinlich aufgrund einer erhöhten Temperatur und der Freisetzung von unerwünschten Proteasen, welche die PI2-Ausbeute verringern. Die Ameisensäure und das Natriumchlorid werden während der Filtrationsstufe effizient entfernt.
Ein Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines verbesserten Verfahrens zur Extraktion von Proteinase-Inhibitoren aus Kartoffelknollen.
Ein anderes Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung eines verbesserten Verfahrens zur Extraktion von Proteinase-Inhibitor II aus Kartoffelknollen, das nicht auf den Einsatz von Ethanol in der Extraktionslösung beruht.
Ein weiteres Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens zur Extraktion von Proteinase-Inhibitor II aus Kartofellknollen, das im technischen Maßstab effizient und kostengünstig ist.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Die Extraktion und Isolierung von PI2 aus Kartoffeln beginnt mit der Zugabe einer organischen Säure, bevorzugt Ameisensäure, und eines Salzes, bevorzugt Natriumchlorid, zu rohen Kartoffeln. Die Mischung wird einer Zerkleinerung unterworfen, um die Teilchengröße der Kartoffelteilchen zu verringern und lösliche Proteine zu extrahieren. Die Zentrifugation wird eingesetzt, um Feststoffe zu entfernen, und die flüssige Fraktion wird bei einer ausreichenden Temperatur erwärmt, um viele unerwünschte Proteine, aber nicht PI2, zu denaturieren. Die Lösung wird erneut zentrifugiert, um die unlöslichen denaturierten Proteine zu entfernen, und die flüssige Fraktion wird mikrofiltriert, um relativ große Teilchen zu entfernen. Ultrafiltration wird verwendet, um die organische Säure und das Salz zu entfernen und das PI2 im Retentat weiter zu reinigen.
Ein Verfahren zur Extraktion von PI2 aus ganzen Kartoffeln wurde in dem Versuch entwickelt, die Ausbeute zu maximieren, die Verunreinigungen zu minimieren, die Kosten zu minimieren und technische Durchführbarkeit zu erreichen. Die Extraktionslösung wurde auf Basis der Fähigkeit des Verfahrens zur Solubilisierung von PI2, des Schutzes von PI2 vor dem Abbau und der Maximierung von PI2 insgesamt, das aus den unlöslichen Kartoffelkomponenten entfernt wird, während die Menge an cosolubilisierten Proteinen minimiert wird, bewertet. Die Extraktionslösung beinhaltete die Löslichkeit und die funktionelle Stabilität von PI2 in saurem Medium und bei erhöhten Temperaturen. Eine Extraktionslösung, die Natriumchlorid und Ameisensäure enthält, wurde als wirksam für diesen Zweck ermittelt. Das Verhältnis von eingesetzter Extraktionslösung zu extrahiertem Rohmaterial wurde aus Kostengründen minimiert, wobei die maximale Ausbeute an PI2 pro kg Rohkartoffelknollen produziert wurde.
Umkehrphasen-HPLC-Verfahren
Die Menge an PI2, Kunitz- und Carboxypeptidase-Inhibitoren wurde unter Verwendung von Umkehrphasen-HPLC gemessen. Eine Säule Microsorb C-18 (4,6 mm × 250 mm, 5 μm Teilchen mit 300 A Porengröße; Varian Analytical Instruments) wurde eingesetzt. Zwei Lösungsmittel für die mobile Phase wurden hergestellt, Lösungsmittel A war 800 g entionisiertes H₂O, 150 g Acetonitril und 0,95 Trifluoressigsäure und Lösungsmittel B war 850 g Acetonitril und 0,85 Trifluoressigsäure. Etwa 50 mg der Probe wurden zu 100 ml Lösungsmittel A gegeben. Die Probe wurde für 30 s verwirbelt und dann bei 10.000 U/min für 10 min zentrifugiert. Die überstehende Lösung wurde zur RP-HPLC-Analyse gesammelt. 100 μl der Probe wurden in die Säule injiziert, wobei die Pumpe auf 800 bis 2.500 psi, Überdruck, und eine Temperatur von 30,0°C eingestellt wurden. Weiterhin sind die Durchsatzmenge, die Zeit und die Lösungsmittelzusammensetzungen wie in Tabelle 1 ausgeführt. Die Diodenanordnung des Detektors wurde auf 220 nm eingestellt. TABELLE 1 HPLC-Bedingungen
Ein externer Standard wurde hergestellt, um eine Standardkurve zur Kalibrierung der Säule zu bilden. 5 mg BSA wurden in 10 ml Lösungsmittel A gelöst. Vier Volumen, nämlich 25, 50, 75 und 100 μl, wurden in die Säule injiziert. Eine Eichkurve wurde aus den Ergebnissen gebildet.
