BR112021014081A2

BR112021014081A2 - Purificação de proteínas derivadas de plantas.

Info

Publication number: BR112021014081A2
Application number: BR112021014081-6A
Authority: BR
Inventors: Nicholas Partain; Joshua D. Morton; Barry Bratcher; John-Paul Mua; Kyle Ford
Original assignee: R. J. Reynolds Tobacco Company
Priority date: 2019-01-18
Filing date: 2020-01-16
Publication date: 2021-09-21
Also published as: US11523623B2; US20200229461A1; EP3911167A1; US20230056300A1; WO2020148704A1

Abstract

purificação de proteínas derivadas de plantas. a divulgação descreve métodos para a purificação de extratos enriquecidos com proteínas para fornecer concentrados e isolados e métodos para a incorporação dos referidos materiais nos produtos. os métodos de purificação são adaptados para a remoção de, por exemplo, clorofila e podem, assim, proporcionar o clareamento da cor dos extratos enriquecidos com proteínas. os métodos geralmente incluem o tratamento com ácido peracético ou peróxido de hidrogênio e filtrações. uma composição de proteína na forma de um concentrado ou isolado é fornecida, a composição de proteína incluindo rubisco, proteínas da fração f2, ou combinações dos mesmos extraído a partir de um material vegetal.

Description

PURIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS DERIVADAS DE PLANTAS CAMPO

[001] A presente divulgação se refere principalmente a materiais derivados de fontes vegetais e a métodos para a obtenção e purificação dos referidos materiais. Os materiais purificados aqui fornecidos são também aqui descritos.

ANTECEDENTES

[002] As proteínas são cadeias de aminoácidos as quais são importantes para o corpo humano. As proteínas são o principal componente estrutural de todas as células do corpo, incluindo células de órgãos, músculos, cabelos e pele. As proteínas fornecem inúmeras funções benéficas dentro do corpo, incluindo ajudar a fazer novas células, reparar células existentes e servir como uma fonte de energia para o corpo. Algumas proteínas transportam e armazenam moléculas (por exemplo, a hemoglobina, que transporta oxigênio) e algumas proteínas estão envolvidas na criação de hormônios que ajudam a controlar certas funções dentro do corpo. As deficiências de proteínas podem levar a uma série de sintomas, como apatia, diarreia, inatividade, falta de crescimento, pele escamosa, edema, etc., e pode, em casos extremos, resultar em retardo mental ou morte.

[003] Para fornecer a gama de funções necessárias referenciadas acima, o corpo humano fabrica proteínas usando a proteína consumida, referida como "proteína dietética". A dose diária recomendada nos EUA para proteína é de 56 gramas de proteína por dia para homens com idade entre 19 - 70 e 46 gramas de proteína por dia para mulheres com idade entre 19 - 70. Homens e mulheres mais ativos (incluindo atletas) devem consumir quantidades maiores. A proteína dietética pode ser fornecida a partir de plantas (referida como “proteína derivada de planta”) e de animais (referida como “proteína derivada de animal”).

[004] Vários métodos de extração de proteínas a partir de uma ampla gama de plantas são conhecidos. Vide, por exemplo, FR2294647A1 para Frence Luzerne; CN20081222305; WO2002/005922A1 para Petasch; patente norte- americana no. US 2,600,903 para Harry; patente norte- americana no. US 3,823,128 para Bickoff et al.; patente norte-americana no. US 3,959,246 para Bickoff et al.; patente norte-americana no. US 4,077,950 para White; patente norte-americana no. US 6,284,875 para Turpen et al.; patente norte-americana no. US 6,703,051 para Bates et al.; Publicação do pedido de patente norte-americano no. US 2008/0181999 para Yang, os quais são todos aqui incorporados por referência na sua totalidade.

[005] Os referidos métodos (e outros conhecidos na técnica) comumente resultam no fornecimento de um material contendo proteína que contém um ou mais componentes além da proteína e pode ser desejável purificar ainda mais o material contendo proteína para diminuir o conteúdo do um ou mais componentes. Como tal, seria desejável fornecer métodos adicionais para extrair e / ou purificar materiais contendo proteínas, por exemplo, fornecendo uma composição de proteína derivada de planta purificada para uso em vários produtos.

SUMÁRIO

[006] A presente divulgação fornece materiais derivados de plantas. Em algumas modalidades, os materiais são fornecidos no que pode ser considerado uma forma substancialmente purificada. A divulgação também fornece métodos para a obtenção e a purificação de componentes de plantas, e métodos para o posterior processamento desses componentes. Em particular, a divulgação fornece materiais enriquecidos com proteínas, bem como concentrados, isolados e outras formas de produtos contendo proteínas derivados de um ou mais materiais vegetais (e particularmente, tais concentrados, isolados e outras formas com conteúdo reduzido de, por exemplo, clorofila, e / ou com cor mais clara). A divulgação fornece ainda métodos para a obtenção dos referidos materiais enriquecidos com proteínas, concentrados, isolados, e outras formas de produtos contendo proteínas, e métodos para a incorporação dos referidos concentrados de proteínas, isolados, e outras formas de produtos contendo proteínas em vários tipos de composições e produtos.

[007] Em um aspecto, a divulgação fornece um método para a purificação de um material enriquecido com proteínas derivadas de plantas, o método compreendendo: a) receber um material derivado de planta, enriquecido com proteínas compreendendo RuBisCO, proteínas da fração F2, ou uma combinação dos mesmos, em que o material derivado de planta, enriquecido com proteínas ainda compreende cor indesejável; b) tratar o material derivado de planta, enriquecido com proteínas com ácido peracético para fornecer uma mistura tratada com ácido peracético; c) lavar a mistura tratada com ácido peracético com água em um filtro, em que um material sólido tratado contendo proteína é retido no filtro; d) solubilizar o material sólido tratado contendo proteína para fornecer uma solução e ajustar o pH da solução a um pH básico para fornecer uma solução básica; e e) processar a solução básica em um filtro para permitir um retentado compreendendo um concentrado ou isolado de proteína tendo uma cor mais clara em comparação com o material derivado de planta, enriquecido com proteínas.

[008] Em determinadas modalidades, a cor indesejável é verde. Os tipos específicos de planta a partir das quais o material derivado de planta, enriquecido com proteínas é obtido pode variar. Em determinadas modalidades, o material derivado de planta, enriquecido com proteínas compreende material a partir de uma planta compreendendo folhas verdes. Em algumas modalidades, o material derivado de planta, enriquecido com proteínas compreende material a partir de uma planta selecionada a partir do grupo que consiste em árvores, arbustos, gramíneas, samambaias, vinhas, musgos, algas, ervas, ou uma combinação dos mesmos. Em determinadas modalidades específicas, o material derivado de planta, enriquecido com proteínas compreende material a partir de uma planta selecionada a partir do grupo que consiste em espinafre, alfafa, acelga, couve, chicória, amaranto, folhas de cevada, folhas de mostarda, trevo, folhas de cenoura, folhas de beterraba, gramíneas (por exemplo, grama de trigo, grama de pomar, e / ou switchgrass) e combinações dos mesmos. Em determinadas modalidades, o material derivado de planta, enriquecido com proteínas compreende material a partir de alfafa, e em determinadas modalidades,

o material derivado de planta, enriquecido com proteínas consiste essencialmente em material de alfafa.

[009] Em algumas modalidades, a etapa de tratamento b) é conduzida a um pH de cerca de 3 a cerca de

5. A etapa de tratamento b) é, em algumas modalidades, conduzida a uma temperatura de cerca de 25 °C a cerca de 42 °C. Em algumas modalidades, a etapa de tratamento b) compreende tratar o material derivado de planta, enriquecido com proteínas com ácido peracético na forma de uma solução aquosa compreendendo pelo menos cerca de 3 % em peso de ácido peracético.

[0010] Em algumas modalidades, a etapa c) compreende lavar a mistura tratada com ácido peracético com água em um filtro de poro de 1.4 µm. Em algumas modalidades, a etapa c) compreende lavar a mistura tratada com ácido peracético com água tendo um pH de menos de cerca de 5.

[0011] Em algumas modalidades, a etapa d) compreende ressolubilizar o material sólido tratado contendo proteína em uma solução aquosa. Em algumas modalidades, a etapa e) compreende processar a solução básica em um filtro de 10 nm. O método divulgado pode, em algumas modalidades, ainda compreender a secagem por pulverização do concentrado ou isolado de proteína.

