MX2014003458A - Metodo para produccion de fracciones de peptidos y uso de las mismas. - Google Patents

Abstract

La presente invención se relaciona con un método para la producción de fracciones de péptidos enriquecidas de materias primas conteniendo proteínas, en el cual hidrolizados de proteína son separados por medio de cromatografía a través de fases estacionarias usando una solución acuosa como medio de elusión según sus propiedades físico químicas.

Description

MÉTODO PARA PRODUCCIÓN DE FRACCIONES DE PÉPTIDOS Y USO DE LAS MISMAS DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con un método para la producción de fracciones de péptidos enriquecidas de materias primas conteniendo proteínas, así como el uso de éstas .

Mezclas de péptidos surgen en la hidrólisis enzimática de albúminas tanto durante la digestión natural animal y microbiana, como en el tratamiento técnico de materias primas conteniendo proteínas con proteasas o con microorganismos conteniendo proteasa. Las proteínas en las materias primas son usualmente mezclas de poliamidas de veinte diferentes a-L-aminoácidos con longitudes de cadenas entre 100 y varios 1000 de bloques de monómeros, cuya secuencia varia fuertemente de proteína a proteína. Consecuentemente, en el tratamiento proteolítico de mezclas de proteínas y aún de proteínas puras individuales surge un gran número de fracciones de polímeros.

Las mezclas de péptidos que surgen en los procesos enzimático-técnicos de hidrólisis se distinguen en su composición en función de las materias primas usadas, de las enzimas usadas, y del grado de hidrólisis ajustado. Bajo las mismas condiciones de hidrólisis, sin embargo, la composición del mismo tipo es reproducible .

Para una gran cantidad de péptidos de hidrolizados de proteina, en parte hasta en los hidrolizados originales sin enriquecimiento, se comprobaron propiedades funcionales especiales y actividades biológicas: Algunos péptidos pueden poseer pronunciadas regiones hidrófilas e hidrófobas, por lo que son tensioactivas . Son apropiados como sustancias tensioactivas o bloques de sustancias tensioactivas y pueden exhibir propiedades estabilizantes para espumas, de agentes de emulsión, antiestáticos o de limpieza.

Algunos péptidos pueden ser en si sustancias aromatizantes o servir como bases para la producción de aromas de reacción.

Algunos péptidos pueden influencias sobre sus propiedades reductivas u oxidantes el grado de la reticulación de disulfuros de proteínas.

Algunos péptidos exhiben actividades antimicrobianas.

Algunos péptidos activan mecanismos de reparación en cabello y tejido conjuntivo.

Algunos péptidos tienen actividades anabólicas o que activan el metabolismo graso, inmunomoduladores o que reducen la presión sanguínea.

A través de una hidrólisis de materias primas conteniendo proteínas pueden producirse, con la ayuda de proteasas en forma individual o en combinación, prácticamente en variaciones ilimitadas mezclas de péptidos, algunos de los cuales se encuentran descritas en la literatura, algunas se ofrecen en forma comercial e.g. como alimentos para animales o humanos, y que poseen algunas propiedades que permite su uso como aditivos funcionales en productos alimenticios, cosméticos y farmacéuticos. Un enriquecimiento de los péptidos funcionales o la separación de componentes secundarios indeseables se realizan, según el estado de la técnica, en casos aislados por medio de métodos de precipitación o de ultrafiltración . Ambos métodos son relativamente poco específicos y permiten únicamente la separación de dos fracciones por etapa del método.

Péptidos muy caros para aplicaciones farmacéuticas se fraccionan según el estado de la técnica también mediante cromatografía, pero las resinas usadas son muy caras, mecánicamente no estables en grandes columnas de separación y se usan como eluyentes solventes orgánicos caros. En general, estos métodos son fuera de cuestión para una producción económica de mezclas de péptidos a gran escala técnica, e.g. para aplicaciones de la industria alimenticia .

Métodos para la investigación, el seguimiento y la cuantificación de la actividad de los péptidos en las soluciones brutas y en las fracciones enriquecidas son parte del estado de la técnica. Así es posible verificar propiedades aromáticas sensoriales en sí o según reacciones estandarizadas, demostrar propiedades antibióticas mediante el método de difusión en agar, propiedades de reparación de cabello con mediciones de elongación de tracción o propiedades de liga específica mediante cromatografía de ligandos. Actividades fisiológicas fueron verificadas mediante ensayos con animales o con otras pruebas biológicas.

