ES2283563T3

ES2283563T3 - Procedimiento que mejora la extracion de inhibidores de proteasa.

Info

Publication number: ES2283563T3
Application number: ES02737587T
Authority: ES
Inventors: Rod Ausich; Hal Fallert; George Mather; Robert Stomp; Fayad Sheabar; Brent Davison
Original assignee: Kemin Foods LC
Current assignee: Kemin Foods LC
Priority date: 2001-07-06
Filing date: 2002-06-20
Publication date: 2007-11-01
Anticipated expiration: 2022-06-20
Also published as: US7371418B2; US20030092150A1; JP2004531582A; US6767566B2; US20050037474A9; WO2003003838A1; JP4072122B2; ATE356146T1; EP1414307A1; EP1414307A4; DE60218694T2; DE60218694D1; US20030092152A1; EP1414307B1

Abstract

Procedimiento para la extracción de un inhibidor de proteinasa a partir de tubérculos de patata que contienen el inhibidor proteinasa, que comprende las etapas de: (a) preparar una solución de extracción libre de alcohol mediante la adición de un ácido orgánico a agua en una concentración entre aproximadamente 0, 5 por ciento en peso y aproximadamente 2, 5 por ciento en peso y una sal en una cantidad para proporcionar entre aproximadamente 0, 3 y aproximadamente 5, 0 de sal común; (b) añadir el material vegetal a la solución de extracción en una relación en peso de entre aproximadamente 1:1 y aproximadamente 1:10 de solución de extracción respecto el material vegetal; y (c) pulverizar el material vegetal en la solución de extracción para reducir el tamaño de partícula medio del material vegetal hasta entre aproximadamente 100 micras y aproximadamente 1500 micras y generando así una suspensión que contiene una fracción sólida y una líquida; y (d) aislar y purificar el inhibidor de proteinasamediante centrifugación, clarificación, filtración y secado de dicha fracción líquida.

Description

Procedimiento que mejora la extracción de inhibidores de proteasa.

Estado de la técnica anterior 1. Campo de la invención

La presente invención se refiere a un procedimiento para mejorar la extracción de un inhibidor de proteinasa, y más específicamente, a un procedimiento para mejorar el rendimiento y la pureza del Inhibidor II de Proteinasa (PI2) extraído de patatas enteras.

2. Estado de la técnica anterior

La extracción, el aislamiento y la purificación de proteínas a partir de plantas es conocido en el campo de la bioquímica. En 1972, Melville y Ryan publicaron un procedimiento de preparación a gran escala para el aislamiento del inhibidor I de quimotripsina a partir de tubérculos de patata (Melville, J.C. y Ryan, C.A. Chymotrypsin inhibitor I from potatoes. J. Biological Chem., 247: 3445-3453, 1972). Según el método de Melville y Ryan, las patatas se cortaron con la piel intacta y se pusieron en remojo en una solución de hidrosulfito de sodio, se homogeneizaron, y se exprimieron a través de tela de nylon. El zumo resultante se ajustó a pH 3, se centrifugó a 1000 x g durante 15 minutos a 5ºF, y se recogió y fraccionó el sobrenadante con sulfato de amonio.

La purificación se llevó a cabo mediante lavado en agua y tratamiento calorífico, se juntaron y liofilizaron los filtrados transparentes de las fracciones calentadas. El extracto crudo se obtuvo suspendiendo el polvo liofilizado en agua, sometiéndolo a diálisis contra agua durante 48 horas, y liofilizando el filtrado transparente resultante. A continuación, se centrifugó el extracto resuspendido y se cargó en una columna Sephadex G-75. Se juntaron las fracciones recogidas que contenían el inhibidor I, se evaporaron y se desalaron en una columna Sephadex G-25. Se determinó que el producto inhibidor resultante del filtrado en gel se purificó aproximadamente un 90% en la proteína inhibidora I mediante disociación en una columna Sephadex G-75 y desalado en una columna Sephadex G-25.