[0012] Em determinadas modalidades, o concentrado ou isolado de proteína compreende cerca de 60 % ou mais de RuBisCO, proteínas da fração F2, ou uma combinação dos mesmos em peso. Em modalidades adicionais, o concentrado ou isolado de proteína compreende cerca de 70 % ou mais ou cerca de 80 % ou mais de RuBisCO, proteínas da fração F2,

ou uma combinação dos mesmos em peso. Por exemplo, o concentrado ou isolado de proteína pode compreender cerca de 60 % ou mais de RuBisCO em peso, cerca de 70 % ou mais de RuBisCO em peso, ou cerca de 80 % ou mais de RuBisCO em peso. Em modalidades adicionais, o método divulgado ainda compreende incorporar o concentrado ou isolado de proteína em uma composição para consumo humano ou animal.

[0013] Em outro aspecto, a presente divulgação fornece suplementos dietéticos, alimentos, bebidas, itens de higiene pessoal, produtos farmacêuticos ou alimentos para animais compreendendo a composição de proteína (por exemplo, concentrado ou isolado) aqui descrita ou produzida pelos processos aqui descritos.

[0014] A presente divulgação inclui, sem limitação, as seguintes modalidades.

[0015] Modalidade 1: Um método para a purificação de um material enriquecido com proteínas derivadas de plantas, o método compreendendo: a) receber um material derivado de planta, enriquecido com proteínas compreendendo RuBisCO, proteínas da fração F2, ou uma combinação dos mesmos, em que o material derivado de planta, enriquecido com proteínas ainda compreende cor indesejável; b) tratar o material derivado de planta, enriquecido com proteínas com ácido peracético para fornecer uma mistura tratada com ácido peracético; c) lavar a mistura tratada com ácido peracético com água em um filtro, em que um material sólido tratado contendo proteína é retido no filtro; d) solubilizar o material sólido tratado contendo proteína para fornecer uma solução e ajustar o pH da solução a um pH básico para fornecer uma solução básica; e e) processar a solução básica em um filtro para permitir um retentado compreendendo um concentrado ou isolado de proteína tendo uma cor mais clara em comparação com o material derivado de planta, enriquecido com proteínas.

[0016] Modalidade 2: O método da modalidade anterior, em que a cor indesejável é verde.

[0017] Modalidade 3: O método de qualquer modalidade anterior, em que o material derivado de planta, enriquecido com proteínas compreende material a partir de uma planta compreendendo folhas verdes.

[0018] Modalidade 4: O método de qualquer modalidade anterior, em que o material derivado de planta, enriquecido com proteínas compreende material a partir de uma planta selecionada a partir do grupo que consiste em árvores, arbustos, gramíneas, samambaias, vinhas, musgos, algas, ervas, ou uma combinação dos mesmos.

[0019] Modalidade 5: O método de qualquer modalidade anterior, em que o material derivado de planta, enriquecido com proteínas compreende material a partir de uma planta selecionada a partir do grupo que consiste em espinafre, alfafa, acelga, couve, chicória, amaranto, folhas de cevada, folhas de mostarda, trevo, folhas de cenoura, folhas de beterraba e combinações das mesmas.

[0020] Modalidade 6: O método de qualquer modalidade anterior, em que o material derivado de planta, enriquecido com proteínas compreende material a partir de alfafa.

[0021] Modalidade 7: O método de qualquer modalidade anterior, em que a etapa de tratamento b) é conduzida a um pH de cerca de 3 a cerca de 5.

[0022] Modalidade 8: O método de qualquer modalidade anterior, em que a etapa de tratamento b) é conduzida a uma temperatura de cerca de 25 °C a cerca de 42 °C.

[0023] Modalidade 9: O método de qualquer modalidade anterior, em que a etapa de tratamento b) compreende tratar o material derivado de planta, enriquecido com proteínas com ácido peracético na forma de uma solução aquosa compreendendo pelo menos cerca de 3 % em peso de ácido peracético.

[0024] Modalidade 10: O método de qualquer modalidade anterior, em que a etapa c) compreende lavar a mistura tratada com ácido peracético com água em um filtro de poro de 1.4 µm.

[0025] Modalidade 11: O método de qualquer modalidade anterior, em que a etapa c) compreende lavar a mistura tratada com ácido peracético com água tendo um pH de menos de cerca de5.

[0026] Modalidade 12: O método de qualquer modalidade anterior, em que a etapa d) compreende ressolubilizar o material sólido tratado contendo proteína em uma solução aquosa.

[0027] Modalidade 13: O método de qualquer modalidade anterior, em que a etapa e) compreende processar a solução básica em um filtro de 10 nm.

[0028] Modalidade 14: O método de qualquer modalidade anterior, ainda compreendendo a secagem por pulverização o concentrado ou isolado de proteína.

[0029] Modalidade 15: O método de qualquer modalidade anterior, em que o concentrado ou isolado de proteína compreender cerca de 60 % ou mais de RuBisCO, proteínas da fração F2, ou uma combinação dos mesmos em peso.

[0030] Modalidade 16: O método de qualquer modalidade anterior, em que o concentrado ou isolado de proteína compreender cerca de 60 % ou mais de RuBisCO em peso.

[0031] Modalidade 17: O método de qualquer modalidade anterior, em que o concentrado ou isolado de proteína compreender cerca de 70 % ou mais de RuBisCO em peso.

[0032] Modalidade 18: O método de qualquer modalidade anterior, em que o concentrado ou isolado de proteína compreender cerca de 80 % ou mais de RuBisCO em peso.

[0033] Modalidade 19: O método de qualquer modalidade anterior, ainda compreendendo incorporar o concentrado ou isolado de proteína em uma composição para consumo humano ou animal.

[0034] Essas e outras características, aspectos e vantagens da divulgação serão evidentes a partir da leitura da descrição detalhada a seguir junto com os desenhos anexos, que são brevemente descritos a seguir. A invenção inclui qualquer combinação de duas, três, quatro ou mais das modalidades mencionadas acima, bem como combinações de quaisquer duas, três, quatro ou mais características ou elementos estabelecidos nesta divulgação, independentemente de as referidas características ou elementos serem expressamente aqui combinados em uma descrição de modalidade específica. Esta divulgação se destina a ser lida holisticamente, de modo que quaisquer características ou elementos separáveis da invenção divulgada, em qualquer um de seus vários aspectos e modalidades, devem ser vistos como pretendidos a serem combináveis, a menos que o contexto claramente dite o contrário. Outros aspectos e vantagens da presente invenção se tornarão evidentes a partir do seguinte.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0035] A fim de fornecer uma compreensão das modalidades da invenção, é feita referência aos desenhos anexos, que não são necessariamente desenhados em escala, e nos quais os números de referência se referem a componentes de modalidades exemplares. Os desenhos são apenas exemplificativos e não devem ser interpretados como limitantes da invenção.

[0036] A FIG. 1 é um fluxograma das etapas do método associado a determinadas modalidades da presente divulgação;

[0037] A FIG. 2 é um gráfico de resultados experimentais com respeito à quantidade de proteína obtida a partir de plantas de alfafa em comparação com a quantidade de proteína obtida a partir de plantas de tabaco;

[0038] A FIG. 3 demonstra o RuBisCO presente em uma extração experimental de alfafa, mostrando proteína presente em várias etapas do processo;

[0039] A FIG. 4A é um gráfico de barras da pureza do RuBisCO obtido a partir de duas extrações de alfafa em comparação com o RuBisCO obtido a partir de uma extração experimental de tabaco (AAA: análise de aminoácidos);

[0040] FIG. 4B é um gráfico de barras da proteína total obtida a partir das extrações de alfafa e da extração de tabaco mostrada na FIG. 4A; e

[0041] FIG. 5 é uma tabela que mostra a recuperação de proteína de alfafa e a proteína com base no total de plantas não colhidas no campo.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0042] A presente invenção será descrita mais detalhadamente a seguir. Esta invenção pode, no entanto, ser realizada em muitas formas diferentes e não deve ser interpretada como limitada às modalidades aqui estabelecidas; em vez disso, essas modalidades são fornecidas de modo que esta divulgação seja minuciosa e completa, e transmita totalmente o escopo da invenção aos versados na técnica. Conforme usado nesta especificação e nas reivindicações, as formas singulares “um”, “uma”, e “o/a” incluem referentes plurais, a menos que o contexto indique claramente o contrário. A referência a “porcentagem de peso seco” ou “base de peso seco” se refere ao peso com base em ingredientes secos (ou seja, todos os ingredientes, exceto água).

