JP2002500372A - 無極性エキスの精製のための新規ゲルの調製 - Google Patents
無極性エキスの精製のための新規ゲルの調製Info
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Abstract
(57)【要約】
直ちに利用できるマクロポーラスイオン性ポリサッカライドクロモトグラフィー媒体から静電結合した脂肪族−又は脂環式置換化アニオン性又はカチオン性ポリサッカライドゲルを調製するための方法が記載される。このようなマクロポーラスイオン性ポリサッカライドクロマトグラフィー媒体の例には、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）、第四級アミノエチル（ＱＡＥ）及びスルホプロピル（ＳＰ）置換化ポリサッカライドゲルがある。これら新規のゲルは、低級アルコール、ケトン、及び水の群からの、１又は複数の抽出溶媒を用いる無極性エキスの単離、回収及び精製のために用いられる。無極性エキスには、アルキル（アルケニル）レソルシノール、ステロイド、トリテルペノイド、心臓配糖体及びサポニン、ステリルフェルレート及び他のフェノール酸コンジュゲート、フラボノイド、極性脂質、アルコール−可溶性抗微生物剤、プロラミン及び他のアルコール−可溶性プロテオリピド複合体の１又は複数のクラスを含み得る。その方法は、疎水性相互作用クロマトグラフィーを用い、吸着、洗浄及び回収のステップに関し、ここでそのエキスは有機溶媒の存在下でその濃縮及び選択の結果として吸着し、脱離するその方法は、更に、更なる使用のためにゲルマトリックスを再生する任意ステップを含む。
Description
【０００１】 本発明は、直ちに利用できるマクロポーラスイオン性ポリサッカライドクロマ
トグラフィー媒体から静電結合した脂肪族−又は芳香族置換化アニオン性又はカ
チオン性ポリサッカライドゲルを調製するための方法に関する。本発明は、更に
、有機溶媒の濃縮及び選択の存在下で及びその結果としてエキスの吸着及び脱離
のために、疎水性相互作用クロマトグラフィーの過程において前記ポリサッカラ
イドゲルを用いる単離、回収及び精製に関する。
トグラフィー媒体から静電結合した脂肪族−又は芳香族置換化アニオン性又はカ
チオン性ポリサッカライドゲルを調製するための方法に関する。本発明は、更に
、有機溶媒の濃縮及び選択の存在下で及びその結果としてエキスの吸着及び脱離
のために、疎水性相互作用クロマトグラフィーの過程において前記ポリサッカラ
イドゲルを用いる単離、回収及び精製に関する。
【０００２】 発明の背景 農業植物、及びそれらの処理による廃水は、例えば要求される治療及び他の利
益を有するとして現在、発見されている成分を含み得る。例えば、特定のサポニ
ンは、抗新生物化学療法への価値を示し（米国特許５，５５８，８６６）、他の
ものは高コレステロール血症の治療に用いられることが見い出されている（米国
特許５，５０２，０３８）。なお更なる抗真菌（例えばCrombie, W.M.L., 及び
Crombie, L. Phytochemistry 25: 2069-2073, 1986）及び免疫原性（米国特許５
，５９７，８０７）活性並びにPrice ら（CRC Crit.Rev.Food Sci.Natr., 26, 2
7-135, 1987 ）により要約される界面活性、乳化及び泡安定特性が知られている
。これらは文献からのわずかな例である。
益を有するとして現在、発見されている成分を含み得る。例えば、特定のサポニ
ンは、抗新生物化学療法への価値を示し（米国特許５，５５８，８６６）、他の
ものは高コレステロール血症の治療に用いられることが見い出されている（米国
特許５，５０２，０３８）。なお更なる抗真菌（例えばCrombie, W.M.L., 及び
Crombie, L. Phytochemistry 25: 2069-2073, 1986）及び免疫原性（米国特許５
，５９７，８０７）活性並びにPrice ら（CRC Crit.Rev.Food Sci.Natr., 26, 2
7-135, 1987 ）により要約される界面活性、乳化及び泡安定特性が知られている
。これらは文献からのわずかな例である。
【０００３】 更に、いくつかのフラボン及びそれらのグリコシドは抗変異原（例えばPeryt,
B. ら、Mutation Res. 269: 201-215, 1992）及び抗腫瘍活性（例えばWei, H.
ら、Cancer Res. 50: 499-502, 1990 ）を示すことが知られている。有益な生物
活性及び機能特性の更なる報告は、いくつかの報告（例えば“Plant flavonoids
in biology and medicine II. Biochemical, cellular, and medical properti
es" Ed. By V Cody, E.Middleton Jr., J.B.Harborne, and A Beretz, Liss Inc
, New York, 1988）に見い出すことができる。
B. ら、Mutation Res. 269: 201-215, 1992）及び抗腫瘍活性（例えばWei, H.
ら、Cancer Res. 50: 499-502, 1990 ）を示すことが知られている。有益な生物
活性及び機能特性の更なる報告は、いくつかの報告（例えば“Plant flavonoids
in biology and medicine II. Biochemical, cellular, and medical properti
es" Ed. By V Cody, E.Middleton Jr., J.B.Harborne, and A Beretz, Liss Inc
, New York, 1988）に見い出すことができる。
【０００４】 カナダ特許出願２，００６，９５７及び２，０１３，１９０は、穀物処理廃液
からの小量の高い価値の副産物を回収するためにエタノール水溶液中で行うイオ
ン交換過程を記述する。ＣＡ２，０１３，１９０によれば、穀物からのアルコー
ルエキスはアニオン性及び／又はカチオン性イオン交換カラムを介して処理され
て少量であるが経済的に価値ある産物が得られる。アニオン・カチオン及び中性
画分は薄層クロマトグラフィーにより分析されいくつかの成分が同定された。例
えば、穀皮のないオートのアルコール抽出からのアニオン画分においては、以下
の成分が同定された：フェノール系酸、例えばフェルラ酸、ｐ−クマル酸及びコ
ーヒー酸；アルカロイド、例えばアベナントラミド：脂肪酸、有機酸及びアミノ
酸。同じアルコールエキスから、中性画分は、化合物、例えば遊離糖；フェノー
ル、例えばフラボノイド：サポニン、例えばアベナコシド及びデスグルコシルア
ベナコシド；アルカロイド、例えばアベナシン；及び種々の極性脂質を含んだ、
種々の画分において同定された化合物は、イオン交換クロマトグラフィーによっ
て個々に単離されなかった。なぜなら多くは用いる条件下で同じ正味の電荷を有
したからである。これにより、この方法のみでは、工業的又は商業的使用のため
のこれらの有用な成分の単離においてほとんど価値がない。更に、この発明にお
いて単離するべきエキスはほとんどの部分について、用いる条件下で中性であり
、電荷に従って分子を分類するイオン交換クロマトグラフィーのみによって単離
することができない。
からの小量の高い価値の副産物を回収するためにエタノール水溶液中で行うイオ
ン交換過程を記述する。ＣＡ２，０１３，１９０によれば、穀物からのアルコー
ルエキスはアニオン性及び／又はカチオン性イオン交換カラムを介して処理され
て少量であるが経済的に価値ある産物が得られる。アニオン・カチオン及び中性
画分は薄層クロマトグラフィーにより分析されいくつかの成分が同定された。例
えば、穀皮のないオートのアルコール抽出からのアニオン画分においては、以下
の成分が同定された：フェノール系酸、例えばフェルラ酸、ｐ−クマル酸及びコ
ーヒー酸；アルカロイド、例えばアベナントラミド：脂肪酸、有機酸及びアミノ
酸。同じアルコールエキスから、中性画分は、化合物、例えば遊離糖；フェノー
ル、例えばフラボノイド：サポニン、例えばアベナコシド及びデスグルコシルア
ベナコシド；アルカロイド、例えばアベナシン；及び種々の極性脂質を含んだ、
種々の画分において同定された化合物は、イオン交換クロマトグラフィーによっ
て個々に単離されなかった。なぜなら多くは用いる条件下で同じ正味の電荷を有
したからである。これにより、この方法のみでは、工業的又は商業的使用のため
のこれらの有用な成分の単離においてほとんど価値がない。更に、この発明にお
いて単離するべきエキスはほとんどの部分について、用いる条件下で中性であり
、電荷に従って分子を分類するイオン交換クロマトグラフィーのみによって単離
することができない。
【０００５】 ＰＣＴ出願ＷＯ９２／０６７１０は、アセトニトリル：水勾配溶出での逆相カ
ラムでのくり返しの半調製用高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用い
て、免疫原性複合体としての最終用途のためのＱｕｉｌｌａｊａサポニンの組成
及び単離／分離技術の両方を開示する。その分離の規模は商業用の大量の生産を
意図したものでなく、むしろ効能の証明のためである。その単離された産物はマ
イクログラムスケールでのみ生産された。商業的適用のための分離技術のスケー
ル・アップは開示されなかった。
ラムでのくり返しの半調製用高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用い
て、免疫原性複合体としての最終用途のためのＱｕｉｌｌａｊａサポニンの組成
及び単離／分離技術の両方を開示する。その分離の規模は商業用の大量の生産を
意図したものでなく、むしろ効能の証明のためである。その単離された産物はマ
イクログラムスケールでのみ生産された。商業的適用のための分離技術のスケー
ル・アップは開示されなかった。
【０００６】 米国特許５，０９４，９６０は、シリカマトリックスに結合したオクタデシル
類を含む樹脂を用いて疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）により不安
定な生物混合物からプロセス化学物質を除去する方法を記載する。水性生物流体
、特にタンパク質含有組成物、例えば血漿、寒冷沈殿物、及び血漿画分に関する
ものから、脂質可溶性プロセス化学物質、例えば合成界面活性剤、化学インデュ
ーサー及び有機溶媒を除去する方法が記載されている。この開示において、材料
及び条件は、タンパク質の吸着及び分離を最小にし、プロセス化学物質の除去を
最大にするように用いられる。実質的に生物材料はカラムに保持されない。更に
、その過程において吸着する化合物及び化学物質のいずれの使用の意図した分野
に関しても示唆はなく、また、カラム上に保持された吸着された成分のいずれの
選択的に回収する特定の条件もない。
類を含む樹脂を用いて疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）により不安
定な生物混合物からプロセス化学物質を除去する方法を記載する。水性生物流体
、特にタンパク質含有組成物、例えば血漿、寒冷沈殿物、及び血漿画分に関する
ものから、脂質可溶性プロセス化学物質、例えば合成界面活性剤、化学インデュ
ーサー及び有機溶媒を除去する方法が記載されている。この開示において、材料
及び条件は、タンパク質の吸着及び分離を最小にし、プロセス化学物質の除去を
最大にするように用いられる。実質的に生物材料はカラムに保持されない。更に
、その過程において吸着する化合物及び化学物質のいずれの使用の意図した分野
に関しても示唆はなく、また、カラム上に保持された吸着された成分のいずれの
選択的に回収する特定の条件もない。
【０００７】 イソフラボンの単離及び精製のためのいくつかの異なる手順が知られている。
D.E.Walterは、脱脂したダイズ片からのイソフラボンゲニスチン及びそのアグリ
コーンゲニステインの調製のための手順を記載する（J.Amer.Chem.Soc. 63, 327
3-3276, 1941）。その手順は、メタノール抽出、アセトン沈殿、遠心及びいくつ
かの再結晶化に関し、アグリコーンゲニステインが酸加水分解により調製される
唯一のイソフラボン、ゲニスチンのみを供した。Ohtaらは、脱脂したダイズから
のイソフラボン抽出のための手順を記載し、ここでその薄片はエタノールで抽出
され、そのエタノールエキスはアセトン及び酢酸エチルで処理される。いくつか
の付加的溶媒中のシリカゲル及びSephadex LH-20TMでの酢酸エチル画分のカラム
クロマトグラフィーは、個々のイソフラボンをくり返しの再結晶化により回収す
ることができるいくつかの画分を作り出した（Agric.Biol.Chem. 43: 1415 〜14
19, 1979）。本質的に同じ分離プロトコルが、エタノールでなく酸性化アセトン
を用いて抽出したイソフラボンを分離するためにFarmakalidis, E.及びMurphy,
P.A.により用いられた（J.Agric.Food Chem. 33: 385-389, 1985）。これらの出
版物は、特定のイソフラボンの研究規模の抽出及び精製のための文献の多くの例
の少しである。しかしながら、溶媒を取り扱う及び捨てる問題並びに経済的な実
行性のため、これらの手順は商業プロセスにスケール・アップするのが難しく、
開示されない収率で一つの化合物を作る。