BEISPIEL 1
500 g Kartoffelknollen wurden mit 213 ml 1% Ameisensäure-Lösung in einem Waring-Mischer für 2,5 min extrahiert. Die Aufschlämmung wurde bei 10.000 U/min 40 min zentrifugiert. Die Flüssigkeit wurde dekantiert und durch ein Filterpapier #4 Whatman filtriert, was 486 g eines geklärten Extrakts ergab. 50 g des geklärten Extrakts wurden jeweils in sechs 125 ml Erlenmeyer-Kolben gegossen, die mit Magnetrührstäben versehen waren. Die Menge an NaCl, die Tabelle 2 entspricht, wurde zu jedem Kolben gegeben und es wurde gerührt, bis das Salz gelöst war. Die Kolben wurden dann unter Rühren auf einer Heizplatte erwärmt, bis die Temperatur des Extrakts 70°C erreichte. Nach Abkühlung in der Umgebung auf Raumtemperatur wurden die Lösungen bei 12.000 U/min 5 min zentrifugiert und dann unter Verwendung des vorstehend beschriebenen Umkehrphasen-HPLC-Verfahrens analysiert. Die angegebene Konzentration von PI2 wurde durch Integrieren der Fläche des PI2-Peaks berechnet. Das Injektionsvolumen war 100 μl und die folgende Gleichung wurde verwendet, um Peakflächen in Proteingehalte zu überführen: Peakfläche Protein (mg/ml) = [❲Peakfläche4 ❳ × 8,17 × 10–5] + 0,0338
Zu dem geklärten Kartoffelextrakt wurden variierende Mengen an Natriumchlorid gegeben und anschließend wurde 10 min auf 70°C erwärmt. Nach Abkühlen auf Raumtemperatur wurden die Lösungen bezüglich der Proteinelution nach PI2 im HPLC-Verfahren zur PI2-Quantifizierung analysiert. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt. TABELLE 2 – Proteinentfernung mit verschiedenen Natriumchlorid-Konzentrationen
Um für die Entfernung von Kunitz-Verunreinigungen aus dem Kartoffelextrakt zu sorgen, von denen gezeigt worden ist, dass sie die Wirksamkeit von PI2 zur Erhöhung der Sättigung verringern, wurde das Umkehrphasen-HPLC-Verfahren an einem im Handel erhältlichen Kunitz-Standard, der von SIGMA gekauft wurde, verwendet. Ein Chromatograph des Kunitz-Standards zeigte, dass der Hauptpeak der Kunitz-Verunreinigungen bei etwa 25 min auftrat. Ein anderer Inhibitor, von dem bekannt ist, dass er in Kartoffeln vorhanden ist, ist der Carboxypeptidase-Inhibitor. Das Umkehrphasen-HPLC-Verfahren wurde an einem im Handel erhältlichen Carboxypeptidase-Standard, der von SIGMA gekauft wurde, verwendet. Ein Chromatograph des Carboxypeptidase-Standards zeigte, dass die Hauptpeaks der Carboxypeptidase-Verunreinigungen ein Dublett sind, das bei etwa 17 min auftritt. Bei einer Konzentration von 0,3 N Natriumchlorid und darüber blieb der Proteingehalt nach Wärmebehandlung relativ konstant. Die Menge an PI2 blieb bei allen Versuchen relativ konstant, was darauf hinweist, dass bei 70°C kein PI2 bei Salzgehalten bis zu 0,5 N ausgefallen ist. Um den erforderlichen Gehalt an NaCl in der Wärmebehandlungsphase zu erreichen, ist es notwendig, ein Extraktionsmittel mit etwa dem Zweifachen der gewünschten Salz-Endkonzentration zu verwenden. Dementsprechend ist ein Salzgehalt von mindestens 0,3 N in der Extraktionslösung während der Wärmebehandlung bei 70°C zweckmäßig, um die wirksame Entfernung von Kunitz-Proteinen zu gewährleisten. Die Reinheit des PI2-Endprodukts kann durch größere Mengen an Natriumchlorid verbessert werden.