[0043] Geralmente, a presente divulgação fornece métodos para a obtenção e / ou purificação de extratos de proteína derivados de biomassa. O método para a obtenção de extratos de proteínas derivadas de biomassa geralmente compreende extrair uma biomassa com um solvente e submeter o extrato resultante a várias etapas de processamento, por exemplo, incluindo, mas não se limitando a, etapas de filtração. Com frequência, os métodos de derivar proteínas de várias biomassas resulta em um material enriquecido com proteínas que não é a proteína pura e que pode conter vários outros componentes extraídos da biomassa. Por exemplo, em determinadas modalidades, o material enriquecido com proteína bruta extraído da biomassa pode compreender ainda substâncias como lipídios, clorofila, taninos, minerais, componentes estruturais das plantas e pigmentos fenólicos.

[0044] Os métodos descritos aqui são amplamente adequados para a obtenção e / ou purificação de material enriquecido com proteína derivada a partir de qualquer planta compreendendo folhas verdes e / ou qualquer planta que se acredite compreender proteínas. Em algumas modalidades, os métodos são aplicáveis a árvores, arbustos, gramíneas, samambaias, vinhas, musgos, algas e ervas. Por exemplo, os métodos para a preparação e purificação de um material enriquecido com proteína de acordo com a presente divulgação são, em algumas modalidades, aplicáveis às plantas tais como espinafre, alfafa, acelga, couve, chicória, amaranto, folhas de cevada, folhas de mostarda, trevo, folhas de cenoura, folhas de beterraba e combinações das mesmas, bem como vários tipos de gramíneas (por exemplo, grama de trigo, grama de pomar, e / ou switchgrass).

[0045] Uma porção ou porções colhidas da planta podem ser fisicamente processadas antes da extração / purificação. Uma porção ou porções da planta podem ser separadas em partes ou pedaços individuais (por exemplo, as raízes podem ser removidas dos caules, os caules podem ser removidos dos talos, as folhas podem ser retiradas dos talos e / ou caules, as pétalas podem ser retiradas da porção restante da flor). Embora qualquer parte da planta ou várias partes da planta possam ser usadas de acordo com o método presentemente divulgado, folhas podem ser preferencialmente usadas, embora em algumas modalidades, talo ou ambos os talos e folhas são usados. A porção ou porções da planta colhida podem ser subdivididas em partes ou pedaços (por exemplo, desfiado, cortado, triturado, pulverizado, moído ou moído em pedaços ou partes que podem ser caracterizadas como pedaços do tipo enchimento, grânulos, particulados ou pós finos). A porção ou porções da planta colhida podem ser submetidas a forças externas ou pressão (por exemplo, sendo prensadas ou submetidas a tratamento de rolo). Ao realizar tais condições de processamento, a porção colhida ou porções da planta podem ter um teor de umidade próximo ao seu teor de umidade natural (por exemplo, seu teor de umidade imediatamente após a colheita), um teor de umidade obtido pela adição de umidade à porção colhida ou porções da planta, ou um teor de umidade que resulta da secagem da porção colhida ou porções da planta.

[0046] Conforme observado aqui acima, de acordo com a presente divulgação, material enriquecido com proteína é fornecido através do tratamento de um material vegetal colhido (também referido aqui como “biomassa” ou “biomassa vegetal”). A biomassa pode ser qualquer um de uma variedade de tipos de plantas ou uma combinação de dois ou mais tipos de plantas. O termo “biomassa” e termos relacionados, como “biomatéria”, “biomassa vegetal” e “fonte vegetal” são entendidos como se referindo a qualquer parte de uma planta colhida que pode ser processada para extrair, separar ou isolar componentes de interesse da mesma. O processamento pode ser realizado em relação a várias plantas ou porções das mesmas, tais como sementes, flores, caules, talos, raízes, tubérculos, folhas, e / ou quaisquer outras porções da planta. A planta pode ser colhida na forma imatura ou madura, sendo tipicamente processada (por exemplo, extraída) na forma verde.

[0047] A biomassa vegetal pode ser submetida a vários processos de tratamento antes da extração e / ou purificação, tais como, refrigeração, congelamento, secagem (por exemplo, liofilização ou secagem por pulverização), irradiação, amarelamento, aquecimento, cozimento (por exemplo, assar, fritar ou ferver), fermentação, branqueamento ou de outra forma submetido ao armazenamento ou tratamento para uso posterior. Em algumas modalidades, material vegetal colhido pode ser pulverizado com um tampão ou antioxidante (por exemplo, um tampão de metabissulfito de sódio) para evitar que as plantas verdes dourem antes de um tratamento posterior tal como aqui descrito. Outras técnicas de processamento exemplares são descritas, por exemplo, nas publicações dos pedidos de patente norte- americanos nos. US 2009/0025739 para Brinkley et al. e US 2011/0174323 para Coleman, III et al., os quais são aqui incorporados por referência. Pelo menos uma porção da planta pode ser tratada com enzimas e / ou probióticos antes ou após a colheita, conforme discutido (em relação às plantas da espécie Nicotiana) no pedido de patente norte- americano no. US 13/444,272 para Marshall et al., depositado em 11 de abril de 2012 e no pedido de patente norte-americano no. US 13/553,222 para Moldoveanu,

depositado em 19 de julho de 2012, os quais são aqui incorporados por referência.

[0048] A divulgação, em algumas modalidades, fornece métodos para a obtenção de material enriquecido com proteínas, geralmente compreendendo receber um material vegetal; colocar o material vegetal em contato com um solvente por um tempo e em condições suficientes para extrair uma ou mais proteínas do material vegetal no solvente e formar um extrato contendo proteína líquida; separar um material vegetal sólido extraído do extrato contendo proteína líquida; clarificar o extrato contendo proteína líquida para formar um extrato contendo proteína clarificada e uma fração de sólidos; e tratar o extrato contendo proteína clarificada de modo a fornecer um material enriquecido com proteína compreendendo uma porcentagem relativamente alta de proteína em peso seco (por exemplo, pelo menos cerca de 60 % de proteína em peso seco).

[0049] Por “material enriquecido com proteína” significa um material (por exemplo, um extrato) que foi derivado de uma planta e que contém um ou mais tipos de proteína. O material enriquecido com proteína bruto tal como aqui descrito geralmente compreende uma quantidade de componentes / impurezas indesejáveis, tais como cinzas, sais de metal, traços de metais, precipitados, clorofila, e outros materiais residuais. Ainda, o material enriquecido com proteínas pode apresentar características sensoriais ou organolépticas indesejáveis (por exemplo, características de sabor, odor, e / ou cor).

[0050] A divulgação também fornece um método de processamento posterior do referido material enriquecido com proteína (obtido do método referenciado aqui acima ou por outros métodos), para fornecer uma composição de proteína mais pura, tal como uma composição na forma de um concentrado ou isolado. Por “concentrado de proteína” tal como aqui utilizado significa um material compreendendo entre cerca de 29 % e cerca de 89 % em peso de proteína em uma base de peso seco. Por “isolado de proteína” tal como aqui utilizado significa um material compreendendo cerca de 90 % ou mais de proteína em peso em uma base de peso seco. Em algumas modalidades, a divulgação fornece métodos para a purificação de material enriquecido com proteínas para fornecer concentrados e / ou isolados contendo quantidades mínimas de certos componentes / impurezas indesejáveis. Com relação aos vários tipos de materiais vegetais tal como aqui descrito, o processo pode, em algumas modalidades, isolar proteínas de todos os outros compostos vegetais, incluindo, mas não se limitando a, amidos, fibras, açúcares, cinzas e outras moléculas, clorofila, etc.

[0051] Vários métodos aqui divulgados podem fornecer concentrados e isolados de proteína derivada de planta purificada com pouca ou nenhuma coloração (por exemplo, pouca ou nenhuma coloração verde). Vantajosamente, o método de purificação divulgado remove efetivamente clorofila / cor do material. A capacidade de remover a cor é única, visto que muitas outras proteínas derivadas de plantas não são extraídas da folha verde; nas quais (como na maioria das modalidades aqui descritas), a proteína é derivada da folha verde, a coloração é muitas vezes considerada indesejável no contexto de um concentrado /

isolado de proteína, e é vantajosamente removido (conforme fornecido aqui). Em algumas modalidades, o método divulgado de purificação ainda remove sabor / gosto indesejável (por exemplo, um sabor “vegetal” percebido).