El laboratorio de Ryan continuó publicando sobre el aislamiento y la caracterización del inhibidor II de proteinasa de manera parecida a como lo describió para el inhibidor I (Bryant, J., Green, T.R., Gurusaddaiah, T., Ryan, C.L. Proteinase inhibitor II from potatoes: Isolation and characterization of its protomer components. Biochemistry 15: 3418-3424, 1976). Bryant et al. diferenciaron los inhibidores proteinasa derivados de patata en dos grupos en función de su estabilidad a una temperatura de 80ºC durante 10 minutos. El inhibidor I de proteinasa (PI_{1}) está caracterizado como una proteína tetramérica compuesta de cuatro especies protoméricas hibridadas isoinhibidoras con un peso molecular de 39.000, mientras que PI2 está caracterizado como un inhibidor dimérico que comprende cuatro especies promotoras isoinhibidoras con un peso molecular de 21.000.

El documento WO 99/01474 describe la extracción y el aislamiento de las proteínas inhibidoras de proteinasa a partir de patatas. Las proteínas de los tubérculos de patata se extraen en forma soluble con un medio de extracción acuoso/alcohol, como por ejemplo diluyendo ácido fórmico y etanol 20%. El extracto alcohólico se calienta hasta una primera temperatura para desnaturalizar la mayor parte de las proteínas no deseadas y se enfría hasta una segunda temperatura para formar una fase de precipitado que contiene los restos de éstas y una fase soluble que contiene las proteínas inhibidoras de proteinasa estables frente al calor. Las proteínas inhibidoras de proteinasa estables frente al calor se precipitan desde la fase soluble mediante diálisis contra un medio de diálisis apropiado, como por ejemplo ácido fórmico diluido.

Recientemente, se ha asociado PI2 con el aumento de la saciedad de individuos que han sido alimentados con una composición nutricional en forma de bebida que contiene PI2. El documento con número de publicación
US2002119915 describe que, al ingerir una comida que comprendía una composición nutricional en forma de bebida que contenía PI2, los individuos mostraron una reducción importante del apetito durante hasta 3 horas después de la comida. Además, se mejoró la sensación de saciedad, y cada individuo del estudio perdió una media de 2 kg en un periodo de 30 días sin experimentar los efectos secundarios adversos asociados normalmente con los compuestos para la eliminación del apetito. En relación a su mecanismo, se cree que, como inhibidor de tripsina y de quimotripsina, cuando un individuo consume PI2 estimula la liberación de colecistoquinina endógena, un agente supuestamente retroactivo conocido por que es efectivo en la reducción de la necesidad de ingerir alimento.

Los procedimientos existentes para la extracción de los inhibidores de proteinasa implican diversas etapas laboriosas y largas con lo que se pierde rendimiento y se reduce la pureza del inhibidor de proteinasa que se recupera. Además, los procedimientos más prometedores del estado de la técnica anterior se basan en la utilización de etanol en la solución de extracción que, en las concentraciones utilizadas, hace que la solución sea inflamable. Ninguno de los procedimientos del estado de la técnica anterior ha llegado a escala comercial. Por lo tanto, existe la necesidad de disponer de un procedimiento para la extracción a gran escala de PI2 de una manera efectiva y con costes apropiados que cumpla con los estándares industriales cualitativos y cuantitativos.

Resumen de la invención

Los tubérculos de patata que contienen un inhibidor de proteinasa de interés se combinan con una solución de un ácido orgánico y una sal. El material tuberculoso de patata se pulveriza, formando una suspensión en la solución de ácido y sal, para reducir el tamaño de partícula e incrementar el área superficial de las partículas para mejorar la eficiencia de la extracción. Se ha elegido un procedimiento de suspensión para reducir el tamaño de partícula sin desnaturalizar el inhibidor proteinasa de interés por causa de efectos locales de calentamiento. La solución de ácido y sal mejora la extracción del inhibidor de proteinasa a partir del material tuberculoso de patata suspendido y lo protege contra la degradación provocada por otros compuestos que pueden liberarse de las células vegetales lisadas. Una vez extraído en la solución, el inhibidor proteinasa se aísla y se purifica mediante centrifugación, clarificación, filtración y secado de la solución del extracto. El ácido y la sal se eliminan durante la etapa de filtración de manera que no se adultere el producto inhibidor de proteinasa purificado.