D.E.Walterは、脱脂したダイズ片からのイソフラボンゲニスチン及びそのアグリ
コーンゲニステインの調製のための手順を記載する（J.Amer.Chem.Soc. 63, 327
3-3276, 1941）。その手順は、メタノール抽出、アセトン沈殿、遠心及びいくつ
かの再結晶化に関し、アグリコーンゲニステインが酸加水分解により調製される
唯一のイソフラボン、ゲニスチンのみを供した。Ohtaらは、脱脂したダイズから
のイソフラボン抽出のための手順を記載し、ここでその薄片はエタノールで抽出
され、そのエタノールエキスはアセトン及び酢酸エチルで処理される。いくつか
の付加的溶媒中のシリカゲル及びSephadex LH-20TMでの酢酸エチル画分のカラム
クロマトグラフィーは、個々のイソフラボンをくり返しの再結晶化により回収す
ることができるいくつかの画分を作り出した（Agric.Biol.Chem. 43: 1415 〜14
19, 1979）。本質的に同じ分離プロトコルが、エタノールでなく酸性化アセトン
を用いて抽出したイソフラボンを分離するためにFarmakalidis, E.及びMurphy,
P.A.により用いられた（J.Agric.Food Chem. 33: 385-389, 1985）。これらの出
版物は、特定のイソフラボンの研究規模の抽出及び精製のための文献の多くの例
の少しである。しかしながら、溶媒を取り扱う及び捨てる問題並びに経済的な実
行性のため、これらの手順は商業プロセスにスケール・アップするのが難しく、
開示されない収率で一つの化合物を作る。
【０００８】 米国特許５，６７９，８０６は、これらの問題のいくつかに着目し、植物材料
からのイソフラボンの単離及び精製のための方法を開示する。その方法は３つの
ステップからなり、それにより植物材料が抽出され、生じたエキスは逆相低圧ポ
リメタクリレート又はＣ18クロマトグラフィーカラムで、そのカラムからの吸着
したイソフラボンの勾配のある溶出により分画され、最終的に特定のイソフラボ
ンを含む画分がそのカラムから溶出される。この方法は、本明細書で開示される
実施形態に記載される方法からいくつかの大きな点で異なる。第１に、本方法は
イソフラボン成分に制限されず、イソフラボンを実質的に含まないサポニン画分
も作り出し、必要に応じて、イソフラボンの全体のグループを、個々の成分につ
いて更に分画することができる。第２に、本方法は、一般にかなり低いローディ
ング能力を示し、ポリサッカライドベースのゲルよりきれいにするのが難しいメ
タクリレート又はＣ18置換化逆相無機支持マトリックスによらない。第３に、本
方法のフレキシビリティーは、条件を変えることができ、単に水性アルコール洗
浄液の量の変えることにより吸着によりイソフラボンを捕獲することも、それら
をカラムを介して溶出して他の非イソフラボン成分を吸着させておくこともでき
る。
からのイソフラボンの単離及び精製のための方法を開示する。その方法は３つの
ステップからなり、それにより植物材料が抽出され、生じたエキスは逆相低圧ポ
リメタクリレート又はＣ18クロマトグラフィーカラムで、そのカラムからの吸着
したイソフラボンの勾配のある溶出により分画され、最終的に特定のイソフラボ
ンを含む画分がそのカラムから溶出される。この方法は、本明細書で開示される
実施形態に記載される方法からいくつかの大きな点で異なる。第１に、本方法は
イソフラボン成分に制限されず、イソフラボンを実質的に含まないサポニン画分
も作り出し、必要に応じて、イソフラボンの全体のグループを、個々の成分につ
いて更に分画することができる。第２に、本方法は、一般にかなり低いローディ
ング能力を示し、ポリサッカライドベースのゲルよりきれいにするのが難しいメ
タクリレート又はＣ18置換化逆相無機支持マトリックスによらない。第３に、本
方法のフレキシビリティーは、条件を変えることができ、単に水性アルコール洗
浄液の量の変えることにより吸着によりイソフラボンを捕獲することも、それら
をカラムを介して溶出して他の非イソフラボン成分を吸着させておくこともでき
る。
【０００９】 米国特許５，４８２，９１４は、型：ＨＯ−（ＣＨ2 ＣＨ2 Ｏ）n −Ｏ−Ｒの
ポリオキシエチレン界面活性剤のグリシジルエステルを共有結合させてヒト及び
動物の体液からのリポタンパク質の除去のために適した改良型ゲルマトリックス
を供することによりリポタンパク質の結合のために合成／改変することができる
。この技術は、ゲルを生産するための化学的方法だけに関し、我々が記述するよ
うなリガンドの静電的結合又は植物材料からの分離又は回収のいずれの例につい
ても記述しない。
ポリオキシエチレン界面活性剤のグリシジルエステルを共有結合させてヒト及び
動物の体液からのリポタンパク質の除去のために適した改良型ゲルマトリックス
を供することによりリポタンパク質の結合のために合成／改変することができる
。この技術は、ゲルを生産するための化学的方法だけに関し、我々が記述するよ
うなリガンドの静電的結合又は植物材料からの分離又は回収のいずれの例につい
ても記述しない。
【００１０】 これにより、なお、高い収率、純度及び変化していない形態で後に回収するこ
とができる高濃度のこれらの化合物を供する商業的に実行できる様式で広範囲の
化合物に適用できる方法、クロマトグラフィー法及び改良吸着媒体についての必
要性がある。消費として捨てるコスト及び交換のコストの両方を削減するために
クロマトグラフィー媒体を何回も再生（再使用することができる方法についての
必要性もある。更に、無極性エキスの商業規模での生産のために、要求される産
物との直接の接触から、溶媒、例えば塩素化炭化水素（例えばクロロホルム、ジ
クロロメタン）、ニトリル（例えばアセトニトリル）、芳香族化合物（例えばベ
ンゼン、トルエン）、他の潜在的に不要な試薬（例えば塩、鉱酸、塩基）、及び
クロマトグラフィー媒体汚染物（メタクリレート−、ジビニルベンゼン−、スチ
レン−モノマー、シリカ等）の直接の接触を削減することも有利であろう。この
目的を達成するため、及び必要な分離を達成するため、要求される分離を行うた
めにクロマトグラフィー媒体を選択的に変化させ、１つのクロマトグラフィー媒
体を用いてより多くの広範囲の許容されない溶媒に依存するよりむしろ唯一の簡
単な許容される溶媒を用いることが要求されよう。それはこの技術が直面する目
的である。
とができる高濃度のこれらの化合物を供する商業的に実行できる様式で広範囲の
化合物に適用できる方法、クロマトグラフィー法及び改良吸着媒体についての必
要性がある。消費として捨てるコスト及び交換のコストの両方を削減するために
クロマトグラフィー媒体を何回も再生（再使用することができる方法についての
必要性もある。更に、無極性エキスの商業規模での生産のために、要求される産
物との直接の接触から、溶媒、例えば塩素化炭化水素（例えばクロロホルム、ジ
クロロメタン）、ニトリル（例えばアセトニトリル）、芳香族化合物（例えばベ
ンゼン、トルエン）、他の潜在的に不要な試薬（例えば塩、鉱酸、塩基）、及び
クロマトグラフィー媒体汚染物（メタクリレート−、ジビニルベンゼン−、スチ
レン−モノマー、シリカ等）の直接の接触を削減することも有利であろう。この
目的を達成するため、及び必要な分離を達成するため、要求される分離を行うた
めにクロマトグラフィー媒体を選択的に変化させ、１つのクロマトグラフィー媒
体を用いてより多くの広範囲の許容されない溶媒に依存するよりむしろ唯一の簡
単な許容される溶媒を用いることが要求されよう。それはこの技術が直面する目
的である。
【００１１】 発明の概要 本発明は、直ちに利用できるマクロポーラスイオン性ポリサッカライドクロマ
トグラフィー媒体から、静電的に結合した脂肪族−又は脂環式置換化アニオン性
又はカチオン性ポリサッカライドゲルを調製するための方法に関する。 本発明は、これにより生産された静電的に結合した脂肪族−又は脂環式置換化
アニオン性又はカチオン性ポリサッカライドゲルにも関する。
トグラフィー媒体から、静電的に結合した脂肪族−又は脂環式置換化アニオン性
又はカチオン性ポリサッカライドゲルを調製するための方法に関する。 本発明は、これにより生産された静電的に結合した脂肪族−又は脂環式置換化
アニオン性又はカチオン性ポリサッカライドゲルにも関する。
【００１２】 本発明は、更に、有機溶媒の存在下で並びにその濃縮及び選択の結果としてエ
キスの吸着及び脱離のための、疎水性相互作用クロマトグラフィーの過程におい
て前記ポリサッカライドゲルを用いる無極性エキスの単離、回収及び精製に関す
る。 これにより、本発明によれば、マクロポーラスのイオン性ポリサッカライドク
ロマトグラフィーマトリックスから、静電的に結合した脂肪族又は脂環式置換化
アニオン又はカチオン性ポリサッカライドゲルを調製する方法であって、 イオン交換により、ポリサッカライドのものと反対の電荷の強くイオン化しや
すい官能基を含む疎水性リガンドを、前記ポリサッカライドの実質的な量の利用
できるイオン性部位が前記リガンドにより占有されて修飾された疎水性相成分を
形成するように結合させることを含む方法を供する。
キスの吸着及び脱離のための、疎水性相互作用クロマトグラフィーの過程におい
て前記ポリサッカライドゲルを用いる無極性エキスの単離、回収及び精製に関す
る。 これにより、本発明によれば、マクロポーラスのイオン性ポリサッカライドク
ロマトグラフィーマトリックスから、静電的に結合した脂肪族又は脂環式置換化
アニオン又はカチオン性ポリサッカライドゲルを調製する方法であって、 イオン交換により、ポリサッカライドのものと反対の電荷の強くイオン化しや
すい官能基を含む疎水性リガンドを、前記ポリサッカライドの実質的な量の利用
できるイオン性部位が前記リガンドにより占有されて修飾された疎水性相成分を
形成するように結合させることを含む方法を供する。
【００１３】 更に、本発明によれば、静電的に結合した脂肪族又は脂環式置換化アニオン又
はカチオン性ポリサッカライドゲルであって、マクロポーラスのイオン性ポリサ
ッカライドゲルマトリックスに静電的に結合した疎水性リガンドを、前記イオン
性ポリサッカライドゲルマトリックスの実質的な量の利用できるイオン性部位が
前記リガンドにより占有されて修飾された疎水性相成分を形成するように含み、
ここで前記リガンドが前記イオン性ポリサッカライドゲルマトリックスのものと
反対の電荷の強くイオン化しやすい官能基を含むことを特徴とするポリサッカラ
イドゲルを供する。
はカチオン性ポリサッカライドゲルであって、マクロポーラスのイオン性ポリサ
ッカライドゲルマトリックスに静電的に結合した疎水性リガンドを、前記イオン
性ポリサッカライドゲルマトリックスの実質的な量の利用できるイオン性部位が
前記リガンドにより占有されて修飾された疎水性相成分を形成するように含み、
ここで前記リガンドが前記イオン性ポリサッカライドゲルマトリックスのものと
反対の電荷の強くイオン化しやすい官能基を含むことを特徴とするポリサッカラ
イドゲルを供する。
【００１４】 本発明は、無極性エキスを単離する方法であって、 水性有機溶媒溶液中の前記無極性エキスを、静電的に結合した、脂肪族又は脂
環式置換化アニオン性又はカチオン性ポリサッカライドゲルマトリックスの群か
ら選択されるゲルマトリックスに接触させ； 該ゲルマトリックスを前記水性有機溶媒溶液で洗い； 該ゲルマトリックスを更なる水性有機溶媒溶液で洗い、ここで該更なる溶液中
の溶媒の割合が増加し；そして 流出物から前記エキスを回収すること を含む方法にも関する。
環式置換化アニオン性又はカチオン性ポリサッカライドゲルマトリックスの群か
ら選択されるゲルマトリックスに接触させ； 該ゲルマトリックスを前記水性有機溶媒溶液で洗い； 該ゲルマトリックスを更なる水性有機溶媒溶液で洗い、ここで該更なる溶液中
の溶媒の割合が増加し；そして 流出物から前記エキスを回収すること を含む方法にも関する。
【００１５】 好ましい実施形態の記載 本発明は、直ちに利用できるマクロポーラスイオン性ポリサッカライドクロマ
トグラフィー媒体から、静電的に結合した脂肪族−又は脂環式−置換化アニオン
性又はカチオン性ポリサッカライドゲルを調製するための方法に関する。本発明
は、更に、有機溶媒の存在下で、その濃縮及び選択の結果として、エキスの吸着
及び脱離のための、疎水性相互作用クロマトグラフィーの過程においてポリサッ
カライドゲルを用いる無極性エキスの単離、回収及び精製に関する。
トグラフィー媒体から、静電的に結合した脂肪族−又は脂環式−置換化アニオン
性又はカチオン性ポリサッカライドゲルを調製するための方法に関する。本発明
は、更に、有機溶媒の存在下で、その濃縮及び選択の結果として、エキスの吸着
及び脱離のための、疎水性相互作用クロマトグラフィーの過程においてポリサッ
カライドゲルを用いる無極性エキスの単離、回収及び精製に関する。
【００１６】 疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）と逆相クロマトグラフィー（Ｒ
ＰＣ）との両方の根本的な原理は類似しており：混合物の成分のクロマトグラフ
ィー分離は定常相に結合した無極性又は疎水性リガンドと移動相との間のアフィ
ニティーの差に基づく。ＲＰＣにおいて、定常相は、通常、いつもではないが、
比較的高い程度の疎水性の特定のリガンドが親水性の定常相を有効に置換し、マ
スクし又は再び表面をおおうように完全に又は極めて高い置換率で導入されてい
る無機の、薄膜又は粒状の親水性支持体、典型的にはシリカからなる。移動相は
、通常、必ずではないが、有機モディファイアー（即ち有機溶媒）、典型的には