[0052] Em algumas modalidades, os processos podem ser adaptados para a obtenção e / ou purificação de material enriquecido com proteínas compreendendo um ou mais tipos específicos de proteínas ou podem ser utilizados para misturas de duas ou mais proteínas com propriedades diferentes, por exemplo, diferentes solubilidades, tipos de compostos, propriedades químicas de compostos, propriedades físicas de compostos, ou similares. Geralmente, a porção solúvel em água da biomassa vegetal consiste em duas frações. Uma fração compreende predominantemente RuBisCO, cuja subunidade de peso molecular é cerca de 550 kD. RuBisCO pode compreender até cerca de 25 % do conteúdo total de proteína de uma folha e até cerca de 10 % da matéria sólida de uma folha. Uma segunda fração (“proteína da Fração 2” ou “proteína F2”) geralmente contém uma mistura de proteínas e peptídeos com pesos moleculares que variam de cerca de 3 kD a cerca de 100 kD e também pode conter outros compostos, incluindo açúcares, vitaminas, alcaloides, sabores e aminoácidos.

[0053] Em modalidades particulares, a(s) proteína(s) do material enriquecido com proteína obtida e / ou tratada de acordo com os métodos aqui fornecido (bem como a(s) proteína(s) no concentrado e / ou isolado resultante descrito) compreendem RuBisCO e / ou proteínas F2. Em particular, a RuBisCO é ribulose-1,5-bisfosfato carboxilase oxigenase e é amplamente considerada a proteína mais abundante do mundo, pois está presente em todas as plantas submetidas à fotossíntese. A RuBisCO é essencial para a etapa inicial de fixação fotossintética do dióxido de carbono e atua catalisando a carboxilação e / ou oxigenação da ribulose-1,5-bisfosfato. Para muitas aplicações (por exemplo, produtos alimentares, produtos para rações e produtos industriais), pode ser desejável substituir certas proteínas animais com proteínas vegetais. Além disso, em algumas aplicações, pode ser desejável substituir certas proteínas de outras plantas (por exemplo, proteínas de soja e / ou proteínas geneticamente modificadas). A RuBisCO mostrou exibir boas propriedades nutricionais e é incolor, insípida e inodora. Além disso, certas propriedades físicas de RuBisCO a tornam vantajosa para uso em tais produtos, uma vez que tem excelente comportamento de ligação, gelificação, solubilidade e emulsificação.

[0054] Vários métodos foram propostos para a extração de RuBisCO e / ou outras proteínas a partir de uma ampla gama de materiais vegetais. Por exemplo, vide as patentes norte-americanas nos. US 4,268,632 para Wildman et al., US 4,340,676 para Bourke; US 4,400,471 para Johal; US 4,588,691 para Johal; e US 6,033,895 para Garger et al., as quais são aqui incorporadas por referência em sua totalidade. Meios exemplificativos para extrair RuBisCO da alfafa, por exemplo, são descritos em Pick-Seng et al., J. Food Sci., 1972, Volume 37 (1): pp. 94 - 99, Kobbi et al., Waste and Biomass Valorization, Março de 2017, Volume 8 (2); pp. 493 - 504, e Lamsal et al., LWT, 2007, Volume 40; pp. 1520 - 1526, os quais são aqui incorporados por referência em sua totalidade. Em determinadas modalidades, o material enriquecido com proteínas é preparado de acordo com os métodos comparáveis àqueles descritos na patente norte-americana no. US 9,301,544 para Mua et al., a qual é aqui incorporada por referência, a matéria da qual é aqui resumidamente descrita.

[0055] De acordo com a divulgação da patente ‘544, um conjunto exemplar de etapas de processamento que podem ser realizadas para obter um extrato enriquecido com RuBisCO e / ou um extrato enriquecido com proteína F2 de uma planta ou porção desta pode incluir as seguintes etapas. Um material vegetal é homogeneizado para fornecer uma polpa sólida e um extrato líquido contendo proteínas (“suco verde”). O extrato é clarificado para remover sólidos do mesmo, dando uma fração de sólidos e um extrato contendo proteína clarificada. O extrato é então ajustado para pH e separado em um componente líquido e um precipitado contendo proteína sólida. O precipitado compreende geralmente RuBisCO, bem como vários componentes adicionais. O pH nesta etapa é vantajosamente mantido entre 6,5 e 8, o qual em algumas modalidades é mantido durante todo o processo de purificação. Onde uma quantidade significativa de fração F2 está contida no componente líquido, esse componente líquido pode ser tratado, por exemplo, por filtração (por exemplo, através de um filtro ou membrana na qual as proteínas F2 são geralmente retidas, embora permitindo que alguns componentes restantes atravessem).

[0056] Um processo exemplar alternativo divulgado na patente ‘544 para a produção de um material enriquecido com RuBisCO e proteína F2, material enriquecido com RuBisCO, e / ou material enriquecido com proteína F2 compreende as etapas a seguir. Um material vegetal pode ser homogeneizado para fornecer uma polpa sólida e um extrato líquido contendo proteínas. O extrato pode então ser clarificado para remover sólidos dele (por exemplo, por meio de um ajuste de pH, uma etapa para fornecer um extrato contendo proteína, ácido ou básico, clarificado), fornecendo uma fração de sólidos e um extrato contendo proteína clarificada. O extrato é filtrado e lavado para fornecer um sólido, material enriquecido com RuBisCO, e um permeado. Em determinadas modalidades, o permeado pode compreender proteínas F2 e o permeado pode, opcionalmente, ser processado (por exemplo, incluindo por meio de métodos de filtração) para fornecer um material enriquecido com proteína F2.

[0057] Quaisquer modificações nas etapas destes métodos para fornecer um material enriquecido com proteína que são funcionalmente equivalentes aos procedimentos e condições geralmente divulgados aqui ou na patente '544 estão dentro do escopo da presente divulgação. Por exemplo, processos de separação típicos podem incluir uma ou mais etapas de processos tais como extração por solvente (por exemplo, usando solventes polares, solventes orgânicos, ou fluidos supercríticos), cromatografia (por exemplo, cromatografia líquida preparativa), clarificação, destilação, filtração (por exemplo, ultrafiltração), recristalização, e / ou partição solvente - solvente. Em algumas modalidades, pode ser vantajoso conduzir a extração de solvente usando um líquido de extração a frio (por exemplo, água), particularmente antes de uma etapa de filtração subsequente. As extrações são comumente conduzidas em temperatura elevada; no entanto, submeter os extratos resultantes das referidas extrações diretamente à filtração pode danificar os filtros, devido ao calor associado aos extratos e, assim sendo, extratos quentes / mornos são normalmente resfriados antes das etapas de filtração subsequentes. Esta etapa de resfriamento pode ser evitada em algumas modalidades pela condução de extrações em temperatura ambiente, nos casos em que os extratos resultantes podem ser vantajosamente tratados diretamente por filtração. Em algumas modalidades, a planta ou porção da mesma pode ser pré-tratada, por exemplo, para liberar certos compostos para tornar os compostos desejados disponíveis para uma separação mais eficiente. Em algumas modalidades, múltiplos métodos são usados para obter os compostos desejados.

[0058] Embora o material enriquecido com proteína 10 pode ser obtido vantajosamente de acordo com um método comparável àquele delineado na patente norte-americana no. US. 9,301,544, tal como referenciado aqui acima, a divulgação não é entendida como limitada ao material enriquecido com proteína 10 obtido desta maneira. Outras técnicas exemplares para extrair proteínas de materiais vegetais que podem ser usadas para o fornecimento do material enriquecido com proteína 10 não estão particularmente limitados. Outros meios exemplares para extração de proteínas a partir de materiais vegetais inclui, mas não estão limitados a aqueles descritos em patentes norte-americanas nos. US 7,337,782 para Thompson;

US 6,033,895 para Garger et al.; US 4,941,484 para Clapp et al.; US 4,588,691 e US 4,400,471 para Johal; US 4,347,324 para Kwanyuen et al., US 4,340,676 para Bourque; US 4,333,871 para DeJong; US 4,289,147 e US 4,268,632 para Wildman et al.; US 3,959,246, US 3,823,128 e US 3,684,520 para Bickoff et al.; publicações de pedidos de patente norte-americano nos. US. 2010/0093054 para Lo et al. e US 2013/0072661 para Kale; publicações dos pedidos internacionais nos. WO 2011/078671 para Van de Velde et al. e WO 2008/143914 para Lo; e publicações dos pedidos europeus nos. EP 2403888 para Parker et al.; EP 1691759 para Boddupalli et al.; e EP 1067946 para Brinkhaus et al., os quais são todos aqui incorporados por referência em sua totalidade. Outros métodos de processamento exemplares são fornecidos, por exemplo, na patente norte-americana no. US 9,220,295 para Morton et al., a qual é aqui incorporada por referência.