BEISPIEL 2
Eine Optimierungsstudie wurde durchgeführt, um sowohl den geeigneten NaCl-Gehalt als auch den geeigneten Ameisensäure-Gehalt der Extraktionslösung zu bestimmen. Die ideale Extraktionslösungs-Formulierung würde die Menge an PI2 maximieren, die aus der Kartoffelmatrix freigesetzt wird, während die Menge an solubilisierten Proteinverunreinigungen minimiert wird. Die Freisetzung von PI2 wurde als Ausbeute gemessen, normalisiert auf eine Extraktionslösungszusammensetzung von 1,0 N NaCl. Dies wurde aufgrund der vorher angegebenen Vorhersage als Normalisierungsbasis ausgewählt, was eine zweifacher Erhöhung von NaCl über dem 0,5 N-System erfordert, das sich zur Entfernung von Verunreinigungen in der Wärmebehandlungsstufe als wirksam erwiesen hat. Zur Optimierung wurde die PI2-Proteinreinheit gemessen und empirisch mit den normalisierten Extraktionsausbeuten verglichen. Es wurde Extraktionslösungen, die NaCl-Konzentrationen von 0,0 N bis 2,0 N enthielten, untersucht. In ähnlicher Weise wurde der Ameisensäure-Gehalt der Extraktionslösung optimiert. Ameisensäure-Gehalte im Bereich von 0,0% bis 2,5% wurden untersucht. TABELLE 3 – Natriumchlorid-Optimierungsdaten
TABELLE 4 – Natriumchlorid-Optimierungsdaten Fortsetzung
TABELLE 5 – Natriumchlorid-Optimierungsdaten Fortsetzung
TABELLE 6 – mittlere normalisierte Ausbeuten und Reinheiten mit variierendem NaCl
Obwohl eine Normalität von NaCl von 0,5 N und darüber höhere Ausbeuten ergab, wurde eine Normalität von 1,0 N ausgewählt, da sowohl Ausbeute als auch Reinheit maximiert wurden. TABELLE 7 – Ameisensäure-Optimierungsdaten
TABELLE 8 – Ameisensäure-Optimierungsdaten
TABELLE 9 – Ameisensäure-Optimierungsdaten
TABELLE 10 – mittlere normalisierte Ausbeuten und Reinheiten mit verschiedenen Ameisensäuren-Gehalten
Die Daten weisen auf den Einsatz von 1,5% Ameisensäure-Gehalt für die Extraktionslösung hin. Obwohl andere Ameisensäure-Konzentrationen ähnliche Ausbeuten liefern, maximiert ein Ameisensäure-Gehalt von 1,5% eindeutig die Reinheit.
BEISPIEL 3
Ein Versuch wurde durchgeführt, um die Wirkung der Verwendung unterschiedlicher Mengen der Extraktionslösung, die 1,5% Ameisensäure und 1,0 N NaCl in Wasser umfasst, auf die Ausbeute zu bestimmen. Das Gewichtsverhältnis von Kartoffeln zu Extraktionslösungen wurde von 1:1 bis 1:10 variiert. Die eingesetzten Verhältnisse und die beobachteten Ausbeuten sind in Tabelle 11 angegeben. TABELLE 11 – mittlere normalisierte PI1-Ausbeute und Flüssigkeitsausbeute bei unterschiedlichen Extraktionsverhältnissen
Obwohl die höchste Ausbeute mit dem höchsten Verhältnis der Extraktionslösung erreicht wird, ist der Gewinn in der Gesamtausbeute oberhalb eines Verhältnisses von 0,4:1 (1:2,5 Gew./Gew. Extraktionslösung zu Kartoffeln) minimal. Dieses Verhältnis wurde ausgewählt, um die Kosten der Extraktionslösung und den Aufwand mit der Materialhandhabung, wie Erwärmen, Kühlen und Verdampfen, zu minimieren.