メタノール、アセトニトリル、又はテトラヒドロフランを含む。ＨＩＣにおいて
、定常相は、典型的には、比較的低い程度の疎水性を有する特定のリガンドが、
同様に、しかし通常、かなりより低い置換率で、その支持体の親水特性を改変す
るが必ずしも除去しないように導入されている有機の親水性のマクロポーラスの
支持体、典型的には化学的に修飾されたポリサッカライド又はポリアクリルアミ
ドからなる。移動相は、通常、必ずではないが、緩衝液を含む水又は種々の濃度
の塩溶液からなる。
ＰＣ）との両方の根本的な原理は類似しており：混合物の成分のクロマトグラフ
ィー分離は定常相に結合した無極性又は疎水性リガンドと移動相との間のアフィ
ニティーの差に基づく。ＲＰＣにおいて、定常相は、通常、いつもではないが、
比較的高い程度の疎水性の特定のリガンドが親水性の定常相を有効に置換し、マ
スクし又は再び表面をおおうように完全に又は極めて高い置換率で導入されてい
る無機の、薄膜又は粒状の親水性支持体、典型的にはシリカからなる。移動相は
、通常、必ずではないが、有機モディファイアー（即ち有機溶媒）、典型的には
メタノール、アセトニトリル、又はテトラヒドロフランを含む。ＨＩＣにおいて
、定常相は、典型的には、比較的低い程度の疎水性を有する特定のリガンドが、
同様に、しかし通常、かなりより低い置換率で、その支持体の親水特性を改変す
るが必ずしも除去しないように導入されている有機の親水性のマクロポーラスの
支持体、典型的には化学的に修飾されたポリサッカライド又はポリアクリルアミ
ドからなる。移動相は、通常、必ずではないが、緩衝液を含む水又は種々の濃度
の塩溶液からなる。
【００１７】 ＲＰＣは、現在、比較的安定な低分子量有機化合物の高性能液体クロマトグラ
フィー（ＨＰＬＣ）分離のための最も一般的に用いられる技術である。しかしな
がら、ＲＰＣによる多くの生物高分子（例えばタンパク質、ペプチド及び核酸）
の分離は、限られた適用しかないことが見い出されている。なぜなら高い疎水性
定常相とのより強い相互作用及び溶離液としての有機溶媒の使用は高分子のネイ
ティブ構造に対して極めて有害であり得るからである。これらの相互作用の結果
として、高分子のほとんどはホールディングしておらず、変性して、それらの生
物活性のいくつか又は全てが同時に失われる。
フィー（ＨＰＬＣ）分離のための最も一般的に用いられる技術である。しかしな
がら、ＲＰＣによる多くの生物高分子（例えばタンパク質、ペプチド及び核酸）
の分離は、限られた適用しかないことが見い出されている。なぜなら高い疎水性
定常相とのより強い相互作用及び溶離液としての有機溶媒の使用は高分子のネイ
ティブ構造に対して極めて有害であり得るからである。これらの相互作用の結果
として、高分子のほとんどはホールディングしておらず、変性して、それらの生
物活性のいくつか又は全てが同時に失われる。
【００１８】 ＨＩＣは生物高分子の分離及び精製のためにＲＰＣの実用的な代用として開発
された。なぜなら吸着及び脱離の両方の過程は、高分子の生物活性の保持により
好ましい条件である塩濃度を単に変化させることにより水性緩衝液中で行うこと
ができる。しかしながら、低分子量の比較的安定な有機化合物の分離のためのＨ
ＩＣの適用はほとんど行われない。本発明によれば、空間的に近接した位置に疎
水性リガンドに加えて官能性親水性コアを維持することにより、ＨＩＣ定常相は
、全てではないがほとんどのＲＰＣ定常相クロマトグラフィー媒体において利用
できない両親媒性化合物（即ち親水性及び疎水性領域の両方を含む化合物）の分
離及び精製のための特有の利点を示す。このような両親媒性エキスの例には、こ
れらに限らないが、比較的無極性骨格に結合した親水性置換基（即ちグリコシド
残基）を含む、サポニン、フラボノイド及びプロラミンがある。これらの両親媒
性化合物が、特定の有機溶媒、例えば低級アルコール及びケトン、例えばエタノ
ール、イソプロパノール及びアセトンに対して安定性を示すなら、これらの溶媒
はクロマトグラフィーの当業者に知られている勾配、連続又はバッチ回収技術に
より、ゲルに結合した成分を回収する（“ＲＰＣモード”でＨＩＣシステムを行
う）ために用いることができる。
された。なぜなら吸着及び脱離の両方の過程は、高分子の生物活性の保持により
好ましい条件である塩濃度を単に変化させることにより水性緩衝液中で行うこと
ができる。しかしながら、低分子量の比較的安定な有機化合物の分離のためのＨ
ＩＣの適用はほとんど行われない。本発明によれば、空間的に近接した位置に疎
水性リガンドに加えて官能性親水性コアを維持することにより、ＨＩＣ定常相は
、全てではないがほとんどのＲＰＣ定常相クロマトグラフィー媒体において利用
できない両親媒性化合物（即ち親水性及び疎水性領域の両方を含む化合物）の分
離及び精製のための特有の利点を示す。このような両親媒性エキスの例には、こ
れらに限らないが、比較的無極性骨格に結合した親水性置換基（即ちグリコシド
残基）を含む、サポニン、フラボノイド及びプロラミンがある。これらの両親媒
性化合物が、特定の有機溶媒、例えば低級アルコール及びケトン、例えばエタノ
ール、イソプロパノール及びアセトンに対して安定性を示すなら、これらの溶媒
はクロマトグラフィーの当業者に知られている勾配、連続又はバッチ回収技術に
より、ゲルに結合した成分を回収する（“ＲＰＣモード”でＨＩＣシステムを行
う）ために用いることができる。
【００１９】 更に、本発明によれば、我々は、このようなＨＩＣゲルが、このような両親媒
性化合物（即ち臨界ミセル濃度を超えたサポニン、フラボノイド及びプロラミン
の水溶液及び分散液）を、農業植物及び同時に処理する流れから抽出、濃縮及び
精製又はアルコール水性調製物の他の操作において人工的に製造し又は出くわす
場合に形成されることが知られている水性分散液及びミセルを浄化する能力を有
することを観察した。
性化合物（即ち臨界ミセル濃度を超えたサポニン、フラボノイド及びプロラミン
の水溶液及び分散液）を、農業植物及び同時に処理する流れから抽出、濃縮及び
精製又はアルコール水性調製物の他の操作において人工的に製造し又は出くわす
場合に形成されることが知られている水性分散液及びミセルを浄化する能力を有
することを観察した。
【００２０】 本発明の疎水性相互作用クロマトグラフィーポリサッカライドゲルは、共有結
合したカチオンに荷重した官能基、例えば第三級アミン（ＤＥＡＥ，ＰＥＩ）又
は第四級アミン（ＱＡＥ、トリメチルアミン）、例えばDEAE Sephadex A-25TM,
QAE Sephadex A-25 TM及びQ Sepharose TM（Amersham Pharmacia Biotech., Pis
cataway, NJ ）を含むポリアンヒドロガラクタン又はポリデキストラン種、例え
ば架橋アガロースの中性ポリサッカライドから作られたカチオンに置換されたポ
リサッカライドゲルマトリックスからなり得る。本発明のこの実施形態によれば
、これらのゲルは疎水性リガンドにより改変される。そのリガンドは、アルキル
（アルケニル）スルホネート及びスルフェート、アルキル（アルケニル）ホスホ
ネート及びホスフェート、モノ−及びジ−アルキル（アルケニル）ホスファチジ
ン酸を含むアニオン界面活性剤のクラスのアニオンに結合したアルキル置換体か
ら選択される。そのリガンドは、タウロコレート及びタウロデオキシコレートを
含むアニオン界面活性剤のクラスのアニオンに結合した脂環式置換体も、アルキ
ル（アルケニル）−アリールスルホネート、例えばドデシルベンゼンスルホン酸
及びアルキル（アルケニル）ベンゼンスルホネートを含むアニオン界面活性剤の
クラスの混合リガンドも含み得る。本発明によれば、アルキル（アルケニル）置
換基は約４〜約１８の炭素を含む。
合したカチオンに荷重した官能基、例えば第三級アミン（ＤＥＡＥ，ＰＥＩ）又
は第四級アミン（ＱＡＥ、トリメチルアミン）、例えばDEAE Sephadex A-25TM,
QAE Sephadex A-25 TM及びQ Sepharose TM（Amersham Pharmacia Biotech., Pis
cataway, NJ ）を含むポリアンヒドロガラクタン又はポリデキストラン種、例え
ば架橋アガロースの中性ポリサッカライドから作られたカチオンに置換されたポ
リサッカライドゲルマトリックスからなり得る。本発明のこの実施形態によれば
、これらのゲルは疎水性リガンドにより改変される。そのリガンドは、アルキル
（アルケニル）スルホネート及びスルフェート、アルキル（アルケニル）ホスホ
ネート及びホスフェート、モノ−及びジ−アルキル（アルケニル）ホスファチジ
ン酸を含むアニオン界面活性剤のクラスのアニオンに結合したアルキル置換体か
ら選択される。そのリガンドは、タウロコレート及びタウロデオキシコレートを
含むアニオン界面活性剤のクラスのアニオンに結合した脂環式置換体も、アルキ
ル（アルケニル）−アリールスルホネート、例えばドデシルベンゼンスルホン酸
及びアルキル（アルケニル）ベンゼンスルホネートを含むアニオン界面活性剤の
クラスの混合リガンドも含み得る。本発明によれば、アルキル（アルケニル）置
換基は約４〜約１８の炭素を含む。
【００２１】 疎水性相互作用クロマトグラフィーポリサッカライドゲルは、共有結合したア
ニオンに荷電した官能基、例えばアルキル（アルケニル）スルホネート及びアル
キル（アルケニル）ホスホネートを含む、ポリアンヒドロガラクタン又はポリデ
キストラン種、例えば架橋アガロースの中性ポリサッカライドから作られたアニ
オンに置換されたポリサッカライドゲルマトリックスからなってもよい。特定の
例には、スルホプロピル（ＳＰ）、例えばSP Sephadex C-25TM（Pharmacia, Pis
cataway, NJ ）がある。S Sepharose TMは本発明のこの実施形態によるポリサッ
カライドゲルマトリックスの更なる例である。本発明のこの実施形態によれば、
これらのゲルは疎水性リガンドにより改変される。この実施形態において、疎水
性リガンドは、カチオン性界面活性剤のクラスのカチオンに結合したアルキル置
換体、例えばアルキル（アルケニル）トリメチルアンモニウムハライド、例えば
CETRIMIDE TM（Sigma Chemical Co., St.Louis, MO）及び第四級アルキル（アル
ケニル）アンモニウムハライド、例えばテトラブチルアンモニウムブロミド（Si
gma Chemical Co., St.Louis, MO）、第四級アルキル（アルケニル）ピリジニウ
ムハライド、例えばヘキサデシルピリジニウムブロミド、又はアルキル（アルケ
ニル）マグネシウムハライド及び同様のグリニアール試薬である。本発明のこの
態様によれば、アルキル（アルケニル）置換基は、約４〜約１８の炭素を含む。
ニオンに荷電した官能基、例えばアルキル（アルケニル）スルホネート及びアル
キル（アルケニル）ホスホネートを含む、ポリアンヒドロガラクタン又はポリデ
キストラン種、例えば架橋アガロースの中性ポリサッカライドから作られたアニ
オンに置換されたポリサッカライドゲルマトリックスからなってもよい。特定の
例には、スルホプロピル（ＳＰ）、例えばSP Sephadex C-25TM（Pharmacia, Pis
cataway, NJ ）がある。S Sepharose TMは本発明のこの実施形態によるポリサッ
カライドゲルマトリックスの更なる例である。本発明のこの実施形態によれば、
これらのゲルは疎水性リガンドにより改変される。この実施形態において、疎水
性リガンドは、カチオン性界面活性剤のクラスのカチオンに結合したアルキル置
換体、例えばアルキル（アルケニル）トリメチルアンモニウムハライド、例えば
CETRIMIDE TM（Sigma Chemical Co., St.Louis, MO）及び第四級アルキル（アル
ケニル）アンモニウムハライド、例えばテトラブチルアンモニウムブロミド（Si
gma Chemical Co., St.Louis, MO）、第四級アルキル（アルケニル）ピリジニウ
ムハライド、例えばヘキサデシルピリジニウムブロミド、又はアルキル（アルケ
ニル）マグネシウムハライド及び同様のグリニアール試薬である。本発明のこの
態様によれば、アルキル（アルケニル）置換基は、約４〜約１８の炭素を含む。
【００２２】 これにより、本発明は、本明細書に記載されるような簡単なイオン交換手順に
より直ちに利用できる出発材料からの特定のＨＩＣゲルの生産に関する。基本的
に、２つの異なる型のイオン交換体、アニオン又はカチオン性のいずれか、好ま
しくはイオンで置換されたポリサッカライドゲルからなるものを親水性コアとし
て用いることができる。このコアに、アニオン性又はカチオン性界面活性剤の上
述のクラスから選択され、かつポリサッカライドの電荷と反対の電荷の強力にイ
オン化できる官能基を含む疎水性リガンドを、もとのポリサッカライド内の利用
できるイオン性部位の全て又は実質的に全てがリガンドにより占有されて改変さ
れた疎水性相成分を形成するように、イオン交換により結合される。用語“全て
又は実質的に全て”は、もとのポリサッカライド中の利用できるイオン性部位の
少くとも７０％がリガンドにより占有されることを意味し、利用できるイオン性
部位の少くとも９０％までを含み得る。
より直ちに利用できる出発材料からの特定のＨＩＣゲルの生産に関する。基本的
に、２つの異なる型のイオン交換体、アニオン又はカチオン性のいずれか、好ま
しくはイオンで置換されたポリサッカライドゲルからなるものを親水性コアとし
て用いることができる。このコアに、アニオン性又はカチオン性界面活性剤の上