[0059] O material enriquecido com proteína 10 usado como um ponto de partida nos processos de purificação aqui discutidos pode ser fornecido em várias formas. Em algumas modalidades, o material enriquecido com proteína é fornecido em uma forma umedecida. Em algumas modalidades, o extrato enriquecido com proteína é submetido a um processo de remoção de solvente de modo que o extrato atinja uma forma predominantemente sólida. Os extratos enriquecidos com proteínas podem ser fornecidos em uma forma de baixo solvente. Pelo termo “forma de baixo solvente” entende-se que o teor de solvente, incluindo o teor de umidade do material (por exemplo, um extrato enriquecido com proteína) é menor do que cerca de 12 porcento, com base no peso total do material. Métodos convenientes para fornecer o extrato enriquecido com proteína na forma de baixo solvente incluem a secagem por pulverização, liofilização, secagem por correia, secagem flash, ou outros métodos similares. É particularmente desejável concentrar o extrato líquido antes da secagem por pulverização ou liofilização do extrato. Um processo de secagem por pulverização representativo é descrito na patente norte-americana no. US 3,398,754 para Tughan, o qual é aqui incorporado por referência. Um processo de liofilização representativo é descrito na patente norte-americana no. US 3,316,919 para Verde, o qual é aqui incorporado por referência. Métodos e condições para fornecer materiais extraídos em uma forma sólida ou em baixo solvente (por exemplo, como um pó) será evidente para o especialista.

[0060] O material enriquecido com proteína 10 tipicamente compreende alguma porcentagem de componentes e / ou características indesejáveis. De acordo com a presente divulgação, um material contendo proteína (o qual pode, em algumas modalidades, compreender RuBisCO e / ou proteínas F2) isolado a partir de um material vegetal (por exemplo, de acordo com diversos métodos tal como descritos acima) é ainda tratado para fornecer uma composição de proteína (por exemplo, na forma de um concentrado ou isolado) tendo uma concentração mais baixa de um ou mais desses componentes indesejáveis do que antes do tratamento.

[0061] Geralmente, os métodos aqui divulgados envolvem o tratamento de um material enriquecido com proteína com ácido peracético e / ou com peróxido de hidrogênio, como será aqui descrito em mais detalhes. Em determinadas modalidades, o processo de tratamento é aquele ilustrado na FIG. 1. Geralmente, o processo de tratamento da FIG. 1 envolve um material sólido compreendendo a proteína (10), normalmente preparado pela extração de um material vegetal para fornecer um extrato aquoso e concentrar o extrato (conforme descrito em detalhes aqui acima). O material 10 está submetido às seguintes etapas: 12 (tratar o material 10 com ácido peracético, fornecendo o material tratado com ácido peracético 20), 22 (lavar o material tratado com ácido peracético 20 com água em um filtro relativamente grande, por exemplo, em tamanho de mícron (por exemplo, 1.4 µm) para fornecer um material lavado 30), 32 (solubilizar o material lavado 30 e ajustar o pH para um pH básico, por exemplo, cerca de 10 ou maior, para fornecer o material solubilizado 40), 42 (concentrar o material solubilizado para fornecer o material concentrado 50), e 52 (lavar o material concentrado 50 em um filtro relativamente pequeno, por exemplo, em tamanho de nanômetros (por exemplo, 10 nm) para fornecer concentrado / isolado contendo proteína purificada 60).

[0062] A etapa 12 envolve tratar o material contendo proteína 10 com ácido peracético para fornecer material tratado com ácido peracético 20. Opcionalmente, antes da adição do ácido peracético, o material 10 é primeiro pré-tratado a um pH de cerca de 3 - 6, por exemplo, em torno de 5, o que pode ser alcançado usando vários ácidos, por exemplo, incluindo, mas não se limitando a, ácido acético.

[0063] O ácido peracético comercialmente disponível é geralmente fornecido como uma solução aquosa e normalmente contém alguma concentração de peróxido (H2O2). Então, a etapa 12 tipicamente compreende tratar o material 10 com ácido peracético e peróxido em solução aquosa.

A quantidade de ácido peracético empregada nesta etapa pode variar, porém em algumas modalidades é uma quantidade de cerca de 0.75 % a cerca de 5 % de ácido peracético em peso ou cerca de 1 % a cerca de 3 % de ácido peracético em peso, por exemplo, cerca de 1 % de ácido peracético em peso (e cerca de 1 % a cerca de 10 % de peróxido ou cerca de 3 % a cerca de 8 % de peróxido, por exemplo, cerca de 3.5 % de peróxido em peso), com base na mistura do material 10, ácido peracético, peróxido, e água fornecido pela solução de ácido peracético / peróxido.

O contato pode ser feito em temperaturas variadas, mas em algumas modalidades, o tratamento pode ser melhorado para empregar aquecimento durante pelo menos uma parte da etapa 12. Por exemplo, em determinadas modalidades, a mistura do material enriquecido com proteína 10, ácido peracético e peróxido pode ser feita a uma temperatura maior que a temperatura ambiente, por exemplo, cerca de 30 °C ou maior, ou cerca de 35 °C ou maior, tal como cerca de 25 °C a cerca de 42 °C ou cerca de 30 °C a cerca de 42 °C, tal como cerca de 40 °C ± 2 °C.

A temperatura de aquecimento é geralmente mantida a ou abaixo de cerca de 42 °C para evitar desnaturar a proteína.

A quantidade de tempo para o qual o material contendo proteína 10 é mantido em contato com a solução de ácido peracético / peróxido pode variar, porém é geralmente de pelo menos cerca de 1 hora, pelo menos cerca de 2 horas, ou pelo menos cerca de 3 horas (por exemplo, cerca de 1 a cerca de 5 horas ou cerca de 2 a cerca de 5 horas, tal como cerca de 3 horas). O pH da mistura é tipicamente ácido; em algumas modalidades, o pH é mantido abaixo de cerca de 4, por exemplo, cerca de 3.5 ou menor.

[0064] O material tratado com ácido peracético 20 resultante está tipicamente na forma de uma suspensão, uma vez que a proteína presente nele está tipicamente precipitada em pH baixo. O material tratado com ácido peracético 20 é em seguida submetido à etapa de lavagem 22. O material 20 é tipicamente colocado em um filtro de tamanho de poro relativamente grande, suficiente para reter a proteína (RuBisCO e / ou proteína F2) na superfície do filtro. Por exemplo, o material 20 pode ser colocado em um filtro de poro de tamanho de mícron, tal como um filtro de

1.4 µm (por exemplo, um filtro de cerâmica de 1.4 µm). Em algumas modalidades, filtração de fluxo tangencial é usada. A etapa de lavagem 22 envolve o contato do material 20 com água purificada no filtro, permitindo que a água remova componentes indesejáveis, e retendo a proteína na superfície do filtro. A água empregada na etapa de lavagem apresenta vantajosamente um pH de menos do que 7 (isto é, um pouco ácida) para garantir que a proteína não se solubilize / permaneça em um estado precipitado, e não passe pelo filtro (resultando na perda do material desejado). Por exemplo, a água vantajosamente apresenta um pH de cerca de 5 ou menos ou cerca de 4 ou menos (por exemplo, água purificada com um pH de cerca de 3.5) e pode, em algumas modalidades, ser água USP. A água usada na etapa de lavagem 22 é entendida, por exemplo, para extinguir o ácido peracético remanescente da etapa de tratamento com ácido 12 e remover ácido peracético residual (junto com possivelmente outros componentes) a partir do material tratado com ácido peracético 20, o qual permanece na superfície do filtro. A quantidade de água usada para lavar o material 20 pode variar; no entanto, uma quantidade de água significativa é geralmente empregada para garantir a remoção de pelo menos a maioria do ácido peracético da amostra. De forma similar, o número de lavagens realizadas pode variar, mas, novamente, um número suficiente de lavagens para garantir a remoção de pelo menos a maioria do ácido peracético da amostra é preferido. Embora não se limite a isso, a lavagem é vantajosamente conduzida com base em 2 a 10 vezes o volume do retentado e, sendo assim, a quantidade de água empregada na lavagem (quantidade por lavagem e número de lavagens) pode depender do volume do material a ser lavado. A etapa de lavagem 22 é tipicamente conduzido em temperatura ambiente, embora esta etapa não se limite a isso.