En una realización preferida, el inhibidor proteinasa II (PI_{2}) se extrae a partir de los tubérculos de patata enteros. Los ácidos orgánicos efectivos para el procedimiento incluyen ácido acético, ascórbico, cítrico y fórmico. El ácido fórmico resultó ser el que rindió el producto final PI2 de mayor grado de pureza y rendimiento. El contenido de ácido fórmico de la solución se ajusta al intervalo de 0,5% a 2,5% p/p, preferiblemente con un contenido de aproximadamente 1,5%. Se añade cloruro de sodio a la solución de extracción para incrementar la solubilidad de las proteínas de patata. Las concentraciones de cloruro de sodio utilizadas están entre 1 N y 3 N, preferiblemente una concentración de aproximadamente 1,5 N. La solución se añade a las patatas en una relación en peso de entre 1:1 y 1:10, preferiblemente una relación de 1:2,5 de solución de extracción:patata p/p, respectivamente.

La pulverización se lleva a cabo mediante molido. El tamaño de partícula estará comprendido en el intervalo de 100 a 1500 \mum. En este intervalo, los rendimientos del producto se incrementaron y las características de fluidez de la suspensión fueron aceptables. Al disminuir el tamaño de partícula por debajo de 100 \mum, la recuperación de PI2 fue inferior y no mejoraron las características de fluidez. El molido durante un periodo mayor de tiempo también llevó a un rendimiento inferior de PI2, se cree que a causa de un incremento de la temperatura y de la liberación de proteasas no deseadas que hacen disminuir el rendimiento de PI2. El ácido fórmico y el cloruro de sodio se eliminan eficientemente durante la etapa de filtración.

Un objeto de la presente invención es proporcionar un procedimiento mejorado para la extracción de inhibidores de proteinasa de los tubérculos de patata.

Otro objeto de la invención es proporcionar un procedimiento mejorado para la extracción de inhibidor II de proteinasa de tubérculos de patata sin utilizar etanol en la solución de extracción.

Otro objeto de la invención es proporcionar un procedimiento mejorado para la extracción de inhibidor II de proteinasa de tubérculos de patata, eficiente y rentable a escala comercial.

Descripción detallada de la invención

La extracción y aislamiento de PI2 a partir de patatas comienza con la adición de un ácido orgánico a las patatas de partida, preferiblemente ácido fórmico, y una sal, preferiblemente cloruro de sodio. La mezcla se pulveriza para reducir el tamaño de las partículas de patata y extraer proteínas solubles. Se utiliza centrifugación para eliminar sólidos y la fracción sólida se calienta a una temperatura suficiente para desnaturalizar muchas de las proteínas no deseadas, pero no el PI2. A continuación la solución se centrifuga de nuevo para eliminar las proteínas insolubles desnaturalizadas y se microfiltra la fracción líquida para eliminar las partículas relativamente grandes. La ultrafiltración se utiliza para eliminar el ácido orgánico y la sal y para purificar adicionalmente el PI2 en el concentrado.

Como intento para maximizar el rendimiento, minimizar las impurezas, minimizar el coste, y conseguir que fuera comercializable, se desarrolló un procedimiento para la extracción de PI2 a partir de patatas enteras. La solución de extracción se ensayó en base a la capacidad del procedimiento para solubilizar el PI2, proteger el PI2 de la degradación, y maximizar el PI2 total extraído de los componentes insolubles de la patata, a la vez que se minimiza la cantidad de proteínas cosolubilizadas. La solución de extracción presenta la solubilidad y estabilidad de PI2 en medio ácido y a temperaturas elevadas. Para este objetivo se ha encontrado apropiada una solución de extracción que contiene cloruro de sodio y ácido fórmico. A causa de los costes, se minimizó la relación utilizada de solución de extracción respecto al producto de partida a extraer, y a la vez se consiguió el rendimiento máximo de PI2 por kilogramo de tubérculos de patata de partida.