述のクラスから選択され、かつポリサッカライドの電荷と反対の電荷の強力にイ
オン化できる官能基を含む疎水性リガンドを、もとのポリサッカライド内の利用
できるイオン性部位の全て又は実質的に全てがリガンドにより占有されて改変さ
れた疎水性相成分を形成するように、イオン交換により結合される。用語“全て
又は実質的に全て”は、もとのポリサッカライド中の利用できるイオン性部位の
少くとも７０％がリガンドにより占有されることを意味し、利用できるイオン性
部位の少くとも９０％までを含み得る。
【００２３】 これらの新しいゲルの調製の例として、製造元から得られ、エタノール水溶液
、例えば５０％エタノール水溶液で平衡化した塩化物型のQAE Sephadex A-25 TM アニオン交換クロマトグラフィーゲルをカラムに重力によってつめた。溶媒は必
ずしもエタノール水溶液である必要はないが、水、又はポリサッカライドコアマ
トリックスの膨潤に作用するのに十分な水を含むメタノール、イソプロパノール
もしくはアセトン水溶液のような溶媒が本発明の目的のために有効であろう。カ
ラムは、最初に、水酸化物（即ちＯＨ- ）型に変換される。一実施形態において
、このステップは、希釈塩基の水酸化物イオン等量（調製したゲルの量について
の量）の過剰量をカラムに流し、次にそのカラムを中性にすることにより行われ
る。１つの例において、希釈塩基は５０％エタノール水溶液中ＮａＯＨの０．５
Ｎ溶液であり、洗浄液も５０％エタノール水溶液である。塩基は必ずしもＮａＯ
Ｈでなく、ＫＯＨ，ＮＨ4 ＯＨの及び上述のようないずれの塩基でもよく、溶媒
は必ずしも５０％エタノール水溶液である必要はない。次にカラムは、その界面
活性剤の過剰なイオン等量を単に通過させ、再びそのカラムをいずれの過剰な界
面活性剤も除去するように洗うことにより、要求される新規アニオン性界面活性
剤置換型に変換される。一例において、アニオン性界面活性剤は５０％エタノー
ル水溶液中０．５Ｎのドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）であり、洗浄溶媒は５
０％エタノール水溶液である。この手順は、上述のアニオン界面活性剤のいずれ
についても本質的に同じであり、イオン交換クロマトグラフィーの当業者に明ら
かであろう。
、例えば５０％エタノール水溶液で平衡化した塩化物型のQAE Sephadex A-25 TM アニオン交換クロマトグラフィーゲルをカラムに重力によってつめた。溶媒は必
ずしもエタノール水溶液である必要はないが、水、又はポリサッカライドコアマ
トリックスの膨潤に作用するのに十分な水を含むメタノール、イソプロパノール
もしくはアセトン水溶液のような溶媒が本発明の目的のために有効であろう。カ
ラムは、最初に、水酸化物（即ちＯＨ- ）型に変換される。一実施形態において
、このステップは、希釈塩基の水酸化物イオン等量（調製したゲルの量について
の量）の過剰量をカラムに流し、次にそのカラムを中性にすることにより行われ
る。１つの例において、希釈塩基は５０％エタノール水溶液中ＮａＯＨの０．５
Ｎ溶液であり、洗浄液も５０％エタノール水溶液である。塩基は必ずしもＮａＯ
Ｈでなく、ＫＯＨ，ＮＨ4 ＯＨの及び上述のようないずれの塩基でもよく、溶媒
は必ずしも５０％エタノール水溶液である必要はない。次にカラムは、その界面
活性剤の過剰なイオン等量を単に通過させ、再びそのカラムをいずれの過剰な界
面活性剤も除去するように洗うことにより、要求される新規アニオン性界面活性
剤置換型に変換される。一例において、アニオン性界面活性剤は５０％エタノー
ル水溶液中０．５Ｎのドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）であり、洗浄溶媒は５
０％エタノール水溶液である。この手順は、上述のアニオン界面活性剤のいずれ
についても本質的に同じであり、イオン交換クロマトグラフィーの当業者に明ら
かであろう。
【００２４】 これらの新しいゲルの調製のための方法の別の例として、製造元から得られ、
エタノール水溶液、例えば５０％エタノール水溶液で平衡化したナトリウム型の
SP Sephadex C-25TMカチオン交換クロマトグラフィーゲルをカラムに重力によっ
てつめた。溶媒は必ずしもエタノール水溶液である必要はないが、水、又はポリ
サッカライドコアマトリックスの膨潤に作用するのに十分な水を含むメタノール
、イソプロパノールもしくはアセトン水溶液のような溶媒が本発明の目的のため
に有効であろう。カラムは、最初に、水素（即ちＨ+ ）型に変換される。一実施
形態において、このステップは、希釈酸の水素イオン等量（調製したゲルの量に
ついての量）の過剰量をカラムに流し、次にそのカラムを中性pHにすることによ
り行われる。１つの例において、希釈塩基は５０％エタノール水溶液中ＨＣｌの
０．１Ｎ溶液であり、洗浄液も５０％エタノール水溶液である。酸は必ずしもＨ
Ｃｌでなく、Ｈ2 ＳＯ4 、トリフルオロ酢酸、Ｈ3 ＰＯ4 等及び上述のようない
ずれの酸でもよく、溶媒は必ずしも５０％エタノール水溶液である必要はない。
次にカラムは、その界面活性剤の過剰なイオン等量を単に通過させ、再びそのカ
ラムをいずれの過剰な界面活性剤も除去するように洗うことにより、要求される
新規カチオン性界面活性剤置換型に変換される。一例において、カチオン性界面
活性剤は５０％エタノール水溶液中０．５Ｎのヘキサデシルトリメチルアンモニ
ウム（ＨＤＴＭＡ+ ）であり、洗浄溶媒は５０％エタノール水溶液である。この
手順は、上述のカチオン界面活性剤のいずれについても本質的に同じであり、イ
オン交換クロマトグラフィーの当業者に明らかであろう。
エタノール水溶液、例えば５０％エタノール水溶液で平衡化したナトリウム型の
SP Sephadex C-25TMカチオン交換クロマトグラフィーゲルをカラムに重力によっ
てつめた。溶媒は必ずしもエタノール水溶液である必要はないが、水、又はポリ
サッカライドコアマトリックスの膨潤に作用するのに十分な水を含むメタノール
、イソプロパノールもしくはアセトン水溶液のような溶媒が本発明の目的のため
に有効であろう。カラムは、最初に、水素（即ちＨ+ ）型に変換される。一実施
形態において、このステップは、希釈酸の水素イオン等量（調製したゲルの量に
ついての量）の過剰量をカラムに流し、次にそのカラムを中性pHにすることによ
り行われる。１つの例において、希釈塩基は５０％エタノール水溶液中ＨＣｌの
０．１Ｎ溶液であり、洗浄液も５０％エタノール水溶液である。酸は必ずしもＨ
Ｃｌでなく、Ｈ2 ＳＯ4 、トリフルオロ酢酸、Ｈ3 ＰＯ4 等及び上述のようない
ずれの酸でもよく、溶媒は必ずしも５０％エタノール水溶液である必要はない。
次にカラムは、その界面活性剤の過剰なイオン等量を単に通過させ、再びそのカ
ラムをいずれの過剰な界面活性剤も除去するように洗うことにより、要求される
新規カチオン性界面活性剤置換型に変換される。一例において、カチオン性界面
活性剤は５０％エタノール水溶液中０．５Ｎのヘキサデシルトリメチルアンモニ
ウム（ＨＤＴＭＡ+ ）であり、洗浄溶媒は５０％エタノール水溶液である。この
手順は、上述のカチオン界面活性剤のいずれについても本質的に同じであり、イ
オン交換クロマトグラフィーの当業者に明らかであろう。
【００２５】 これらのカチオンで置換された及びアニオンで置換されたポリサッカライドゲ
ルの使用は、使用者が、特定の適用のためのゲルへの結合のための適切な対イオ
ンを選択することを許容する選択的疎水性相互作用分離技術の全体の新しい領域
を切り開き、例えば、ステロイドの単離のため、エストロゲン、性ホルモンに結
合するためタウロコール酸又はコレステロールスルホネートを用いるであろうし
；少しの可能性しか言及しないか、健康食品成分のために異性体混合物を分離す
るためにシス対トランス不飽和アルキル基を用いるであろう。クロマトグラフィ
ーの当業者は、特定の適用のために調製することができる他の類似したゲルを直
ちに認めるであろう。
ルの使用は、使用者が、特定の適用のためのゲルへの結合のための適切な対イオ
ンを選択することを許容する選択的疎水性相互作用分離技術の全体の新しい領域
を切り開き、例えば、ステロイドの単離のため、エストロゲン、性ホルモンに結
合するためタウロコール酸又はコレステロールスルホネートを用いるであろうし
；少しの可能性しか言及しないか、健康食品成分のために異性体混合物を分離す
るためにシス対トランス不飽和アルキル基を用いるであろう。クロマトグラフィ
ーの当業者は、特定の適用のために調製することができる他の類似したゲルを直
ちに認めるであろう。
【００２６】 上述の通り、本発明は、無極性エキスの単離、回収及び精製のためのこれらの
ゲルの使用にも関する。この本発明の態様は、単離すべき無極性エキスの疎水性
及び多少の水を回収溶媒に加えることにより行うことができる回収溶媒の濃度を
変えることによって生ずる親水性の変化に依存する。より詳しくは、本発明のこ
の実施形態は、芳香族及び／又はオレフィン官能基を含むものと比べた、脂肪族
及び／又は脂環式官能基を含む比較的無極性のエキス及び脂肪族−又は脂環式置
換化ポリサッカライドベースのゲルの間の疎水性引力の観察される選択的な差に
；並びに単に多少の水を加えることにより適切な溶媒の組成を変えることにより
行うことができるこの引力の変化に基づく。
ゲルの使用にも関する。この本発明の態様は、単離すべき無極性エキスの疎水性
及び多少の水を回収溶媒に加えることにより行うことができる回収溶媒の濃度を
変えることによって生ずる親水性の変化に依存する。より詳しくは、本発明のこ
の実施形態は、芳香族及び／又はオレフィン官能基を含むものと比べた、脂肪族
及び／又は脂環式官能基を含む比較的無極性のエキス及び脂肪族−又は脂環式置
換化ポリサッカライドベースのゲルの間の疎水性引力の観察される選択的な差に
；並びに単に多少の水を加えることにより適切な溶媒の組成を変えることにより
行うことができるこの引力の変化に基づく。
【００２７】 無極性エキスは、そのエキスが、５％〜９５％の組成の範囲内でアルコール水
溶液中で部分的にのみ可溶性であることを意味する。本発明の一態様において、
分離することができる化合物のグループは無極性化合物であり、これらに限らな
いが、ステロイド及びトリテルペノイド誘導体、例えばサポニン、強心配糖体及
びステリルコンジュゲート；フラボノイド、例えばフラボン、フラボノール、イ
ソフラボン及びそれらのグリコシド全て；フェノールコンジュゲート、例えば脂
肪族アルコールエステル及びアミド；極性脂質、例えばモノ−及びジ−グリセリ
ド及びそれらの誘導体並びにアルキル（アルケニル）レソルシノール；並びにプ
ロラミン、例えばゼイン、アベニン、ホルディン又はグリアジンからなる群から
選択される。本発明の無極性化合物は、天然の化合物と合成化合物との両方を含
む。
溶液中で部分的にのみ可溶性であることを意味する。本発明の一態様において、
分離することができる化合物のグループは無極性化合物であり、これらに限らな
いが、ステロイド及びトリテルペノイド誘導体、例えばサポニン、強心配糖体及
びステリルコンジュゲート；フラボノイド、例えばフラボン、フラボノール、イ
ソフラボン及びそれらのグリコシド全て；フェノールコンジュゲート、例えば脂
肪族アルコールエステル及びアミド；極性脂質、例えばモノ−及びジ−グリセリ
ド及びそれらの誘導体並びにアルキル（アルケニル）レソルシノール；並びにプ
ロラミン、例えばゼイン、アベニン、ホルディン又はグリアジンからなる群から
選択される。本発明の無極性化合物は、天然の化合物と合成化合物との両方を含
む。
【００２８】 合成化合物は、合成化学手段により調製されるいずれの化合物をも意味する。
本発明の方法は、医薬的又は治療的価値を有する合成化合物の精製のために特に
役立つ。 天然の化合物は上述の化合物を含み、藻類、真菌及び単細胞生物からの化合物
も含む。これらの天然の化合物は、微生物中に自然に存在する化合物も、遺伝子
が変化された細胞により生産されるものも含む。
本発明の方法は、医薬的又は治療的価値を有する合成化合物の精製のために特に
役立つ。 天然の化合物は上述の化合物を含み、藻類、真菌及び単細胞生物からの化合物
も含む。これらの天然の化合物は、微生物中に自然に存在する化合物も、遺伝子
が変化された細胞により生産されるものも含む。
【００２９】 本発明の一実施形態において、異なるソースからサポニンを単離・精製するた
めに新しいゲルが用いられる。サポニンは５までの糖を含むサポゲノール（トリ
テルペノイドアグリコーン）である。一般にサポニンは、特にダイズサポニンは
、ダイズの成長するマーケット・シェアのため、及び薬理的見地からも、かなり
の注目を集めている。ダイズサポニンは溶血、甲状腺腫誘発性、抗酸化性及び脂
質低下特性も示すと報告されている。それらは、ダイズベースの食品ににがく渋
い風味を与えるもととも示されている。それらの単離及びキャラクタリゼーショ
ンは、新しい品種の交配のため及び薬理的に活性な付加価値製品としてのそれら
の生産のために重要である。しかしながらそれらの複合化学のため、知られてい
る化学的単離技術（即ちサポニン化又は溶媒抽出）は、少い量の又は水和した産
物を作り出し得る。
めに新しいゲルが用いられる。サポニンは５までの糖を含むサポゲノール（トリ
テルペノイドアグリコーン）である。一般にサポニンは、特にダイズサポニンは
、ダイズの成長するマーケット・シェアのため、及び薬理的見地からも、かなり
の注目を集めている。ダイズサポニンは溶血、甲状腺腫誘発性、抗酸化性及び脂