[0065] O retentado resultante / material lavado 30 é então ressolubilizado na etapa 32. O(s) líquido(s) usado(s) para solubilizar o material 30 é vantajosamente básico (uma vez que se entende que as proteínas precipitam a baixo pH e a solubilidade é aumentada à medida que o pH aumenta). Consequentemente, a etapa 32 tipicamente envolve colocar o material 30 em contato com água e base. A base específica pode variar, desde que seja capaz de fornecer o pH desejado e solubilizar o material contendo proteína 30. Em algumas modalidades, uma solução de hidróxido de sódio (NaOH) é usada para atingir o pH desejado. O pH da solução em que o material 30 é solubilizado durante esta etapa é tipicamente de cerca de 8 ou maior ou cerca de 10 ou maior,

por exemplo, cerca de 8 a cerca de 16 ou cerca de 8 a cerca de 12 (por exemplo, cerca de 10.5). Em algumas modalidades, o líquido usado para solubilizar o material 30 ainda compreende um tampão. Por exemplo, em uma modalidade, um tampão compreendendo bicarbonato de sódio e carbonato de potássio é utilizado (o qual pode incluir vários outros componentes que não interferem negativamente na ressolubilização da proteína, por exemplo, incluindo, mas não se limitando a, metabissulfito de sódio). A inclusão de um tampão pode, em algumas modalidades, ajudar a garantir que o material 30 entre em solução; no entanto, adiciona teor de sal e, portanto, pode exigir uma maior extensão de lavagem em uma etapa posterior para garantir a remoção dos sais.

[0066] O material contendo proteína solubilizado resultante, na forma de material solubilizado 40, é então concentrado (a etapa 42) para fornecer um material concentrado 50. A concentração pode ser feita usando métodos conhecidos na técnica para a remoção de pelo menos a maioria do líquido associado à solução 40. Em modalidades preferidas, a filtração de fluxo tangencial pode ser usada para concentrar o material. Usando a filtração de fluxo tangencial, o material 40 é colocado em um filtro de poro de tamanho nanométrico, tal como um filtro de 10 nm (por exemplo, um filtro de cerâmica de10 nm). Vantajosamente, o tamanho dos poros do filtro na etapa 42 é relativamente baixo; no entanto, o tamanho do poro não deve ser significativamente menor que 10 nm, sendo assim o tamanho dos poros provavelmente levarão à retenção de sais e outros componentes indesejados na superfície do filtro. O retentado desse processo compreende o material concentrado

50. Em algumas modalidades, a concentração pode ser feita por evaporação a temperatura ambiente e pressão atmosférica e / ou pode empregar calor elevado (até cerca de 45 °C ou até cerca de 42 °C para evitar a desnaturação da proteína) e / ou a aplicação de vácuo). Tipicamente, o material é concentrado de modo que o material esteja na forma substancialmente sólida, embora algum líquido possa ainda estar associado ao material concentrado 50.

[0067] O material 50 resultante é então lavado 52 de uma maneira similar tal como na etapa 22. No entanto, a etapa 52 geralmente é conduzida em um filtro de tamanho de poro relativamente pequeno. Por exemplo, o material 40 pode ser colocado em um filtro de poro de tamanho nanométrico, tal como um filtro de 10 nm (por exemplo, um filtro de cerâmica de 10 nm). Vantajosamente, o tamanho dos poros do filtro na etapa 52 é relativamente baixo; no entanto, o tamanho do poro não deve ser significativamente menor que 10 nm, sendo assim, os tamanhos dos poros provavelmente levarão à retenção de sais e outros componentes indesejados na superfície do filtro. Em algumas modalidades, a filtração de fluxo tangencial é usada. A etapa de lavagem 52 envolve colocar o material 50 em contato com água purificada no filtro, permitindo que a água remova componentes indesejáveis, e retendo a proteína na superfície do filtro. A água empregada nesta etapa de lavagem pode, em algumas modalidades, ser água purificada (por exemplo, apresentando um pH neutro de ~7) ou pode ser água USP, a qual tem um pH menor. A proteína já está na forma precipitada nesta fase do processo e o tamanho de poro pequeno do filtro no qual o material é lavado normalmente impede a passagem significativa da proteína desejada através do filtro.

[0068] A água usada na etapa de lavagem 52 é entendida, por exemplo, para remover base residual e sais (junto com possivelmente outros componentes) do material contendo proteína 50, o qual permanece na superfície do filtro. A quantidade de água usada para lavar o material contendo proteína pode variar; no entanto, uma quantidade de água significativa é geralmente empregada para assegurar a remoção de pelo menos a maioria das bases e sais da amostra. De forma similar, o número de lavagens realizadas pode variar, mas novamente um número suficiente de lavagens para garantir a remoção de pelo menos a maioria das bases e sais da amostra é preferido. Embora não se limite a isso, a lavagem é vantajosamente conduzida com base em 2 a 10 vezes o volume de retido e, assim sendo, a quantidade de água empregada na lavagem (quantidade por lavagem e número de lavagens) pode depender do volume do material a ser lavado. A etapa de lavagem 52 é tipicamente conduzida em temperatura ambiente, embora esta etapa não está limitada a isto. Em determinadas modalidades, as etapas 42 e 52 são combinadas, de modo que a concentração e a lavagem sejam conduzidas substancialmente juntas. Por exemplo, em determinadas modalidades, é empregada filtração de fluxo tangencial, que pode servir a múltiplas funções, por exemplo, lavagem e concentração do material contendo proteína.

[0069] Vantajosamente, o material 60 (concentrado / isolado contendo proteína purificada) é fornecido na forma seca ou substancialmente seca após o tratamento de lavagem. A secagem pode ser realizada por concentração / evaporação e / ou a secagem por pulverização por métodos conhecidos na técnica. Em uma modalidade preferida, o material é secado por pulverização, por exemplo, a temperaturas elevadas. Um conjunto exemplar de condições para a secagem por pulverização é de entrada a 180 °C / saída a 80 °C.

[0070] O material contendo proteína 60 purificado geralmente tem uma cor mais clara do que o material 10 e tem uma cor mais clara do que um material comparável o qual não foi submetido a um processo compreendendo as etapas 12, 22, 32, 42, e 52 tal como aqui acima delineadas. Em algumas modalidades, o material tratado 60 exibe uma cor mais clara (por exemplo, um creme claro / castanho claro que é mais claro na cor e / ou contém menos coloração verde do que o material 10 submetido ao tratamento). Em algumas modalidades, material tratado (concentrado / isolado contendo proteína purificada 60) apresenta diminuição nas cinzas e / ou diminuição nas fibras em relação ao material contendo proteína antes do tratamento (isto é, o material enriquecido com proteína 10). Em algumas modalidades, o material contendo proteína purificado 60 exibe menos características de sabor indesejáveis do que o material 10 e pode, em algumas modalidades, ser considerado amplamente “insípido”. Por exemplo, em algumas modalidades, o material contendo proteína 10 tem de pelo menos cerca de 40 % de proteína, por exemplo, cerca de 40 % a cerca de 60 % de proteína pura em peso seco e o concentrado / isolado contendo proteína purificada correspondente 60 tem pelo menos cerca de 50 %, pelo menos cerca de 60 %, ou pelo menos cerca de 65 % de proteína pura em peso seco. Assim sendo, o processo de tratamento com ácido peracético tal como aqui acima descrito pode, em algumas modalidades, levar a um aumento na pureza de um material contendo proteína de cerca de 10 % ou mais ou cerca de 20 % ou mais.