Método de HPLC de Fase Inversa

Las cantidades de PI2, Kunitz e inhibidores carboxipeptidasa se midieron utilizando HPLC de fase inversa. Se utilizó una columna Microsorb C-18 (4,6 mm x 250 mm, partículas de 5 \mum con 300 Angstroms de tamaño de poro; Varian Analytical Instruments). Se prepararon dos disolventes para la fase móvil, el disolvente A compuesto de 800 g de H_{2}O desionizada, 150 g de acetonitrilo, y 0,95 de ácido trifluoroacético, y el disolvente B compuesto de 850 g de acetonitrilo y 0,85 de ácido trifluoroacético. Aproximadamente 50 mg de la muestra se añadió a 100 ml del disolvente A. La muestra se mezcló en un vortex durante 30 segundos y a continuación se centrifugó a 10.000 revoluciones durante 10 minutos. El sobrenadante se recogió para someterlo a un análisis RP-HPLC. Se inyectaron en la columna 100 \mul de la muestra, con la bomba ajustada a 2500 psig, y una temperatura de 30,0ºC. Los otros caudales, tiempos, y com-
posiciones de los disolventes se ajustaron tal como se indica en la Tabla 1. El diodo del detector se ajustó a 220 nm.

TABLA 1 Condiciones HPLC

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Se preparó un patrón externo para construir una curva estándar para la calibración de la columna. Se disolvieron 5 mg de BSA en 10 ml de disolvente A. Se inyectaron cuatro volúmenes en la columna, es decir, 25, 50, 75 y 100 \mul. Con los resultados se generó una curva de calibración.

Ejemplo 1

500 gramos de tubérculos de patata se sometieron a una extracción con 213 ml de una solución de ácido fórmico al 1% en un mezclador Waring durante 2,5 minutos. La suspensión se centrifugó a 10.000 rpm durante 40 minutos. Se decantó el líquido y se filtró a través de papel de filtro Whatman #4, rindiendo 486 g de extracto clarificado. En cada uno de 6 erlenmeyers con barras magnéticas de agitación se vertieron 50 gramos de este extracto clarificado. En cada matraz se añadió la cantidad de NaCl correspondiente según la Tabla 2 y se agitó hasta que se disolvió la sal. Los matraces se calentaron sobre una placa calefactora con agitación hasta que la temperatura del extracto alcanzó 70ºC. Después de dejarlos enfriar hasta temperatura ambiente, las soluciones se centrifugaron a 12.000 rpm durante 5 minutos y a continuación se analizaron utilizando el método de HPLC de fase inversa descrito arriba. El nivel de PI2 conseguido se calculó mediante la integración del área del pico PI2. El volumen de inyección fue 100 \mul y se utilizó la siguiente ecuación para equiparar las áreas de los picos a niveles de proteínas:

Proteína (mg/ml) = [(Área del pico/4) x 8,17 x 10^{-5}] + 0,0338

Al extracto clarificado de patata se le añadieron diferentes cantidades de cloruro de sodio, a continuación se calentó a 70ºC durante 10 minutos. Después de enfriarlas hasta temperatura ambiente, se analizó la elución de proteínas PI2 de
las soluciones mediante el método de HPLC para la cuantificación de PI2. Los resultados se muestran en la Tabla 2.