質低下特性も示すと報告されている。それらは、ダイズベースの食品ににがく渋
い風味を与えるもととも示されている。それらの単離及びキャラクタリゼーショ
ンは、新しい品種の交配のため及び薬理的に活性な付加価値製品としてのそれら
の生産のために重要である。しかしながらそれらの複合化学のため、知られてい
る化学的単離技術（即ちサポニン化又は溶媒抽出）は、少い量の又は水和した産
物を作り出し得る。
【００３０】 一例において、本発明は、オートサポニンの単離のために用いられる。２つの
異なる型のサポニンがオートの仁から単離されており：それは、アベナコシド型
五環トリテルペノイドサポニンとアベナシン型ステロイドサポニンである。両方
の型は、選択的な抗微生物活性を示し（例えばWubben, J.P.ら、Phytorath. 86,
986-992, 1996; Maizel, J.V.ら、Biochemistry 3, 424-426, 1964 ）、ヘルス
・ケア製品のための局所用クリーム及びローションにおける活性成分として又は
農業種子ドレッシング製剤のための抗菌剤として価値あることが判明している。
異なる型のサポニンがオートの仁から単離されており：それは、アベナコシド型
五環トリテルペノイドサポニンとアベナシン型ステロイドサポニンである。両方
の型は、選択的な抗微生物活性を示し（例えばWubben, J.P.ら、Phytorath. 86,
986-992, 1996; Maizel, J.V.ら、Biochemistry 3, 424-426, 1964 ）、ヘルス
・ケア製品のための局所用クリーム及びローションにおける活性成分として又は
農業種子ドレッシング製剤のための抗菌剤として価値あることが判明している。
【００３１】 本発明の更なる実施形態において、新しいゲルは、キノアからのサポニンの単
離のために用いた。ケノポジウム・キノア・ウイルド（Chenopodium quinoa wil ld ）（キノア）は南アフリカ原生の穀物である。近年、その穀物の栄養価（タン
パク質成分は新鮮な重量で平均１４％）及びその丈夫な成長特性のため、多くの
科学的関心が集まっている。不幸なことに、その穀物は、部分的にサポニンの存
在によると考えられる種々のコートのにがさのため、ヒトの食料原として限られ
た使用しかない。これらのサポニンは、主に、花被及び果皮を含む穀物の外層に
主に見い出される。伝統的にその穀物は消費する前にこれらのにがい成分のほと
んどを除去するために水で洗われている。
離のために用いた。ケノポジウム・キノア・ウイルド（Chenopodium quinoa wil ld ）（キノア）は南アフリカ原生の穀物である。近年、その穀物の栄養価（タン
パク質成分は新鮮な重量で平均１４％）及びその丈夫な成長特性のため、多くの
科学的関心が集まっている。不幸なことに、その穀物は、部分的にサポニンの存
在によると考えられる種々のコートのにがさのため、ヒトの食料原として限られ
た使用しかない。これらのサポニンは、主に、花被及び果皮を含む穀物の外層に
主に見い出される。伝統的にその穀物は消費する前にこれらのにがい成分のほと
んどを除去するために水で洗われている。
【００３２】 過去１０年で、約２０のサポニンが、中性及び酸性の両方がキノアから単離さ
れている（例えばMizui, Fら、Chem.Pharm.Bull. 36: 1415-1498, 1988; Mizui,
F. ら、Chem.Pharm.Bull. 38: 375-377, 1990）。これらのサポニンは、３つの
五環トリテルペンアグリコン：オレアノール酸、ヘデラゲニン又はフィトラッカ
ゲン酸のうちの１つを含む。中性サポニンのグリコシル成分は、グルコース、ガ
ラクトース、又はアラビノースのいずれかの組合せからなり、モノ、ジ、トリ及
びテトラグリコシドを生産し得る。酸性サポニンは、トリテルペノイド骨格のＣ
−２８に酸性官能基を、又はＣ−３に結合したグルクロン酸残基を含み得る。一
般に、これらのサポニンは４までのグリコシル残基を含むかなり極性である。二
酸及びビスデスキシドが単離されている。
れている（例えばMizui, Fら、Chem.Pharm.Bull. 36: 1415-1498, 1988; Mizui,
F. ら、Chem.Pharm.Bull. 38: 375-377, 1990）。これらのサポニンは、３つの
五環トリテルペンアグリコン：オレアノール酸、ヘデラゲニン又はフィトラッカ
ゲン酸のうちの１つを含む。中性サポニンのグリコシル成分は、グルコース、ガ
ラクトース、又はアラビノースのいずれかの組合せからなり、モノ、ジ、トリ及
びテトラグリコシドを生産し得る。酸性サポニンは、トリテルペノイド骨格のＣ
−２８に酸性官能基を、又はＣ−３に結合したグルクロン酸残基を含み得る。一
般に、これらのサポニンは４までのグリコシル残基を含むかなり極性である。二
酸及びビスデスキシドが単離されている。
【００３３】 現在、キノアサポニンは、免疫学的アジュバントとして医薬調製物に用いられ
ている（例えば米国特許５，５９７，８０７及び５，６８８，７２２）。それら
は、非特異的に免疫を刺激し、所定の抗原に対する免疫学的応答を増強し、そし
て投与された薬剤の粘膜吸収を増強することが示されている。 キノアからサポニンを単離する方法は、水又はメタノールによる完全な種子又
はブラン（ふすま）画分の抽出に関連している（例えば、Ridout, C.ら、J.Sci.
Food Agric. 54: 165-176, 1991 、及びMeyer, B.N. ら、J.Agric.Food Chem. 3
8: 205-208, 990 ）。両方の手順において、抽出液は無極性溶媒例えばペトロレ
ウムエーテル又はジエチルエーテルにより脱脂される。溶媒パーティション（通
常ｎ−ブタノール／水）、次にメタノール／クロロホルムでシリカゲルを用いる
古典的なカラムクロマトグラフィーによりこれらの化合物が単離される。これら
の方法は、じゃまな溶媒、不完全な成分のパティショニング及び収率のばらつき
のための商業用に開発するのが難しいであろう。キノアサポニンを検出するため
のいくつかの化学的、分光的、酵素的及びバイオアッセイの方法は、例えばＧＣ
（例えばBurnouf-Radosevich, M., ら、Phytochemistry 24: 2063-2069, 1984）
、ＨＰＬＣ（例えばRuales, J., 及びNair, B., Food Chemistry 48: 137-143,
1993）、及びＴＬＣ（例えばNg, K.G., ら、Food Chemistry 49: 311-315, 1994
）で文献において報告されている。個々のサポニンは、ＮＭＲ及びＧＣ−ＭＳに
よりキャラクタライズされている（例えばMa, W-W., ら., J.Nat.Prod. 52, 113
2-1135, 1989）。
ている（例えば米国特許５，５９７，８０７及び５，６８８，７２２）。それら
は、非特異的に免疫を刺激し、所定の抗原に対する免疫学的応答を増強し、そし
て投与された薬剤の粘膜吸収を増強することが示されている。 キノアからサポニンを単離する方法は、水又はメタノールによる完全な種子又
はブラン（ふすま）画分の抽出に関連している（例えば、Ridout, C.ら、J.Sci.
Food Agric. 54: 165-176, 1991 、及びMeyer, B.N. ら、J.Agric.Food Chem. 3
8: 205-208, 990 ）。両方の手順において、抽出液は無極性溶媒例えばペトロレ
ウムエーテル又はジエチルエーテルにより脱脂される。溶媒パーティション（通
常ｎ−ブタノール／水）、次にメタノール／クロロホルムでシリカゲルを用いる
古典的なカラムクロマトグラフィーによりこれらの化合物が単離される。これら
の方法は、じゃまな溶媒、不完全な成分のパティショニング及び収率のばらつき
のための商業用に開発するのが難しいであろう。キノアサポニンを検出するため
のいくつかの化学的、分光的、酵素的及びバイオアッセイの方法は、例えばＧＣ
（例えばBurnouf-Radosevich, M., ら、Phytochemistry 24: 2063-2069, 1984）
、ＨＰＬＣ（例えばRuales, J., 及びNair, B., Food Chemistry 48: 137-143,
1993）、及びＴＬＣ（例えばNg, K.G., ら、Food Chemistry 49: 311-315, 1994
）で文献において報告されている。個々のサポニンは、ＮＭＲ及びＧＣ−ＭＳに
よりキャラクタライズされている（例えばMa, W-W., ら., J.Nat.Prod. 52, 113
2-1135, 1989）。
【００３４】 本発明の一実施形態において、化合物は植物材料から単離することができる。
植物材料との用語には、農業、ぶどう栽培、園芸又は水産養殖の産物を含む。農
業植物には、穀物、例えばコムギ、オート、ライムギ、コーン、コメ、キノア、
アマランス、ソバ（buckwheat ）、ライコムギ（triticale ）又はオオムギ；又
は脂肪種子、例えばダイズ、カノーラ、亜麻仁、ヒマワリ、ベニバナ、又はマス
タード；又はマメ作物、例えばエンドウ、ヒラマメ又はインゲンマメ；又は飼料
作物、例えばフェスキュー、ティモシー、クローバー、アルファルファ又はホウ
ィートグラス；又はハーブ、例えばパセリ、ローズマリー、セージ、又はミント
がある。化合物は、それらのコプロセッシングストリームから回収することもで
きる。しかしながら、本発明は、植物又は農業コプロセッシング産物から単離さ
れた化合物に限られない。本発明は、藻類、真菌及び単細胞生物から化合物を抽
出するために用いることもできる。
植物材料との用語には、農業、ぶどう栽培、園芸又は水産養殖の産物を含む。農
業植物には、穀物、例えばコムギ、オート、ライムギ、コーン、コメ、キノア、
アマランス、ソバ（buckwheat ）、ライコムギ（triticale ）又はオオムギ；又
は脂肪種子、例えばダイズ、カノーラ、亜麻仁、ヒマワリ、ベニバナ、又はマス
タード；又はマメ作物、例えばエンドウ、ヒラマメ又はインゲンマメ；又は飼料
作物、例えばフェスキュー、ティモシー、クローバー、アルファルファ又はホウ
ィートグラス；又はハーブ、例えばパセリ、ローズマリー、セージ、又はミント
がある。化合物は、それらのコプロセッシングストリームから回収することもで
きる。しかしながら、本発明は、植物又は農業コプロセッシング産物から単離さ
れた化合物に限られない。本発明は、藻類、真菌及び単細胞生物から化合物を抽
出するために用いることもできる。
【００３５】 洗浄溶媒、抽出溶媒、又は回収溶媒は、本発明の文脈において、交換可能に用
いられ、これらに限られないが、低級アルコール、例えばメタノール、エタノー
ル、プロパノール又はイソプロパノール；ケトン、例えばアセトン；水、及び低
級アルコール又はケトンの水との組合せを含み得る。 天然の植物構成物の抽出の当業者は、ペルコレーション、バット（vat ）抽出
、逆流抽出等を含むいくつかの異なる抽出法が文献に存在することを認めるであ
ろう。用いる抽出の特定の方法は本発明の方法に重要ではない。
いられ、これらに限られないが、低級アルコール、例えばメタノール、エタノー
ル、プロパノール又はイソプロパノール；ケトン、例えばアセトン；水、及び低
級アルコール又はケトンの水との組合せを含み得る。 天然の植物構成物の抽出の当業者は、ペルコレーション、バット（vat ）抽出
、逆流抽出等を含むいくつかの異なる抽出法が文献に存在することを認めるであ
ろう。用いる抽出の特定の方法は本発明の方法に重要ではない。
【００３６】 本発明は、関心の化合物を単離するために、疎水性相互作用クロマトグラフィ
ーのみ又は他の分離技術を組み合わせて用いる。この態様において、本願に規定
される本発明は、疎水性相互作用クロマトグラフィーの方法下で脂肪族置換化ポ
リサッカライドゲルマトリックスを用いる“A Process for the Puritication o
f Non-Polar Extractives ”との題名の出願人の同時係属出願に規定される分離
技術と組み合わせることができる。
ーのみ又は他の分離技術を組み合わせて用いる。この態様において、本願に規定
される本発明は、疎水性相互作用クロマトグラフィーの方法下で脂肪族置換化ポ
リサッカライドゲルマトリックスを用いる“A Process for the Puritication o
f Non-Polar Extractives ”との題名の出願人の同時係属出願に規定される分離
技術と組み合わせることができる。
【００３７】 本発明による無極性エキスを精製する方法は、３つの基本的なステップ：吸着
、洗浄及び回収に関する。本発明の一態様によれば、その方法は、じゃまな化学
処理の使用又は過剰な塩の形成もしくは回収不能な処理廃流なしに、カラムを再
生する第４の任意的ステップに関する。 本発明によれば、アルコール水溶液中の類似した溶解物を含む広範囲のエキス
の分離及び精製は、特異的に改変したポリサッカライドゲルへのそれらの示差的
結合に基づいて行うことができる。このようなエキスには、ステロイド及びトリ
テルペノイド、例えばサポニン、強心配糖体、及びステリルコンジュゲート；フ
ラボノイド、例えばフラボン、フラボノール、イソフラボン及びそれらのグリコ
シド全て；フェノール系コンジュゲート、例えば脂肪アルコール、エステル及び
アミド；極性脂質、例えばモノ−及びジ−グリセリド及びそれらの誘導体及びア
ルキル（アルケニル）レソルシノール；及びプロラミン、例えばゼイン、アベニ