[0071] Outros métodos de purificação podem, em algumas modalidades, ser usado antes ou depois do tratamento com ácido peracético aqui divulgado. Por exemplo, em algumas modalidades, o material pode ser tratado para remover ainda mais, por exemplo, gosto ou odor tal como geralmente descrito na patente norte-americana no. US 9,175,052, a qual é aqui incorporada por referência em sua totalidade. Em determinadas modalidades, um concentrado ou isolado de proteína insípido, incolor, e / ou inodoro é fornecido de acordo com os métodos aqui divulgados.

[0072] Vantajosamente, em determinadas modalidades, a composição de proteína fornecida através do método de purificação divulgado pode, portanto, exibir menos cor verde em comparação com o extrato enriquecido com proteína. Assim sendo, o método de tratamento com ácido peracético divulgado pode diminuir significativamente a cor do material submetido ao método. Por exemplo, em determinadas modalidades, os métodos aqui descritos podem fornecer um material que é visualmente mais claro na cor. Em determinadas modalidades, um material que exibe nenhuma coloração verde é obtido. As referidas mudanças de cor decorrentes do método divulgado podem ser avaliadas, por exemplo, por meio da inspeção visual ou por métodos ópticos analíticos, tais como absorção de luz / espectroscopia (por exemplo, determinação de quanto dos comprimentos de onda verdes são absorvidos pelo material).

[0073] A composição de proteína pode, em algumas modalidades, compreender um maior teor de proteína do que o extrato enriquecido com proteína antes de tratamento com ácido peracético. Por exemplo, em algumas modalidades, a extração supercrítica aqui descrita pode fornecer um aumento em teor de proteína em peso de pelo menos cerca de 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, ou 25 %. De acordo, a composição de proteína após a extração supercrítica geralmente compreende pelo menos cerca de 50 %, pelo menos cerca de 60 %, pelo menos cerca de 70 %, pelo menos cerca de 80 %, pelo menos cerca de 90 %, pelo menos cerca de 95 %, pelo menos cerca de 98 %, ou pelo menos cerca de 99 % de proteína (por exemplo, RuBisCO e / ou proteínas F2) em peso seco.

[0074] A forma da composição de proteína fornecida de acordo com a presente divulgação (por exemplo, um concentrado ou isolado de RuBisCO, concentrado ou isolado de RuBisCO / proteína F2 combinados, e / ou concentrado ou isolado de F2) obtido de acordo com os métodos da presente divulgação podem variar. Tipicamente, esses materiais estão nas formas sólida, líquida, semissólida ou gel. As formulações resultantes podem ser usadas de forma concreta, absoluta ou pura. As formas sólidas dos concentrados ou isolados aqui descritos podem incluir formas secas por pulverização e liofilizadas. As formas líquidas dos concentrados ou isolados aqui descritos podem incluir formulações contidas em carreadores de solventes aquosos ou orgânicos.

[0075] Os métodos aqui divulgados podem, em algumas modalidades, fornecer um concentrado ou isolado de proteína compreendendo pelo menos cerca de 50 %, pelo menos cerca de 60 %, pelo menos cerca de 70 %, pelo menos cerca de 80 %, ou pelo menos cerca de 90 % de proteína em peso seco. Em algumas modalidades, o concentrado ou isolado de proteína compreende uma mistura de RuBisCO e proteínas F2. Em algumas modalidades, a proteína no concentrado ou isolado de proteína compreende principalmente RuBisCO. Em algumas modalidades, o concentrado ou isolado de proteína compreende pelo menos cerca de 50 %, pelo menos cerca de 60 %, pelo menos cerca de 70 %, pelo menos cerca de 80 %, ou pelo menos cerca de 90 % de proteína RuBisCO em peso. Em algumas modalidades, a presente divulgação especificamente fornece um método para o isolamento e / ou purificação de RuBisCO extraída a partir de uma planta da espécie Nicotiana ou uma porção da mesma. De acordo, os métodos aqui divulgados podem, em algumas modalidades, fornecer um concentrado ou isolado de RuBisCO, por exemplo, um material compreendendo pelo menos cerca de 50 %, pelo menos cerca de 60 %, pelo menos cerca de 70 %, pelo menos cerca de 80 %, ou pelo menos cerca de 90 % de RuBisCO em peso seco.

[0076] Embora em algumas modalidades, o concentrado ou isolado de proteína aqui descrito pode ser usado diretamente após uma ou mais etapas de tratamento, pode ser desejável tratar termicamente o material, a fim de, por exemplo, pasteurizar o material ou, caso contrário, alterar quimicamente o material. Vide, por exemplo, a publicação da patente norte-americana no. US 2010/0300463 para Chen et al., a qual é aqui incorporada por referência. Em algumas modalidades, em adição a ou no lugar do tratamento térmico opcional, o material vegetal pode ser irradiado (por exemplo, para garantir que nenhum micróbio esteja associado com o concentrado ou isolado de proteína).

[0077] Os concentrados e isolados de proteína (isto é, concentrados e isolados de RuBisCO, concentrados e isolados de RuBisCO / proteína F2 combinada, e / ou concentrados e isolados de proteína F2) fornecido após qualquer um ou mais dos processos de tratamento de purificação aqui descritos podem ser vantajosamente usados em várias aplicações. Para muitas aplicações (por exemplo, produtos alimentares, produtos para rações e produtos industriais), pode ser desejável substituir certas proteínas de animais com proteínas de plantas. Além disso, em algumas aplicações, pode ser desejável substituir certas outras proteínas vegetais tipicamente utilizadas (por exemplo, proteínas de soja e / ou proteínas geneticamente modificadas). Os concentrados e isolados de proteína tais como aqueles fornecidos pelos métodos aqui descritos podem exibir boas propriedades nutricionais e, em algumas modalidades, podem ser fornecidos em uma forma que tem um conteúdo reduzido de vários componentes indesejáveis, e / ou boas características sensoriais (por exemplo, cor), tornando eles são particularmente adequados para uso em vários produtos. Além disso, certas propriedades físicas de RuBisCO o tornam vantajoso para uso nos referidos produtos, uma vez que tem excelente comportamento de ligação, gelificação, solubilidade e emulsificação. Em algumas modalidades, os tipos de tratamento aqui descritos podem fornecer um material de grau alimentar contendo proteína. Em determinadas modalidades, o concentrado de proteína isolada compreende um material proteico que excede a proteína de soja em qualidade nutricional. Em algumas modalidades, o concentrado ou isolado de proteína pode ser útil para fins medicinais.

[0078] Materiais processados que são fornecidos de acordo com a presente divulgação são ingredientes úteis para uma ampla variedade de aplicações comerciais. Os materiais podem ser utilizados como aglutinantes, enchimentos ou extensores, ou podem servir a outras funções ou conferir atributos funcionais, em uma ampla variedade de formulações industriais. Por exemplo, os materiais podem ser usados como componentes de vários tipos de resinas que possuem aplicações industriais; e adicionalmente, podem ser usados como componentes de revestimentos (por exemplo, para tinturas e tintas) e de adesivos (por exemplo, para colas e formulações de fundição a quente). Os materiais podem ser usados como componentes de uma ampla variedade de formulações cosméticas (por exemplo, os materiais podem ser incorporados em xampus e produtos de cuidados com a pele). Os materiais podem ser usados como componentes de alimentos, suplementos dietéticos e alimentos funcionais (por exemplo, como componentes de bebidas, produtos alimentícios processados e similares). Vide, por exemplo, a patente norte-americana no. US 9,301,544 para Mua et al., o qual é aqui incorporado por referência em sua totalidade. Os materiais também podem ser usados como componentes de ração animal. Os materiais podem ser usados como componentes de formulações farmacêuticas (por exemplo, como componentes de líquidos, gomas, pastilhas, comprimidos e pílulas que são usados para fins medicinais).

[0079] A quantidade de concentrado ou isolado de proteína incorporada dentro de composições para as referidas finalidades pode depender, por exemplo, da função desejada do concentrado ou isolado, da composição química do concentrado ou isolado, e do tipo de composição / produto ao qual o concentrado ou isolado é adicionado.

EXPERIMENTAL

[0080] Aspectos da presente invenção são mais completamente ilustrados pelos seguintes exemplos, os quais são apresentados para ilustrar certos aspectos da presente invenção e não devem ser interpretados como limitantes da mesma.