TABLA 2 Eliminación de Proteínas con Diferentes Niveles de Cloruro de Sodio

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Para establecer la eliminación de las impurezas Kunitz del extracto de patata, que según se ha descrito disminuyen la efectividad de PI2 para incrementar la saciedad, se utilizó el método de HPLC de fase inversa sobre un patrón de Kunitz comercial provisto por Sigma. Un cromatograma del patrón de Kunitz reveló que el mayor pico de las impurezas Kunitz aparece aproximadamente a los 25 minutos. Otro inhibidor que se sabe presente en la patata es el inhibidor de carboxipeptidasa. Se utilizó el método de HPLC de fase inversa sobre un patrón de carboxipeptidasa comercial provisto por Sigma. El cromatograma del patrón de carboxipeptidasa reveló que los mayores picos de las impurezas carboxipeptidasa son un doblete que aparece aproximadamente a los 17 minutos. A niveles de 0,3 N de cloruro de sodio y superiores, el nivel de proteína posterior al tratamiento calorífico se mantiene relativamente constante. La cantidad de PI2 se mantiene relativamente constante en todos los ensayos, indicando que a 70ºC PI2 no precipita a niveles salinos hasta 0,5 N. Para llegar al nivel de NaCl necesario en la fase de tratamiento térmico es necesario utilizar un extractante con aproximadamente 2 veces la concentración final de sal. Así, en la solución de extracción es preferible un nivel de sal de al menos 0,3 N durante el tratamiento térmico a 70ºC para asegurar la eliminación eficaz de las proteínas de tipo Kunitz. La pureza del producto final de PI2 puede mejorarse con cantidades mayores de cloruro de sodio.

Ejemplo 2

Se realizó un estudio de optimización para determinar el contenido apropiado de NaCl y el contenido apropiado de ácido fórmico de la solución de extracción. La formulación ideal de la solución de extracción maximizaría la cantidad de PI2 liberada de la matriz de patata, a la vez que minimizaría la cantidad de contaminantes proteicos solubilizados. La liberación de PI2 se midió como rendimiento, normalizado para una composición de una solución de extracción de 1,0 N en NaCl. Se escogió ésta como base de normalización debido a la predicción previa de que el incremento del doble de NaCl por encima de 0,5 N se mostró efectivo para la eliminación de impurezas en el tratamiento térmico. Para la optimización, se midió la pureza proteica de PI2 y se comparó empíricamente con los rendimientos normalizados de extracción. Se examinaron las soluciones que contenían concentraciones de NaCl de 0,0 N a 2,0 N. De manera similar, se optimizó el contenido en ácido fórmico de la solución de extracción. Se ensayaron contenidos de ácido fórmico entre el 0,0 por ciento y el 2,5 por ciento.

TABLA 3 Datos de Optimización de Cloruro de Sodio

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TABLA 3 (continuación)

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TABLA 5 Continuación Datos de Optimización de Cloruro de Sodio

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Aunque se observó que las normalidades de 0,5 N y superiores de NaCl conducían a rendimientos altos, se seleccionó una normalidad de 1,0 N para maximizar tanto el rendimiento como la pureza.

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TABLA 10 Rendimientos y purezas medios normalizados con diferentes cantidades de ácido fórmico

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Los datos indican la utilización de un contenido de 1,5% de ácido fórmico en la solución de extracción. Aunque otras concentraciones de ácido fórmico ofrecen rendimientos similares, un contenido de 1,5% de ácido fórmico maximiza claramente la pureza.

Ejemplo 3

Se realizó un ensayo para determinar el efecto de la utilización de diferentes cantidades de la solución de extracción que comprende 1,5% de ácido fórmico y 1,0 N NaCl en agua sobre el rendimiento. La proporción en peso de las patatas respecto a la solución de extracción se modificó de 1:1 a 1:10. Las proporciones utilizadas y los rendimientos observados se muestran en la Tabla 11.

TABLA 11 Rendimiento y rendimiento neto medios normalizados de PI2 con diferentes relaciones de extracción

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Aunque el mayor rendimiento se obtuvo con el mayor porcentaje de solución de extracción, la ganancia total en rendimiento es mínima por encima de la relación 0,4 hasta uno (1:2,5 p/p solución de extracción respecto patatas, respectivamente). Se ha seleccionado esta relación con el objetivo de minimizar el coste de la solución de extracción y los problemas de la manipulación de los materiales, tales como calentamiento, enfriamiento y evaporación.