ン、ホルディン又はグリアジンを含み得る。
、洗浄及び回収に関する。本発明の一態様によれば、その方法は、じゃまな化学
処理の使用又は過剰な塩の形成もしくは回収不能な処理廃流なしに、カラムを再
生する第４の任意的ステップに関する。 本発明によれば、アルコール水溶液中の類似した溶解物を含む広範囲のエキス
の分離及び精製は、特異的に改変したポリサッカライドゲルへのそれらの示差的
結合に基づいて行うことができる。このようなエキスには、ステロイド及びトリ
テルペノイド、例えばサポニン、強心配糖体、及びステリルコンジュゲート；フ
ラボノイド、例えばフラボン、フラボノール、イソフラボン及びそれらのグリコ
シド全て；フェノール系コンジュゲート、例えば脂肪アルコール、エステル及び
アミド；極性脂質、例えばモノ−及びジ−グリセリド及びそれらの誘導体及びア
ルキル（アルケニル）レソルシノール；及びプロラミン、例えばゼイン、アベニ
ン、ホルディン又はグリアジンを含み得る。
【００３８】 化合物がゲルに結合すると考えられるか及びゲルとの疎水性相互作用を示して
いると考えられるかを確立することにおいて、以下の基準が合致しなければなら
ない： ａ）それが、カラムに充填され、カラムを洗う溶媒に可溶性であるか、又はミ
セルもしくは安定なエマルションを形成しなければならず；そして ｂ）それが洗浄溶媒の少くとも１．２５×Ｖb で洗った後にゲルに保持されな
ければならず、ここで、Ｖb はカラムの充填ベット容量であり、洗浄溶媒は前記
化合物を保持するために十分な割合で水と組み合わされた低級アルコールである
。
いると考えられるかを確立することにおいて、以下の基準が合致しなければなら
ない： ａ）それが、カラムに充填され、カラムを洗う溶媒に可溶性であるか、又はミ
セルもしくは安定なエマルションを形成しなければならず；そして ｂ）それが洗浄溶媒の少くとも１．２５×Ｖb で洗った後にゲルに保持されな
ければならず、ここで、Ｖb はカラムの充填ベット容量であり、洗浄溶媒は前記
化合物を保持するために十分な割合で水と組み合わされた低級アルコールである
。
【００３９】 その後者の基準は、本明細書に記述される型のポーラスゲルが分子サイズ排除
能力を示すので、合致しなければならない。しかしながら、これらの効果は約１
．２５×Ｖb を超えては観察されず、それゆえ記述される方法又は実施に関連す
る。 回収ステップにおいて、溶離水性有機溶媒中の有機溶媒の割合は、エキスのゲ
ルへの疎水性結合を減少させこれによりエキスを溶出するために増加される。本
発明の特定の実施形態においてエキスは、最初の洗浄流で溶出させることができ
る。
能力を示すので、合致しなければならない。しかしながら、これらの効果は約１
．２５×Ｖb を超えては観察されず、それゆえ記述される方法又は実施に関連す
る。 回収ステップにおいて、溶離水性有機溶媒中の有機溶媒の割合は、エキスのゲ
ルへの疎水性結合を減少させこれによりエキスを溶出するために増加される。本
発明の特定の実施形態においてエキスは、最初の洗浄流で溶出させることができ
る。
【００４０】 本発明において、重力で充填されたゲル１mLの容量を介して化合物を動かすた
めの特定の溶媒のmLの数の比率として定義する無次元定数Ｋ′の使用により特定
の化合物もしくはグループ及び／又は化合物の種の相対的な疎水性相互作用の程
度が引用されよう。この無次元定数はカラムの寸法（即ち長さ、径等）と独立し
ているので、本明細書に記載される条件は、数倍にわたってスケールアップした
作業で用いることができる。
めの特定の溶媒のmLの数の比率として定義する無次元定数Ｋ′の使用により特定
の化合物もしくはグループ及び／又は化合物の種の相対的な疎水性相互作用の程
度が引用されよう。この無次元定数はカラムの寸法（即ち長さ、径等）と独立し
ているので、本明細書に記載される条件は、数倍にわたってスケールアップした
作業で用いることができる。
【００４１】 上述の通り、本発明の任意の第４のステップは、いずれのじゃまな化学物質の
使用も過剰な塩もしくは回復不能なプロセッシング廃流の形成もない、カラムの
再生である。各々の適用のための条件は、関心の化合物がゲルから全体的に除去
されていることで確立されているので、カラムは再生し、出発溶媒で再び平衡化
することができる。驚くことに、適切な溶媒、例えば９５％エタノール又はイソ
プロパノールでのゲルの簡単な洗浄がプロセス適用の終りにゲルに接着したいず
れの材料も除去するためにほとんどの場合、十分である。次にゲルは、すぐに再
使用するために出発溶媒で再び平衡化される。この方法において、１０年にわた
って少くとも４０００回までの再生及びリサイクルが、本明細書に記載される方
法における効能を著しく失うことなく観察されている。適当と認められるクリー
ン・イン・プレイス／清掃手順は、製造元の推奨により希釈ＮａＯＨを用いて行
うことができる（Amersham Pharmacia Biotech manuals, technical bulletins,
etc）。
使用も過剰な塩もしくは回復不能なプロセッシング廃流の形成もない、カラムの
再生である。各々の適用のための条件は、関心の化合物がゲルから全体的に除去
されていることで確立されているので、カラムは再生し、出発溶媒で再び平衡化
することができる。驚くことに、適切な溶媒、例えば９５％エタノール又はイソ
プロパノールでのゲルの簡単な洗浄がプロセス適用の終りにゲルに接着したいず
れの材料も除去するためにほとんどの場合、十分である。次にゲルは、すぐに再
使用するために出発溶媒で再び平衡化される。この方法において、１０年にわた
って少くとも４０００回までの再生及びリサイクルが、本明細書に記載される方
法における効能を著しく失うことなく観察されている。適当と認められるクリー
ン・イン・プレイス／清掃手順は、製造元の推奨により希釈ＮａＯＨを用いて行
うことができる（Amersham Pharmacia Biotech manuals, technical bulletins,
etc）。
【００４２】 本発明による化合物の精製は当業者に周知であるいずれの適切な温度でも行う
ことができる。カラム分離は、約２℃〜６０℃の範囲の温度で行うことができる
。温度は、約４℃〜３０℃の範囲がより一般的に用いられる。 本発明はその好ましい実施形態を特に引用して詳細に記述されるが、その実施
形態は詳述のためであり、本発明を限定するためではない。
ことができる。カラム分離は、約２℃〜６０℃の範囲の温度で行うことができる
。温度は、約４℃〜３０℃の範囲がより一般的に用いられる。 本発明はその好ましい実施形態を特に引用して詳細に記述されるが、その実施
形態は詳述のためであり、本発明を限定するためではない。
【００４３】 実施例 実施例１：Octyl Sepharose CL-4B TM及び新規置換化疎水性ゲルでの疎水性相
互作用クロマトグラフィーを用いるオートフラワーからのオートサポニンの単離 ２つの異なる型のオートサポニンがオートの仁から単離されており：それらは
アベナコシド型五環トリテルペノイドサポニン及びアベナシン型ステロイドサポ
ニンである。２つのアベナコシド、アベナコシドＡ及びアベナコシドＢの構造は
解明されているが（Tscheshe, R ら、Chem.Ber., 102, 2072-2082, 1969; Tsche
sche R. 及びLauven, P., Chem.Ber., 104, 3549-3555, 1971 ）、少くとも２の
他のアベナコシドはキャラクタライズされていないままである（Kesselmeier. J
. 及びStrack, D.Z.Natuforsch. 36C, 1072-1074, 1981）。いくつかのアベナシ
ン型サポニンも構造的に同定されている（Crombie. L. ら、J.Chem, Soc.Perk.T
rans. 1, 1917-1922, 1986）。
互作用クロマトグラフィーを用いるオートフラワーからのオートサポニンの単離 ２つの異なる型のオートサポニンがオートの仁から単離されており：それらは
アベナコシド型五環トリテルペノイドサポニン及びアベナシン型ステロイドサポ
ニンである。２つのアベナコシド、アベナコシドＡ及びアベナコシドＢの構造は
解明されているが（Tscheshe, R ら、Chem.Ber., 102, 2072-2082, 1969; Tsche
sche R. 及びLauven, P., Chem.Ber., 104, 3549-3555, 1971 ）、少くとも２の
他のアベナコシドはキャラクタライズされていないままである（Kesselmeier. J
. 及びStrack, D.Z.Natuforsch. 36C, 1072-1074, 1981）。いくつかのアベナシ
ン型サポニンも構造的に同定されている（Crombie. L. ら、J.Chem, Soc.Perk.T
rans. 1, 1917-1922, 1986）。
【００４４】 アベナコシドＡ及びＢの場合、ステロイド成分は各々全部で５及び４の糖残基
でグリコシル化され、４のアベナシンは４の類似するが同一でないサポゲノール
の同じトリサッカライド誘導体である。中性サポニンのこのような複合混合物の
同時発生は、類似する組成の糖及びオリゴサッカライドを含む抽出液からのグル
ープ又は個々の成分としての分離を困難にする。以下の例に、おいて、更なる使
用は、最初にサポニンのグループ分離を行い、第２に、各々のサポニンの型の特
定の成分の精製を容易にするために疎水性相互作用クロマトグラフィーを行った
。
でグリコシル化され、４のアベナシンは４の類似するが同一でないサポゲノール
の同じトリサッカライド誘導体である。中性サポニンのこのような複合混合物の
同時発生は、類似する組成の糖及びオリゴサッカライドを含む抽出液からのグル
ープ又は個々の成分としての分離を困難にする。以下の例に、おいて、更なる使
用は、最初にサポニンのグループ分離を行い、第２に、各々のサポニンの型の特
定の成分の精製を容易にするために疎水性相互作用クロマトグラフィーを行った
。
【００４５】 最初に、５０％エタノール水溶液におけるOctyl Sepharose CL-4B TMでのＨＩ
Ｃを、極性及び無極性非サポニン成分から、とりわけ、両方の型の全てのオート
サポニンのグループ分離を行うために利用した。次に全てのオートサポニンを、
以下に記載のように、水素型におけるSP Sephadex C-25TMでのカチオン交換クロ
マトグラフィー及びアセテート及びヒドロキシル型におけるQAE Sephadex A-25 TM での二重アニオン交換クロマトグラフィーにより、このサポニン含有画分から
荷電成分を除去することによりグループとして更に精製した。オートサポニンは
変化しないので、それらはこれらのステップのいずれによっても吸着されないで
あろうし、他の中性成分と共に全部で３つの型のカラムを通過するであろう。最
後に、ヘキサデシルトリメチルアンモニウム（ＨＤＴＭＡ+ ）型におけるOctyl
Sepharose CL-4B TM及びSP Sephadex C-25TMの両方でのＨＩＣを、アベナコシド
サポニンからアベナシンサポニンを分離するため及びこれらの２つの基の個々の
メンバーを精製するために用いた。以下に記載のサポニン精製過程の間、他の成
分が極めて豊富であるいくつかの非サポニン画分も形成されたことが強調される
べきである。本明細書に記載される方法は、唯一の溶媒としてエタノール及び水
に、唯一の試薬として揮発酸及び塩基に関するので、これらの画分は更なる価値
のため優れたソースである。
Ｃを、極性及び無極性非サポニン成分から、とりわけ、両方の型の全てのオート
サポニンのグループ分離を行うために利用した。次に全てのオートサポニンを、
以下に記載のように、水素型におけるSP Sephadex C-25TMでのカチオン交換クロ
マトグラフィー及びアセテート及びヒドロキシル型におけるQAE Sephadex A-25 TM での二重アニオン交換クロマトグラフィーにより、このサポニン含有画分から
荷電成分を除去することによりグループとして更に精製した。オートサポニンは
変化しないので、それらはこれらのステップのいずれによっても吸着されないで
あろうし、他の中性成分と共に全部で３つの型のカラムを通過するであろう。最
後に、ヘキサデシルトリメチルアンモニウム（ＨＤＴＭＡ+ ）型におけるOctyl
Sepharose CL-4B TM及びSP Sephadex C-25TMの両方でのＨＩＣを、アベナコシド
サポニンからアベナシンサポニンを分離するため及びこれらの２つの基の個々の
メンバーを精製するために用いた。以下に記載のサポニン精製過程の間、他の成
分が極めて豊富であるいくつかの非サポニン画分も形成されたことが強調される
べきである。本明細書に記載される方法は、唯一の溶媒としてエタノール及び水
に、唯一の試薬として揮発酸及び塩基に関するので、これらの画分は更なる価値
のため優れたソースである。
【００４６】 これにより、アベナ・サチバ（Avena sativa）L.cult.Tiborのサンプルを粉砕
して１mmスクリーンに通し、２５ｇの生じたオートフラワーを、激しく撹拌しな
がら、１２５mL（固体／液体＝１／５）還流酸性化８０％エタノール水溶液（エ
タノール：水：氷酢酸 ８０：１９：１ ｖ：ｖ：ｖ）に加えた。その混合物を
還流下で連続的に撹拌しながら更に２０分、加熱した。約４℃に冷却した後、再
懸濁した混合物を、粗い孔のフリットディスクを備えた容量測定の目盛りがある
ガラスカラムに移し、室温（２５℃）まであたため、静置して周知の容量の充填