Los péptidos en hidrolizados de proteínas tienen propiedades físico químicas y fisiológicas que los hacen predestinados como componentes activos en una pluralidad de aplicaciones en el campo de los alimentos para animales y humanos, cosmético y farmacéutico. Sólo que los péptidos funcionales usualmente están presentes en hidrolizados de proteínas en una proporción tan pequeña, junto con un exceso muy grande de péptidos no activos, que su actividad no puede manifestarse claramente, o si se manifiesta, que otros componentes de la mezcla impiden la aplicación a causa de propiedades indeseables como e.g. su color o su olor. Pasando por alto las excepciones en que se pueden aislar péptidos específicos por medio de una tecnología muy cara o gracias a propiedades de solubilidad muy especiales, no existe ningún método económico que permite separar de manera universal hidrolizados a una gran escala de técnica en fracciones con propiedades químicas o físicas buscadas.

Con base en descubrimientos de la investigación de años recientes, sin embargo, se pronostica un gran potencial de aplicaciones a los péptidos funcionales. Un obstáculo para la comercialización de péptidos funcionales a gran escala técnica es, sin embargo, que los péptidos funcionales en los hidrolizados de proteínas o bien están presentes únicamente en concentraciones muy bajas, o que son acompañados de componentes secundarios indeseables como, por ejemplo, colorantes, sustancias amargas o aromatizantes .

Se conocen, por cierto, del campo de la producción de azúcar y del tratamiento del agua métodos de procesos de cromatografía a gran escala técnica, en los cuales se opera con una cromatografía por columnas de más de 100 m3 para la separación de sustancias y la purificación de materias. Pero estos métodos a gran escala técnica son apropiados únicamente para un fraccionamiento muy grueso, puesto que las resinas de cromatografía usadas no se consideran como muy selectivas en su comportamiento de adsorción y su comportamiento de separación por cromatografía tampoco es conocida más allá de estas aplicaciones técnicas.

Ante este trasfondo tecnológico, la invención tiene el objetivo de fraccionar a gran escala económicamente las mezclas que contienen péptidos, enriquecer los péptidos obtenidos de esta manera y separarlos de péptidos no activos o de otros componentes indeseables de los hidrolizados como e.g. de colores, aromas y/o sales indeseables .

Este problema tecnológico se resuelve por medio de un método para la producción de fracciones de péptidos enriquecidas de materias primas conteniendo proteínas, en los cuales se tiene según la reivindicación 1 el enfoque de separar los hidrolizados de proteínas por medio de cromatografía a través de fases estacionarias con una solución acuosa como eluyente según sus propiedades físico químicas .

Sorprendentemente se descubrió que también algunas fases estacionarias con bastante porosidad, empleadas en la cromatografías de procesos a gran escala técnica, como en la tecnología del azúcar, en al tratamiento del agua o en la tecnología química a gran escala, son perfectamente capaces de fraccionar péptidos hasta un tamaño molecular de aproximadamente 50 aminoácidos según los criterios de basicidad, acidez, hidrofobia, tamaño de molécula y actividades recíprocas específicas, para obtener así fracciones de péptidos enriquecidos de acuerdo a sus propiedades físico químicas.

Representantes típicos de semejantes fases estacionarias son resinas de poliestireno reticuladas con divinilbenceno con funcionalizaciones de anión o catión, copolimerizados de alcohol de vinilo estireno de reticulación transversal o policondensados de fenol formaldehído de reticulación transversal, e.g. de la serie de productos Amberlite de la firma Dow Chemicals o de la serie de productos Lewatit de la firma Lanxess.

Se prefieren que las materias primas conteniendo proteínas y los hidrolizados de proteínas obtenibles comercialmente se hayan hidrolizado previamente con proteasas específicas hasta un grado definido, obteniendo fragmentos de péptidos, además preferentemente, de uno a cien, en particular de dos a veinte aminoácidos.

Los hidrolizados pueden concentrarse adicionalmente de la manera usual, e.g. mediante evaporación, se puede ajusfar el valor de pH deseable, se pueden aclarar e.g. mediante filtración y ponerse en volúmenes de cama de hasta 0.3 BV, preferentemente 0.1 volumen de cama en las columnas de cromatografía llenadas con las fases estacionarias. Semejantes soluciones iniciales tienen preferentemente una concentración de 5% a 50% de sustancia seca.

La elusión se realiza preferentemente con agua pura sin otros aditivos, eventualmente también con aditivos generalmente reducidos de sales o de solventes.

Dependiendo del fraccionado deseable se usan fases estacionarias con funcionalidades hidroxi, con lo que se realiza una separación según el grado de hidrofobia, o que tienen funcionalidades de aniones o cationes, lo que realiza una separación según exclusión de iones o intercambio de iones.