Los datos dictaron la elección de 1,0 N de cloruro de sodio como la concentración preferida en la solución de extracción para el aislamiento de PI2. La utilización de 1,0 N de cloruro de sodio resulta en un rendimiento maximizado de PI2 en las condiciones ensayadas, y aunque otras concentraciones llevan a rendimientos similares, la pureza de la proteína PI2 conseguida con la utilización de 1,0 N de NaCl está maximizada a 1,0 N. Pueden conseguirse mayores purezas de PI2 mediante la utilización de menos cloruro de sodio, aunque eso representaría una reducción del rendimiento de PI2. Este nivel de cloruro de sodio también es apropiado para la eliminación de las impurezas de tipo Kunitz. De manera similar, los datos llevan a la selección de 1,5% de ácido fórmico como la concentración preferida para la extracción de PI2. Una solución de extracción que contiene 1,5% de ácido fórmico muestra un comportamiento antimicrobiano y antiproteolítico beneficioso. El rendimiento de PI2 se maximiza en las condiciones ensayadas con una solución de extracción con un contenido de 1,5% en ácido fórmico, y esta concentración también proporciona la pureza más alta en PI2/Kunitz de las formulaciones con rendimientos comparables. No hay un incremento significativo en el rendimiento total cuando se crea una suspensión que está compuesta de un porcentaje mayor al 30% en peso de solución de extracción. Una suspensión del treinta por ciento en solución de extracción es aproximadamente equivalente a una parte de solución de extracción y una parte y media de material de partida (1:2,5 relación solvente:sólido).

Claims

1. Procedimiento para la extracción de un inhibidor de proteinasa a partir de tubérculos de patata que contienen el inhibidor proteinasa, que comprende las etapas de:

(a) preparar una solución de extracción libre de alcohol mediante la adición de un ácido orgánico a agua en una concentración entre aproximadamente 0,5 por ciento en peso y aproximadamente 2,5 por ciento en peso y una sal en una cantidad para proporcionar entre aproximadamente 0,3 y aproximadamente 5,0 de sal común;

(b) añadir el material vegetal a la solución de extracción en una relación en peso de entre aproximadamente 1:1 y aproximadamente 1:10 de solución de extracción respecto el material vegetal; y

(c) pulverizar el material vegetal en la solución de extracción para reducir el tamaño de partícula medio del material vegetal hasta entre aproximadamente 100 micras y aproximadamente 1500 micras y generando así una suspensión que contiene una fracción sólida y una líquida; y

(d) aislar y purificar el inhibidor de proteinasa mediante centrifugación, clarificación, filtración y secado de dicha fracción líquida.

2. Procedimiento según la reivindicación 1 donde el inhibidor de proteinasa es inhibidor II de proteinasa de patata.

3. Procedimiento según la reivindicación 1 o la reivindicación 2 donde el ácido orgánico se selecciona del grupo que consiste en ácido acético, ácido ascórbico, ácido cítrico y ácido fórmico.

4. Procedimiento según la reivindicación 3 donde el ácido orgánico es ácido fórmico y la sal es cloruro de sodio.

5. Procedimiento según la reivindicación 3 donde la concentración de ácido fórmico está entre aproximadamente 1,2 y 1,7 por ciento en peso, y la normalidad del cloruro de sodio está entre aproximadamente 0,8 y 1,5.

6. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores donde la relación en peso de la solución de extracción y el tubérculo de patata está entre aproximadamente 1:1,5 y 1:4.

7. Procedimiento según la reivindicación 6 donde la relación en peso entre la solución de extracción y los tubérculos de patata está entre aproximadamente 1:2 y 1:3.

8. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores donde el tamaño de partícula de tubérculo medio en la mezcla es inferior a aproximadamente 1000 \mum.

9. Procedimiento según la reivindicación 8 donde la suspensión se filtra utilizando un filtro con un tamaño de malla entre aproximadamente 15 \mum y aproximadamente 100 \mum.

10. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores donde la etapa de suspensión no eleva la temperatura de la suspensión por encima de 90ºC.