ベッド（Ｖb ）を供した。次にカラムを排水して２×Ｖb の新しい酸性化８０％
エタノール水溶液で洗い、そしてこのペルコレーション型抽出過程を２回、くり
返した。排水した後、抽出した固体残留物をペルコレーション抽出カラムから除
去し、一定重量まで空気乾燥して抽出したオートフラワーの割合を決定した。抽
出物及び洗浄物を組み合わせて、４０℃でロータリーエバポレーションにより油
状のシロップに真空下で濃縮し、それは、もとのオートグロートの１６重量％を
示した。次にその油状シロップを８０％エタノール水溶液中に分散させ、８０％
エタノール水溶液中Octyl Sepharose CL-4B TMビーズ５mLを加え、その混合物を
４０℃でロータリーエバポレーションにより真空下で厚いスラリーまでエバポレ
ートした。次にそのスラリーを５０％エタノール水溶液に再び懸濁し、水性５０
％エタノール溶媒で予め平衡化して重力で充填した４５mL Octyl Sepharose CL-
4BTMの目盛りつきカラムに移した。次にそのカラム（最終Ｖb ５０mL）を３×Ｖ b の同じ溶媒で洗って、とりわけ、全てのオートサポニン、糖、アミノ酸、及び
塩を含むＫ′≦３の洗浄画分及びまだゲルに疎水結合しているＫ′≧３画分を供
した。とりわけ、カロテノイド色素、アシルグリセリド、極性脂質、オートプロ
ラミンのいくつか及び遊離ステロールを含むこのＫ′≧３画分を回収し、そして
そのゲルを、最初に２×Ｖb の９５％エタノール水溶液をカラムに通して結合し
た材料を回収し、そして次に２×Ｖb の再平衡化溶媒を通すことによりリサイク
ルした。
して１mmスクリーンに通し、２５ｇの生じたオートフラワーを、激しく撹拌しな
がら、１２５mL（固体／液体＝１／５）還流酸性化８０％エタノール水溶液（エ
タノール：水：氷酢酸 ８０：１９：１ ｖ：ｖ：ｖ）に加えた。その混合物を
還流下で連続的に撹拌しながら更に２０分、加熱した。約４℃に冷却した後、再
懸濁した混合物を、粗い孔のフリットディスクを備えた容量測定の目盛りがある
ガラスカラムに移し、室温（２５℃）まであたため、静置して周知の容量の充填
ベッド（Ｖb ）を供した。次にカラムを排水して２×Ｖb の新しい酸性化８０％
エタノール水溶液で洗い、そしてこのペルコレーション型抽出過程を２回、くり
返した。排水した後、抽出した固体残留物をペルコレーション抽出カラムから除
去し、一定重量まで空気乾燥して抽出したオートフラワーの割合を決定した。抽
出物及び洗浄物を組み合わせて、４０℃でロータリーエバポレーションにより油
状のシロップに真空下で濃縮し、それは、もとのオートグロートの１６重量％を
示した。次にその油状シロップを８０％エタノール水溶液中に分散させ、８０％
エタノール水溶液中Octyl Sepharose CL-4B TMビーズ５mLを加え、その混合物を
４０℃でロータリーエバポレーションにより真空下で厚いスラリーまでエバポレ
ートした。次にそのスラリーを５０％エタノール水溶液に再び懸濁し、水性５０
％エタノール溶媒で予め平衡化して重力で充填した４５mL Octyl Sepharose CL-
4BTMの目盛りつきカラムに移した。次にそのカラム（最終Ｖb ５０mL）を３×Ｖ b の同じ溶媒で洗って、とりわけ、全てのオートサポニン、糖、アミノ酸、及び
塩を含むＫ′≦３の洗浄画分及びまだゲルに疎水結合しているＫ′≧３画分を供
した。とりわけ、カロテノイド色素、アシルグリセリド、極性脂質、オートプロ
ラミンのいくつか及び遊離ステロールを含むこのＫ′≧３画分を回収し、そして
そのゲルを、最初に２×Ｖb の９５％エタノール水溶液をカラムに通して結合し
た材料を回収し、そして次に２×Ｖb の再平衡化溶媒を通すことによりリサイク
ルした。
【００４７】 これにより、先に調製されたＫ′≦３画分を、最初に、水素型におけるSP Sep
hadex C-25TMでのクロマトグラフィーにより、カチオン性プロラミン、ペプチド
、アミノ酸及び無機カチオンのような成分を除去するよう処理した。従って、（
製造元から得られる）ナトリウム型におけるSP Sephadex C-25TMの５０mL（＝Ｖ b ；即ち２mL／gm抽出オートグロート）を含む容量測定の目盛りがついたカラム
を５０％エタノール水溶液で膨潤させて、カラムを５０％エタノール水溶液中０
．１Ｎ ＨＣｌの３倍ミリ等量過剰量でカラムを処理しそしてそのカラムを、洗
浄液がpH約６になるまで洗うことにより水素型に変換した。先に調製し、５mLの
５０％エタノール水溶液に溶かしたＫ′≦３画分を次にそのカラムに流し、その
カラムを３×Ｖb の新しい５０％エタノール水溶液で洗った。とりわけ、オート
サポニンを含む洗浄液（即ちＫ′≦３画分）を４０℃でロータリーエバポレーシ
ョンにより真空下で乾燥するまでエバポレートした。次にこのＫ′≦３画分を、
それら全てがpH６又はそれ未満の生味の負電荷を有する、アニオン性プロラミン
・ペプチド及びアミノ酸のような成分を除去するよう処理した。従って（製造元
から得られる）塩化物型の５０mL（＝Ｖb ；即ち２mLゲル／gm抽出オートグロー
ト）QAE Sephadex A-25 TMアニオン交換カラムを５０％エタノール水溶液で膨潤
させ、最初に、そのカラムを５０％エタノール水溶液中１．０ＮのＮａＯＨの３
倍ミリ過剰量で処理し、そしてそのカラムを洗浄液がpH約８になるまで洗うこと
によりヒドロキシル型に変換した。次にそのカラムを３倍ミリ等量過剰の５０％
エタノール水溶液中１％（ｖ：ｖ）氷酢酸で処理し、そしてそのカラムを洗浄液
がpH約６になるまで５０％エタノール水溶液で洗うことによりアセテート型に変
換した。次に、５mLの５０％エタノール水溶液中のサポニン含有画分をカラムに
充填し、そのカラムを３×Ｖb の新しい５０％エタノール水溶液で洗った。とり
わけオートサポニンを含む洗浄液（即ちＫ′≦３画分）を４０℃でのロータリー
エバポレーションにより真空下で乾燥するまでエバポレートした。最後に、pH約
８で生味の負電荷を有するフラボノイド、フェノール類及び他の非サポニンを除
去するため、サポニン画分を上述の通り調製したヒドロキシル型の５０mL（Ｖb ；即ち２mLゲル／gm抽出オートグロート）QAE Sephadex A-25 TMカラムアニオン
交換カラムに流した。次に５mLの５０％エタノール水溶液中のサポニン含有画分
をカラムに充填し、そのカラムを３×Ｖb の新しい５０％エタノール水溶液で洗
った。主にオートサポニン、ガラクトグリセリド、中性アミノ酸及び糖を含む洗
浄液（即ちＫ′≦３画分）を、４０℃でロータリーエバポレーションにより真空
下で濃縮した。予備的分画スキームを図１に示す。
hadex C-25TMでのクロマトグラフィーにより、カチオン性プロラミン、ペプチド
、アミノ酸及び無機カチオンのような成分を除去するよう処理した。従って、（
製造元から得られる）ナトリウム型におけるSP Sephadex C-25TMの５０mL（＝Ｖ b ；即ち２mL／gm抽出オートグロート）を含む容量測定の目盛りがついたカラム
を５０％エタノール水溶液で膨潤させて、カラムを５０％エタノール水溶液中０
．１Ｎ ＨＣｌの３倍ミリ等量過剰量でカラムを処理しそしてそのカラムを、洗
浄液がpH約６になるまで洗うことにより水素型に変換した。先に調製し、５mLの
５０％エタノール水溶液に溶かしたＫ′≦３画分を次にそのカラムに流し、その
カラムを３×Ｖb の新しい５０％エタノール水溶液で洗った。とりわけ、オート
サポニンを含む洗浄液（即ちＫ′≦３画分）を４０℃でロータリーエバポレーシ
ョンにより真空下で乾燥するまでエバポレートした。次にこのＫ′≦３画分を、
それら全てがpH６又はそれ未満の生味の負電荷を有する、アニオン性プロラミン
・ペプチド及びアミノ酸のような成分を除去するよう処理した。従って（製造元
から得られる）塩化物型の５０mL（＝Ｖb ；即ち２mLゲル／gm抽出オートグロー
ト）QAE Sephadex A-25 TMアニオン交換カラムを５０％エタノール水溶液で膨潤
させ、最初に、そのカラムを５０％エタノール水溶液中１．０ＮのＮａＯＨの３
倍ミリ過剰量で処理し、そしてそのカラムを洗浄液がpH約８になるまで洗うこと
によりヒドロキシル型に変換した。次にそのカラムを３倍ミリ等量過剰の５０％
エタノール水溶液中１％（ｖ：ｖ）氷酢酸で処理し、そしてそのカラムを洗浄液
がpH約６になるまで５０％エタノール水溶液で洗うことによりアセテート型に変
換した。次に、５mLの５０％エタノール水溶液中のサポニン含有画分をカラムに
充填し、そのカラムを３×Ｖb の新しい５０％エタノール水溶液で洗った。とり
わけオートサポニンを含む洗浄液（即ちＫ′≦３画分）を４０℃でのロータリー
エバポレーションにより真空下で乾燥するまでエバポレートした。最後に、pH約
８で生味の負電荷を有するフラボノイド、フェノール類及び他の非サポニンを除
去するため、サポニン画分を上述の通り調製したヒドロキシル型の５０mL（Ｖb ；即ち２mLゲル／gm抽出オートグロート）QAE Sephadex A-25 TMカラムアニオン
交換カラムに流した。次に５mLの５０％エタノール水溶液中のサポニン含有画分
をカラムに充填し、そのカラムを３×Ｖb の新しい５０％エタノール水溶液で洗
った。主にオートサポニン、ガラクトグリセリド、中性アミノ酸及び糖を含む洗
浄液（即ちＫ′≦３画分）を、４０℃でロータリーエバポレーションにより真空
下で濃縮した。予備的分画スキームを図１に示す。
【００４８】 以下に記載のＫ′≦３画分の予備的ＴＬＣ検査は、茶色（遊離糖）、緑色（ア
ベナコシド型サポゲニン）、灰色がかった青色（アベナシン型サポニン）、紫色
（ガラクトシルグリセリド）及び黄色（リゾホスファチド）を含む試薬を検出す
るｐ−アニスアルデヒドでいくつかの異なる色のスポットの存在を示した。 ヘキデシルトリメチルアンモニウム（ＨＤＴＭＡ+ ）型のOctyl Sepharose CL
-4B TM及びSP Sephadex C-25TMでの疎水性相互作用クロマトグラフィーも、非サ
ポニン成分を分離するため、アベナコシドサポニンからアベナシンサポニンを分
離するため及び以下の一連のプロトコルを用いて各々の他のものからこれら２つ
のグループの個々のメンバーを単離するために用いた。最初に、非サポニン及び
少量のサポゲニンモノ−及びジ−グリセリドをOctyl Sepharose CL-4B TMでアベ
ナシン及びアベナコシドから分離した。次に個々のアベナシンを更にOctyl Seph
arose CL-4B TMでの更なるクロマトグラフィーにより、そして個々のより極性の
アベナコシドのメンバーを、ＨＤＴＭＡ+ 型のSP Sephadex C-25TMにより分離し
た。しかしながら、オートサポニン混合物の個々の成分を単離及び同定するため
、更なるオートサンプル（１００ｇ）を、同じカラム型、溶媒及び割合を用いて
上述の手順をスケール・アップすることにより処理した。この方法において、更
に約３００mgの凍結乾燥したサポニンを１回で生産した。
ベナコシド型サポゲニン）、灰色がかった青色（アベナシン型サポニン）、紫色
（ガラクトシルグリセリド）及び黄色（リゾホスファチド）を含む試薬を検出す
るｐ−アニスアルデヒドでいくつかの異なる色のスポットの存在を示した。 ヘキデシルトリメチルアンモニウム（ＨＤＴＭＡ+ ）型のOctyl Sepharose CL
-4B TM及びSP Sephadex C-25TMでの疎水性相互作用クロマトグラフィーも、非サ
ポニン成分を分離するため、アベナコシドサポニンからアベナシンサポニンを分
離するため及び以下の一連のプロトコルを用いて各々の他のものからこれら２つ
のグループの個々のメンバーを単離するために用いた。最初に、非サポニン及び
少量のサポゲニンモノ−及びジ−グリセリドをOctyl Sepharose CL-4B TMでアベ
ナシン及びアベナコシドから分離した。次に個々のアベナシンを更にOctyl Seph
arose CL-4B TMでの更なるクロマトグラフィーにより、そして個々のより極性の
アベナコシドのメンバーを、ＨＤＴＭＡ+ 型のSP Sephadex C-25TMにより分離し
た。しかしながら、オートサポニン混合物の個々の成分を単離及び同定するため
、更なるオートサンプル（１００ｇ）を、同じカラム型、溶媒及び割合を用いて
上述の手順をスケール・アップすることにより処理した。この方法において、更
に約３００mgの凍結乾燥したサポニンを１回で生産した。
【００４９】 これにより、凍結乾燥したサポニンのアリコート（２６６．５mg）を１０mLの
酸性化４０％エタノール水溶液（即ちエタノール：水：氷酢酸 ４０：５９．９
：０．１ ｖ：ｖ：ｖ）に溶かした。その溶液を、同溶媒で平衡化し、重力で充
填したOctyl Sepharose CL-4B TMの１００mLカラム（＝Ｖb ；２．６６mgサポニ
ン／mLゲル）に吸着させた。そのカラムを２×Ｖb の新しい酸性化４０％エタノ
ール水溶液で洗ってＫ′≦２サブ画分を供し、それを４０℃でロータリーエバポ
レーションにより真空下で乾燥するまでエバポレートした。次にそのカラムを２
×Ｖb の８０％エタノール水溶液で溶出して吸着した成分を回収し、このサブ画
分（即ちＫ′≧２サブ画分）を、同様に、４０℃でロータリーエバポレーション
により真空下で乾燥するまでエバポレートした。Ｋ′≦２サブ画分のＴＬＣ検査
は、Ｎ−メチルアントラニロイル成分を含むアベナシンに典型的な長い波長のＵ
Ｖ（３６５nm）下でいくつかの青い蛍光スポットを示し、ｐ−アニスアルデヒド
試薬を噴霧した時にアベナコシドに典型的な少くとも４の緑色のスポットを示し