[0081] A alfafa é colhida e submetida à extração por meio de um método direcionado para a RuBisCO, semelhante ao feito anteriormente para o tabaco. Vide a patente norte-americana no. US 9,301,544 para Mua et al., a qual é aqui incorporada por referência em sua totalidade. Especificamente, A alfafa colhida é extraída por meio de um desintegrador de pilha dupla e sistema de prensa de rosca. A extração é realizada com uma proporção de 2:1 de tampão de extração com 90 % no topo do moinho e 10 % na prensa. Vários tampões as proporções de tecido foram testadas devido ao teor de umidade relativamente baixo da alfafa (em comparação com o tabaco). A proporção começou em 1:1 e foi aumentada para 2:1 incrementalmente durante o processamento. Água adicional foi usada para ajudar a pulverizar as plantas e prevenir o entupimento. Os longos pedaços de alfafa eram difíceis de alimentar e pode ser útil fazer cortes adicionais no campo (antes da extração).

[0082] Após a extração, o suco verde é resfriado a ≤ 10 °C. O suco verde resfriado é processado em uma centrífuga decantadora a 4300 RPM e 30 psi de contrapressão. O sobrenadante do decantador é então processado através da pilha de discos a 7200 RPM e 75 psi de contrapressão. O grânulo da pilha de discos é descartado. O sobrenadante foi então ajustado para pH 6.5 com solução de HCl. O sobrenadante com pH ajustado é combinado com 10 g / L de celupure C300 DE e é filtrado sob pressão com almofadas de filtro de 1.0 µm. A prensa é lavada com 10x volumes de tampão de extração para DE seguido por um jato de ar comprimido. Foi notado que a coloração verde substancial ainda estava no filtrado; enquanto que, substancialmente toda a clorofila é removida por esta etapa no processo do tabaco (como evidenciado por pouca ou nenhuma coloração verde durante o processamento do tabaco).

[0083] O filtrado e o lavado são então concentrados em um sistema de cerâmica de 0.1 µm para 500 L seguido por uma lavagem de 7x volumes com tampão de lavagem. O retentado lavado é então concentrado para o volume de retenção do sistema. Metade desse volume é então secado por spray em entrada a 180 °C e saída a 80 °C. Foram vários os problemas de recuperação com o processo de secagem por pulverização provocado pelo entupimento do separador ciclônico. Isso provavelmente se deve a uma maior quantidade de proteína com pureza inferior em relação ao material do tabaco. O pó F1 era “grumoso” e não formava uma dispersão uniforme com o ar do separador. O F1 também foi notado em uma cor muito verde. O permeado de cerâmica é concentrado em um ultrafiltro enrolado em espiral de 10 kDa a um volume de 85 L, seguido por uma lavagem de 7x volumes com tampão de lavagem. O permeado e retentado de 10 kDa foram amostrados e então descartados. O retentado de 10 kDa pode ser pulverizado a seco para a proteína F2 em uma data posterior.

[0084] A recuperação da RuBisCO obtida a partir da alfafa seca por pulverização foi entre 2 e 3 vezes maior do que para as colheitas médias de tabaco reportadas anteriormente. A recuperação total de proteína é mostrada na FIG. 2. Com base na faixa em branco (mostrada na FIG. 3, que registra 12.7 g / kg de proteína), é determinado que a alfafa deve conter grandes quantidades de pequenos peptídeos (o retentado de 10 kDa indica uma grande quantidade de proteínas não RuBisCO). É de notar que a alfafa parecia ter um alto teor de outras proteínas além da RuBisCO que não foram capturadas através deste processo. A pureza da proteína e o teor em comparação com a proteína derivada do tabaco é mostrado na FIG. 4A e 4B. A FIG. 5 fornece uma comparação entre o número total de RuBisCO obtido por acre de alfafa plantada versus a quantidade total de RuBisCO obtida por acre de tabaco plantado.

[0085] A RuBisCO obtida a partir da alfafa seca por pulverização resultante exibiu uma cor verde distinta. É de notar que um processo desenvolvido anteriormente para reduzir a coloração verde em RuBisCO derivado de tabaco não foi particularmente eficaz para tratar as amostras de RuBisCO derivadas de alfafa.

[0086] Muitas modificações e outras modalidades da invenção virão à mente de uma pessoa versada na técnica à qual esta invenção pertence, tendo o benefício dos ensinamentos apresentados na descrição anterior. Portanto,

deve ser entendido que a invenção não deve ser limitada às modalidades específicas divulgadas e que as modificações e outras modalidades se destinam a ser incluídas dentro do escopo das reivindicações anexas.

Embora termos específicos sejam aqui empregados, eles são usados em um sentido apenas genérico e descritivo e não para fins de limitação.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Método para a purificação de um material enriquecido com proteínas derivadas de plantas, o método CARACTERIZADO por compreender: a) receber um material derivado de planta, enriquecido com proteínas compreendendo RuBisCO, proteínas da fração F2, ou uma combinação dos mesmos, em que o material derivado de planta, enriquecido com proteínas ainda compreende cor indesejável; b) tratar o material derivado de planta, enriquecido com proteínas com ácido peracético para fornecer uma mistura tratada com ácido peracético; c) lavar a mistura tratada com ácido peracético com água em um filtro, em que um material sólido tratado contendo proteína é retido no filtro; d) solubilizar o material sólido tratado contendo proteína para fornecer uma solução e ajustar o pH da solução a um pH básico para fornecer uma solução básica; e e) processar a solução básica em um filtro para permitir um retentado compreendendo um concentrado ou isolado de proteína tendo uma cor mais clara em comparação com o material derivado de planta, enriquecido com proteínas.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO por a cor indesejável ser verde.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO por o material derivado de planta, enriquecido com proteínas compreender material a partir de uma planta compreendendo folhas verdes.

4. Método, de acordo com a reivindicação 1,

CARACTERIZADO por o material derivado de planta, enriquecido com proteínas compreender material a partir de uma planta selecionada a partir do grupo que consiste em árvores, arbustos, gramíneas, samambaias, vinhas, musgos, algas, ervas, ou uma combinação dos mesmos.

5. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO por o material derivado de planta, enriquecido com proteínas compreender material a partir de uma planta selecionada a partir do grupo que consiste em espinafre, alfafa, acelga, couve, chicória, amaranto, folhas de cevada, folhas de mostarda, trevo, folhas de cenoura, folhas de beterraba e combinações dos mesmos.

6. Método, de acordo com a reivindicação 5, CARACTERIZADO por o material derivado de planta, enriquecido com proteínas compreender material a partir de alfafa.

7. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO por a etapa de tratamento b) ser conduzida a um pH de cerca de 3 a cerca de 5.

8. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO por a etapa de tratamento b) ser conduzida a uma temperatura de cerca de 25 °C a cerca de 42 °C.

9. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO por a etapa de tratamento b) compreender tratar o material derivado de planta, enriquecido com proteínas com ácido peracético na forma de uma solução aquosa compreendendo pelo menos cerca de 3 % em peso de ácido peracético.

10. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO por a etapa c) compreender lavar a mistura tratada com ácido peracético com água em um filtro de poro de 1.4 µm.

11. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO por a etapa c) compreender lavar a mistura tratada com ácido peracético com água tendo um pH de menos de cerca de 5.

12. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO por a etapa d) compreender ressolubilizar o material sólido tratado contendo proteína em uma solução aquosa.

13. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO por a etapa e) compreender processar a solução básica em um filtro de 10 nm.

14. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO por ainda compreender a secagem por pulverização do concentrado ou isolado de proteína.

15. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO por o concentrado ou isolado de proteína compreender cerca de 60 % ou mais de RuBisCO, proteínas da fração F2, ou uma combinação dos mesmos em peso.

16. Método, de acordo com a reivindicação 15, CARACTERIZADO por o concentrado ou isolado de proteína compreender cerca de 60 % ou mais de RuBisCO em peso.

17. Método, de acordo com a reivindicação 15, CARACTERIZADO por o concentrado ou isolado de proteína compreender cerca de 70 % ou mais de RuBisCO em peso.

18. Método, de acordo com a reivindicação 15, CARACTERIZADO por o concentrado ou isolado de proteína compreender cerca de 80 % ou mais de RuBisCO em peso.

19. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 18, CARACTERIZADO por ainda compreender incorporar o concentrado ou isolado de proteína em uma composição para consumo humano ou animal.