Resinas de separación pueden usarse de maneras múltiples para la cromatografía, en particular, las resinas de separación usadas para la cromatografía como fases estacionarias son resinas de polímeros macroporosas o gelatinosas que preferentemente tienen grados de reticulación que permiten una penetración parcial hasta un tamaño de molécula de 10, 000 Da, y un efecto de filtración de gel entre 300 Da y 10,000 Da.

En algunos casos pueden usarse ventajosamente para la cromatografía como fase estacionaria también agentes de adsorción técnica sin funcionalidades, e.g. carbones de maíz conocidos de la tecnología de adsorción o resinas de separación de pirol que pueden tener propiedades de adsorción similares al carbón de maíz.

En las resinas de separación se establece en el curso de varios ciclos de cromatografía un equilibrio de liga de péptidos que se adsorben preferentemente de las mezclas, los cuales influyen esencialmente el curso de la separación a causa de diferentes afinidades con péptidos no ligados.

Parámetros de procesos adicionales son una tasa de flujo de la cromatografía entre 0.2 y 4 volúmenes de cama por hora a una temperatura de elusión entre -4°C y 98°C, en particular a una temperatura de elusión entre 70°C y 95°C.

En el producto de elusión de las columnas de cromatografía se identifica al establecer una nueva separación primero la propiedad funcional buscada. La selección de la resina de separación y las condiciones de separación se realizan de manera tal que componentes que tienen propiedades indeseables preferentemente no eluyen en la región de la funcionalidad deseable. La determinación de las regiones de fracción se realiza según parámetros físico químicos del producto de elusión que son fáciles de medir.

El resultado de una cromatografía es un enriquecimiento de los péptidos según propiedades funcionales definibles y/o la purificación de los péptidos de sustancias secundarias indeseables como, por ejemplo, colorantes, sustancias amargas o sustancias aromáticas.

La mezcla de péptidos así obtenida puede fraccionarse más por medio de etapas adicionales de purificación, en particular mediante cromatografía, hasta un grado de enriquecimiento arbitrario de uno o varios péptidos que pueden usarse como sustancias funcionales en alimentos para animales o humanos, productos cosméticos y como principios activos farmacéuticos.

Las fracciones no funcionales son combinados, concentrados y se alimentan a su aprovechamiento original en el campo de la alimentación humana, animal, de medios de fermentación o de fertilizantes.

EXPLICACIÓN DE EJEMPLOS DE REALIZACIÓN La esencia de la invención se explica ahora con más detalle con la ayuda de unos ejemplos de realización que no tienen carácter definitorio parea la invención.

EJEMPLO 1 De un hidrolizado enzimático de proteina de trigo comercialmente disponible teniendo una proporción de aproximadamente 90% de péptidos con un peso molecular entre 250 y 2500 Da se produce a través de una columna de separación analítica un perfil de composición por medio de análisis HPLC. El hidrolizado de proteína de trigo es ajustado a 50% (peso/peso) de solución acuosa y un valor de pH de 4.5, se filtra y se caracteriza a guisa de ejemplo con relación a algunas propiedades como sigue: Conductividad referida a % de sustancia seca Proporción de color (E430 / cm) referida a % de sustancia seca Comportamiento espumante de una solución de 1% (volumen de espuma después de 1 min gaseado por vidrio fritado 0.1 volumen de muestra / s) Estabilidad de la espuma (semiperíodo) Olor (ensayo sensorial) Sabor (ensayo sensorial) Efecto de reparación de cabello expuesto a luz, aire caliente y/o detergentes en el ensayo de elongación de tracción Una columna de envoltura doble de vidrio, DI: 35 mm, longitud 1000 mm, se llena con una resina de poliestireno reticulada con DVB, macroporosa, sulfonada en forma de calcio, monodispersa y con un tamaño de partícula de 0.4 mm. La envoltura doble se calienta con la ayuda de un termostato de circulación a 85°C. El hidrolizado de proteína de trigo se aplica a la columna en una concentración de 50% (peso/peso) y un volumen de 50 mi, correspondiendo a un volumen de cama de 0.1 (BV) y se somete a cromatografía con agua de llave caliente de dureza mediana y una tasa de flujo de 1 BV/h. Después de 1.5 BV de volumen de elusión se aplica nuevamente 0.1 BV de hidrolizado de proteína de trigo y se eluye nuevamente con agua. El proceso se repite sin regeneración de la resina de separación al menos diez veces, lo que en principio puede hacerse las veces que se quiera. El producto de la elusión de cada ciclo de cromatografía se captura en 15 fracciones de 100 mi cada una.