Die Daten diktieren die Wahl von etwa 1,0 N Natriumchlorid als bevorzugte Konzentration in der Extraktionslösung für die Isolierung von PI2. Die Verwendung von 1,0 N Natriumchlorid führt zur Maximierung der Ausbeute von PI2 unter den geprüften Bedingungen und, obwohl andere Konzentrationen ähnliche Ausbeuten liefern können, wird die PI2-Proteinreinheit, die durch die Verwendung von 1,0 N NaCl repräsentiert wird, bei 1,0 N maximiert. Eine höhere PI2-Proteinreinheit könnte erreicht werden, indem weniger Natriumchlorid verwendet wird, dies würde aber zu einer verringerten PI2-Ausbeute führen. Dieser Gehalt an Natriumchlorid ist auch für die Entfernung der Kunitz-Verunreinigungen zweckmäßig. In ähnlicher Weise diktieren die Daten die Wahl von 1,5% Ameisensäure als bevorzugte Konzentration für die Extraktion von PI2. Eine Extraktionslösung, die 1,5% Ameisensäure enthält, zeigt ein günstiges antimikrobielles und antiproteolytisches Verhalten. Die Ausbeute von PI2 wird unter den geprüften Bedingungen bei einem Ameisensäure-Gehalt von 1,5% in der Extraktionslösung maximiert und diese Konzentration liefert auch die höchste PI2/Kunitz-Reinheit der Formulierungen, die vergleichbare Ausbeuten erzielen. Es gibt keinen signifikanten Anstieg in der Gesamtausbeute, wenn eine Aufschlämmung gebildet wird, die aus mehr als 30 Gew.-% Extraktionslösung zusammengesetzt ist. Eine Aufschlämmung von 30% Extraktionslösungszusammensetzung entspricht grob einem Teil Extraktionslösung zu 2 ½ Teilen Rohmaterial (Verhältnis Lösungsmittel:Feststoff 1:2,5).

Claims

Verfahren zur Extraktion eines Proteinase-Inhibitors aus Kartoffelknollen, die den Proteinase-Inhibitor enthalten, umfassend die folgenden Schritte: (a) Herstellen einer alkoholfreien Extraktionslösung durch Zugeben einer organischen Säure in einer Konzentration zwischen etwa 0,5 Gew.-% und etwa 2,5 Gew.-% und eines Salzes in einer Menge, um zwischen etwa 0,3 und etwa 5,0 normal Salz zu liefern, zu Wasser; (b) Zugeben des Pflanzenmaterials zur Extraktionslösung in einem Gewichtsverhältnis zwischen etwa 1:1 und etwa 1:10 Extraktionslösung zu Pflanzenmaterial; und (c) Zerkleinern des Pflanzenmaterials in der Extraktionslösung, um die mittlere Teilchengröße des Pflanzenmaterials auf zwischen etwa 100 Mikron und etwa 1.500 Mikron zu verringern, wodurch eine Aufschlämmung gebildet wird, die eine Flüssigkeits- und eine Feststofffraktion enthält; und (d) Isolieren und Reinigen des Proteinase-Inhibitors durch Zentrifugation, Klärung, Filtration und Trocknung der Flüssigkeitsfraktion.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem der Proteinase-Inhibitor Kartoffel-Proteinase-Inhibitor II ist.
Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, bei dem die organische Säure ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Essig-, Ascorbin-, Citronen- und Ameisensäure.
Verfahren nach Anspruch 3, bei dem die organische Säure Ameisensäure ist und das Salz Natriumchlorid ist.
Verfahren nach Anspruch 3, bei dem die Ameisensäure-Konzentration zwischen etwa 1,2 und 1,7 Gew.-% ist und die Natriumchlorid-Normalität zwischen etwa 0,8 und 1,5 ist.
Verfahren nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem das Gewichtsverhältnis von Extraktionslösung zu Kartoffelknolle zwischen etwa 1:1,5 und 1:4 ist.
Verfahren nach Anspruch 6, bei dem das Gewichtsverhältnis von Extraktionslösung zu Kartoffelknollen zwischen etwa 1:2 und 1:3 ist.
Verfahren nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die sich ergebende durchschnittliche Teilchengröße der Knolle in der Mischung weniger als etwa 1.000 μm ist.
Verfahren nach Anspruch 8, bei dem die Aufschlämmung unter Verwendung eines Filters mit einer Siebgröße zwischen etwa 15 μm und etwa 100 μm filtriert wird.
Verfahren nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem der Zerkleinerungsschritt die Temperatur der Aufschlämmung nicht auf über 90°C erhöht.