A guisa de ejemplo puede observarse mediante seguimiento en línea de la curva del pH, de la curva de color, de la conductividad y de la absorción a 214 nm el enriquecimiento de los péptidos con las propiedades correspondientes conforme progrese la elusión.

Los perfiles de composición de los péptidos de cada una de las fracciones fueron capturados usando el método de HPLC precedentemente referido.

Los perfiles de HPLC de cada una de las fracciones se distinguen claramente uno de otro y los péptidos individuales se enriquecen visiblemente en diferentes fracciones .

Las propiedades funcionales que se tomaron en cuenta para la caracterización del hidrolizado de proteina de trigo fueron investigadas también en fracciones individuales y comparadas con la solución inicial.

Las fracciones del producto de elusión tienen diferentes proporciones de E430 / TS, las proporciones de color se enriquecen en algunas fracciones, y empobrecen en otras. Algunas fracciones son incoloras, a diferencia de la solución inicial, ya no son amargas y tienen con la misma concentración una estabilidad de espuma 30 veces mayor. La propiedad de reparación de cabello, conocida y comprobada ya de la solución inicial, también pudo reencontrarse en algunas fracciones, pero no asi en otras.

EJEMPLO 2 Un hidrolizado de proteina de soya con un tamaño de péptidos de 1500 Da en promedio es caracterizado según descrito en el ejemplo 1 y se prepara para la cromatografía. La cromatografía se realiza a guisa de ejemplo en dos diferentes ensayos con un valor de pH de 5.0 y un valor de pH de 10.0.

Una columna de envoltura doble de vidrio, DI: 10 mm, longitud: 300 mm, es llenado con una resina de separación copolimerizada de poliestireno - vinil alcohol reticulado con DVB sin funciones iónicas, monodisperso y con un tamaño de partícula de 0.2 mm. La envoltura doble se enfría con la ayuda de un termostato de circulación a 10°C. El hidrolizado de proteína de soya es aplicada a la columna en una concentración de 35% (peso/peso) y un volumen de 3 mi (0.1 BV) y sometido a cromatografía con agua destilada y una tasa de flujo de 1 BV / h. Después de 1.5 BV de volumen de elusión se aplica nuevamente 0.1 BV de hidrolizado de proteína de trigo y se vuelve a eluir con agua.

El proceso se repite tres veces sin regeneración de la resina de separación. El producto de elusión es capturado en 15 fracciones de 3 mi cada una. De las fracciones de un ciclo de elusión se toman a guisa de ejemplo los perfiles de composición mediante el método de HPLC precedentemente referido. Se analizan además las propiedades que se tomaron en cuenta para la caracterización del hidrolizado de proteína de soya también en las fracciones individuales, y se compararon con la solución inicial.

Los perfiles de HPLC de cada una de las fracciones se distinguen claramente uno de otro y los péptidos individuales se enriquecen visiblemente en diferentes fracciones. En particular se obtiene en el ensayo con 5.0 pH un fraccionado totalmente distinto del ensayo con pH 10.0.

Las fracciones del producto de elusión se distinguen unas de otras por sus proporciones de color, su comportamiento espumante y sus propiedades sensoriales.

EJEMPLO 3 De un hidrolizado enzimático de colágeno con tamaños de péptidos < 2000 Da se produce un perfil de composición a través de una columna de separación analítica por medio de una unidad de HPLC. El hidrolizado de colágeno se disuelve en un 40% (peso/peso) en agua, se ajusta a un valor de pH de 8.0 y se caracteriza según se describe en el ejemplo 1.

Una columna de envoltura doble de vidrio, DI: 35 mm, longitud 1000 mm, se llena con una resina de poliestireno reticulada con DVB, macroporosa, sulfonada en forma de sodio, monodispersa y con un tamaño de partícula de 0.4 mm. La envoltura doble se calienta con la ayuda de un termostato de circulación a 85°C. El hidrolizado de colágeno se aplica a la columna en una concentración de 40% (peso/peso) y un volumen de 50 mi (0.1 BV) y se somete a cromatografía con agua de llave caliente desionizado y una tasa de flujo de 1 BV/h. Después de 1.5 BV de volumen de elusión se aplica nuevamente 0.1 BV de hidrolizado de colágeno y se eluye nuevamente con agua. El proceso se repite sin regeneración de la resina de separación al menos diez veces. El producto de la elusión de cada ciclo de cromatografía se captura en 15 fracciones de 100 mi cada una .

Los perfiles de HPLC de cada una de las fracciones se distinguen claramente uno de otro también en este ejemplo y los péptidos individuales se enriquecen visiblemente en diferentes fracciones.

El método inventivo proporciona en cada modalidad unas fracciones de péptidos que son novedosas en su forma, que señalan propiedades funcionales ventajosas y poseen un valor de aplicación claramente mayor que las materias primas usadas. También los métodos de separación precedentemente explicados son capaces en sus combinaciones y aplicaciones presentadas de hacer accesible el gran potencial funcional de hidrolizados de proteínas para un aprovechamiento amplio.

Mediante variación de los parámetros de proceso y la combinación de varias cromatografías en diferentes condiciones pueden generarse siempre nuevas mezclas de péptidos inclusive hasta llegar a péptidos puros. El método inventivo y los productos resultantes de él representan una considerable generación de valor de fracciones secundarias de la producción alimenticia y agraria, que de otro modo sólo son de poco valor o no aprovechables. Todas las fracciones parciales que no tienen propiedades funcionales suficientes para una aplicación especifica pueden reintroducirse mínimamente al aprovechamiento original de las materias primas, pero usualmente también éstas experimentan un incremento de valor gracias al fraccionamiento enzimático y de ninguna manera son carentes de valor.

Las elusiones de la separación por cromatografía se hacen generalmente con agua sin más aditivos, no se requiere ninguna regeneración de las columnas de cromatografía con sustancias químicas. Tanto las resinas de separación usadas para las cromatografías que se conocen por su aplicación e.g. en el tratamiento de agua, como también las enzimas usadas son disponibles comercialmente de las aplicaciones de alimentación de animales y humanos.

Claims (19)

REIVINDICACIO ES

1. Método para la producción de fracciones de péptidos enriquecidas de materias primas conteniendo proteínas, caracterizado porque se separan unos hidrolizados de proteína a través de cromatografía usando fases estacionarias con una solución acuosa como medio de elusión según sus propiedades físico químicas.

2. Método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque antes de la cromatografía de las materias primas se ajusta en una hidrólisis con proteasas específicas a tamaños de péptidos de 1 a 100 aminoácidos.

3. Método de conformidad con una o varias de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque antes de una cromatografía se realiza un ajuste del valor de pH, de la concentración y/o una aclaración de los hidrolizados de proteína .

4. Método de conformidad con una o varias de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque se usan para la cromatografía como fase estacionaria agentes de adsorción técnicos o cambiadores de iones sin funcionalización o con funcionalizaciones neutrales, hidrófilos, ácidos o básicos.

5. Método de conformidad con una o varias de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque se emplean para la cromatografía como fase estacionaria, resinas de separación como agentes de adsorción.

6. Método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque las resinas de separación son resinas de polímero macroporosas o en forma de gel.

7. Método de conformidad con una o varias de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque para la cromatografía se usa como fase estacionaria los agentes de adsorción carbones de maíz o resinas de separación de pirol .

8. Método de conformidad con una o varias de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque una solución inicial tiene una concentración de 5% a 50% de sustancia seca.

9. Método de conformidad con una o varias de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque las fases estacionarias tienen un grado de reticulación que tienen un efecto de criba molecular entre 300 Da y 10,000 Da.

10. Método de conformidad con una o varias de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la tasa de flujo de la cromatografía se ubica entre 0.2 y 4 volúmenes de cama por hora.

11. Método de conformidad con una o varias de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la temperatura de elusión se ubica entre -4°C y 98°C.

12. Método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque la temperatura de elusión se ubica entre 70°C y 95°C.

13. Método de conformidad con una o varias de las reivindicaciones precedentes, caracterizado por agua pura como medio de elusión.

14. Método de conformidad con una o varias de las reivindicaciones 1 a 11 precedentes, caracterizado por soluciones acuosas diluidas con aditivos de sales, ácidos, bases o solventes como medio de elusión.

15. Método de conformidad con una o varias de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque en una cromatografía se lleva a cabo un enriquecimiento de los péptidos según propiedades funcionales definibles.

16. Método de conformidad con una o varias de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque en una cromatografía se lleva a cabo una purificación de los péptidos de componentes secundarios indeseables.

17. Método de conformidad con una o varias de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque una mezcla de péptidos, producida según una de las reivindicaciones precedentes, continúa ser fraccionada por medio de etapas de purificación adicionales, en particular mediante cromatografía, hasta un grado de enriquecimiento arbitrariamente alto de uno o varios péptidos.

18. Fracciones de péptido enriquecidas, producidas de conformidad con una o varias de las reivindicaciones precedentes .

19. Uso de los péptidos obtenidos de conformidad con una de las reivindicaciones precedentes como sustancias funcionales en alimentos para animales, alimentos para humanos, productos cosméticos y como principios activos farmacéuticos .