、そしてとりわけ糖及び中性アミノ酸に対応する高いＲｆの大きなゾーンを示し
た。ＴＬＣ検査によるＫ′≧２サブ画分は、Ｎ−メチルアントラニロイル含有ア
ベナミンサポゲノールのアグリコンに典型的な長い波長のＵＶ（３６５nm）下で
原点に青色蛍光のスポットを含み、上述の通りｐ−アニスアルデヒド試薬を噴霧
した時に特定のクラスの脂質の特徴である紫色及び黄色がかったスポットの両方
を含んだ。これにより、この最初のステップは、非サポニン（即ちＫ′≧２サブ
画分）からＫ′≦２サブ画分で回収されるアベナシン型サポニン及びアベナコシ
ド型サポニンの両方の分離を行った。
酸性化４０％エタノール水溶液（即ちエタノール：水：氷酢酸 ４０：５９．９
：０．１ ｖ：ｖ：ｖ）に溶かした。その溶液を、同溶媒で平衡化し、重力で充
填したOctyl Sepharose CL-4B TMの１００mLカラム（＝Ｖb ；２．６６mgサポニ
ン／mLゲル）に吸着させた。そのカラムを２×Ｖb の新しい酸性化４０％エタノ
ール水溶液で洗ってＫ′≦２サブ画分を供し、それを４０℃でロータリーエバポ
レーションにより真空下で乾燥するまでエバポレートした。次にそのカラムを２
×Ｖb の８０％エタノール水溶液で溶出して吸着した成分を回収し、このサブ画
分（即ちＫ′≧２サブ画分）を、同様に、４０℃でロータリーエバポレーション
により真空下で乾燥するまでエバポレートした。Ｋ′≦２サブ画分のＴＬＣ検査
は、Ｎ−メチルアントラニロイル成分を含むアベナシンに典型的な長い波長のＵ
Ｖ（３６５nm）下でいくつかの青い蛍光スポットを示し、ｐ−アニスアルデヒド
試薬を噴霧した時にアベナコシドに典型的な少くとも４の緑色のスポットを示し
、そしてとりわけ糖及び中性アミノ酸に対応する高いＲｆの大きなゾーンを示し
た。ＴＬＣ検査によるＫ′≧２サブ画分は、Ｎ−メチルアントラニロイル含有ア
ベナミンサポゲノールのアグリコンに典型的な長い波長のＵＶ（３６５nm）下で
原点に青色蛍光のスポットを含み、上述の通りｐ−アニスアルデヒド試薬を噴霧
した時に特定のクラスの脂質の特徴である紫色及び黄色がかったスポットの両方
を含んだ。これにより、この最初のステップは、非サポニン（即ちＫ′≧２サブ
画分）からＫ′≦２サブ画分で回収されるアベナシン型サポニン及びアベナコシ
ド型サポニンの両方の分離を行った。
【００５０】 次のステップは、アベナコシドに対するアベナシンのグリコシル化の低い割合
、即ちそれらのより大きな疎水結合能力を利用することによる、アベナコシド型
サポニン及び他の残りの非サポニン成分からのアベナシン型サポニンの分離に関
する。従って、Ｋ′≦２サブ画分を１０mLの酸性化２０％エタノール水溶液（即
ちエタノール：水：氷酢酸 ２０：７９．９：０．１ ｖ：ｖ：ｖ）に溶かし、
同溶媒で平衡化して重力充填したOctyl Sepharose CL-4B TMの１００mLカラム（
＝Ｖb ）に吸着させた。そのカラムを２×Ｖb の新しい酸性化２０％エタノール
水溶液で洗い、Ｋ′≦２サブ画分を供して、それを４０℃でロータリーエバポレ
ーションにより真空下で乾燥するまでエバポレートした。次にカラムになお吸着
している成分を２×Ｖb の８０％エタノール水溶液を用いて回収し、そしてこの
サブ画分（即ちＫ′≧２サブ画分）を同様に、４０℃でロータリーエバポレーシ
ョンにより真空下で乾燥するまでエバポレーションした。２つのサブ画分のＴＬ
Ｃ検査は、Ｋ′≦２サブ画分がとりわけ遊離糖及び中性アミノ酸と共にアベナコ
シドを含むが検出可能なアベナシンを含まず、一方Ｋ′≧２サブ画分が微量の低
Ｒｆアベナコシドと共にアベナシン（即ち“アベナシンサブ画分”）を含むこと
を示した。
、即ちそれらのより大きな疎水結合能力を利用することによる、アベナコシド型
サポニン及び他の残りの非サポニン成分からのアベナシン型サポニンの分離に関
する。従って、Ｋ′≦２サブ画分を１０mLの酸性化２０％エタノール水溶液（即
ちエタノール：水：氷酢酸 ２０：７９．９：０．１ ｖ：ｖ：ｖ）に溶かし、
同溶媒で平衡化して重力充填したOctyl Sepharose CL-4B TMの１００mLカラム（
＝Ｖb ）に吸着させた。そのカラムを２×Ｖb の新しい酸性化２０％エタノール
水溶液で洗い、Ｋ′≦２サブ画分を供して、それを４０℃でロータリーエバポレ
ーションにより真空下で乾燥するまでエバポレートした。次にカラムになお吸着
している成分を２×Ｖb の８０％エタノール水溶液を用いて回収し、そしてこの
サブ画分（即ちＫ′≧２サブ画分）を同様に、４０℃でロータリーエバポレーシ
ョンにより真空下で乾燥するまでエバポレーションした。２つのサブ画分のＴＬ
Ｃ検査は、Ｋ′≦２サブ画分がとりわけ遊離糖及び中性アミノ酸と共にアベナコ
シドを含むが検出可能なアベナシンを含まず、一方Ｋ′≧２サブ画分が微量の低
Ｒｆアベナコシドと共にアベナシン（即ち“アベナシンサブ画分”）を含むこと
を示した。
【００５１】 最後に、そのアベナコシドから中性アミノ酸及び糖を除去するために、Ｋ′≦
２サブ画分を上述の通り調製したヘキサデシルトリメチルアンモニウム（ＨＤＴ
ＭＡ+ ）型の重力充填した２５mL（＝Ｖb ；即ち１mLゲル／gm抽出オートグロー
ト）SP Sephadex C-25TMでクロマトグラフィーを行った。これにより、５mLの２
５％エタノール水溶液中Ｋ′≦３画分をそのカラムに吸着させ、３×Ｖb の新し
い２５％エタノール水溶液で洗ってサポニンのないＫ′≦３サブ画分を供した（
ＴＬＣ）。次にカラムに吸着したサポニンを３×Ｖb の８０％エタノール水溶液
で回収し、４０℃でロータリーエバポレーションにより真空下で乾燥するまでエ
パボレートし、そしてオフホワイトの粉末になるまで凍結乾燥させた（即ち“ア
ベノコシドサブ画分”；収率：７７．５mg；０．３１％乾燥ベース）。２つの主
なオートサポニン型の分離及び回収のための流れ図を図２に示す。
２サブ画分を上述の通り調製したヘキサデシルトリメチルアンモニウム（ＨＤＴ
ＭＡ+ ）型の重力充填した２５mL（＝Ｖb ；即ち１mLゲル／gm抽出オートグロー
ト）SP Sephadex C-25TMでクロマトグラフィーを行った。これにより、５mLの２
５％エタノール水溶液中Ｋ′≦３画分をそのカラムに吸着させ、３×Ｖb の新し
い２５％エタノール水溶液で洗ってサポニンのないＫ′≦３サブ画分を供した（
ＴＬＣ）。次にカラムに吸着したサポニンを３×Ｖb の８０％エタノール水溶液
で回収し、４０℃でロータリーエバポレーションにより真空下で乾燥するまでエ
パボレートし、そしてオフホワイトの粉末になるまで凍結乾燥させた（即ち“ア
ベノコシドサブ画分”；収率：７７．５mg；０．３１％乾燥ベース）。２つの主
なオートサポニン型の分離及び回収のための流れ図を図２に示す。
【００５２】 薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ） サポニンのＴＬＣを、溶媒システムメタノール：５％酢酸水溶液（７５：２５
ｖ：ｖ）（即ちメタノール：水：氷酢酸７５：２３．５：１．５ ｖ：ｖ：ｖ
）を用いて、ＭＫＣ18Ｆ逆相プレート（１×３in、２００μｍ厚、Whatman Inte
rnational Ltd, Maidstone, UK）で行った。酸性化エタノール水溶液（即ちエタ
ノール：濃硫酸：水：ｐ−アニスアルデヒド ９０：５：４．５：０．５ ｖ：
ｖ：ｖ：ｖ）中のｐ−アニスアルデヒドの０．５％溶液（ｖ：ｖ）を噴霧し、そ
して３分間、１００℃に加熱することにより化合物を可視化した。この試薬は、
茶色（遊離糖）、一時的に黄色で迅速にピンク、グリーン又は灰色がかった青色
（サポニン）、ゆっくり出現する赤みがかった色（アミノ酸、プロラミン）、紫
（ガラクトシルグリセリド）、及び黄色（リゾホスファチド）を含む異なる構成
物でいくつかの明確な色を供する。
ｖ：ｖ）（即ちメタノール：水：氷酢酸７５：２３．５：１．５ ｖ：ｖ：ｖ
）を用いて、ＭＫＣ18Ｆ逆相プレート（１×３in、２００μｍ厚、Whatman Inte
rnational Ltd, Maidstone, UK）で行った。酸性化エタノール水溶液（即ちエタ
ノール：濃硫酸：水：ｐ−アニスアルデヒド ９０：５：４．５：０．５ ｖ：
ｖ：ｖ：ｖ）中のｐ−アニスアルデヒドの０．５％溶液（ｖ：ｖ）を噴霧し、そ
して３分間、１００℃に加熱することにより化合物を可視化した。この試薬は、
茶色（遊離糖）、一時的に黄色で迅速にピンク、グリーン又は灰色がかった青色
（サポニン）、ゆっくり出現する赤みがかった色（アミノ酸、プロラミン）、紫
（ガラクトシルグリセリド）、及び黄色（リゾホスファチド）を含む異なる構成
物でいくつかの明確な色を供する。
【００５３】 高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ） サポニンのＨＰＬＣ分析を、C18 CSC Hypersilカラム（２５０×４．６mm、１
２０Å、５μｍ）でThermo Separations Products solvent デリバリーシステム
及びデータ収集ソフトウェア（ＰＣ １０００）を用いて行った。１２０℃に設
定したドリフトチューブ温度での“マスディテクター”（蒸発光散乱ディテクタ
ー、ELSD, Alltech Varex MK II ）及び３．０６ＳＬＰＭでのガスフローを、注
入サンプル中に存在する全ての化合物を検出するために用いた。その溶媒システ
ムは以下の通りアセトニトリル、水及び５％酢酸水溶液からなっていた。
２０Å、５μｍ）でThermo Separations Products solvent デリバリーシステム
及びデータ収集ソフトウェア（ＰＣ １０００）を用いて行った。１２０℃に設
定したドリフトチューブ温度での“マスディテクター”（蒸発光散乱ディテクタ
ー、ELSD, Alltech Varex MK II ）及び３．０６ＳＬＰＭでのガスフローを、注
入サンプル中に存在する全ての化合物を検出するために用いた。その溶媒システ
ムは以下の通りアセトニトリル、水及び５％酢酸水溶液からなっていた。
【００５４】 時間 アセトニトリル 水 ０ ２０ ８０ ２５ ４０ ６０ ３０ １００ ０ ３５ １００ ０ ４０ ２０ ８０ 流速は１．０mL／分であった。
【００５５】 質量分析（ＭＳ） 純粋な化合物のタンデム液体クロマトグラフィー−マススペクトロメトリー（
ＨＰＬＣ−ＭＳ）を、カラムなしでフローインジェクション（ＦＩＡ）を用いて
行った。その移動相はメタノール：水（７０：３０ ｖ：ｖ）からなり、その流
速は１００μＬ／分であった。溶媒をHewlett Packard 1100バイナリーポンプを
用いて送り出した。質量分析は、エレクトロスプレー陽性モードで作動するアッ
プグレード化ヘキサポールソースでMicromass Quattro Spectrometerを用いて行
った。スキャンは、１００又は２００ボルトのコーンボルテージで２００〜１５
００ｍ／ｚユニットの範囲で行った。
ＨＰＬＣ−ＭＳ）を、カラムなしでフローインジェクション（ＦＩＡ）を用いて
行った。その移動相はメタノール：水（７０：３０ ｖ：ｖ）からなり、その流
速は１００μＬ／分であった。溶媒をHewlett Packard 1100バイナリーポンプを
用いて送り出した。質量分析は、エレクトロスプレー陽性モードで作動するアッ
プグレード化ヘキサポールソースでMicromass Quattro Spectrometerを用いて行
った。スキャンは、１００又は２００ボルトのコーンボルテージで２００〜１５
００ｍ／ｚユニットの範囲で行った。
【００５６】 上述の通り調製した“アベナシンサブ画分”をＨＰＬＣ−ＥＬＳＤ分析にかけ
、典型的なＨＰＬＣプロフィールを図３ａに示す。このサブ画分はCrombie ら（
Crombie, L. ら、J.Chem.Soc., Perk. Trans, 1, 1917 〜1922, 1986）に相当す
る。他方、“アベナコシドサブ画分”ＨＰＬＣ−ＥＬＳＤプロフィール（図３ｂ
）は、２つの主なピーク（ピーク３及び４）を含む５のピークを含んだ。これら
の中で、ピーク３及び４はKesselmeier 及びStrack（Kesselmeier, J. 及びStra
ck, D., Z. Naturforsch. 36C, 1072-1074, 1981）により報告されるような、ア
ベナコシドＢ及びＡについて各々報告されるものと同様の保持時間を有した。
、典型的なＨＰＬＣプロフィールを図３ａに示す。このサブ画分はCrombie ら（
Crombie, L. ら、J.Chem.Soc., Perk. Trans, 1, 1917 〜1922, 1986）に相当す
る。他方、“アベナコシドサブ画分”ＨＰＬＣ−ＥＬＳＤプロフィール（図３ｂ
）は、２つの主なピーク（ピーク３及び４）を含む５のピークを含んだ。これら
の中で、ピーク３及び４はKesselmeier 及びStrack（Kesselmeier, J. 及びStra
ck, D., Z. Naturforsch. 36C, 1072-1074, 1981）により報告されるような、ア
ベナコシドＢ及びＡについて各々報告されるものと同様の保持時間を有した。
【００５７】 アベナシン型サポニン（即ちアベナシンＡ−１，Ａ−２等）及びアベナコシド
型サポニン（即ちアベナコシドＡ，Ｂ，Ｃ等）の両方の個々の成分が、両方のゲ
ル型の及び洗浄溶媒組成の賢明な選択により疎水性相互作用クロマトグラフィー
によっても分離することができることが見い出された。これにより、アベナコシ
ドより相対的に無極性であるアベナシン型サポニンを分画して、２５％及び３０
％エタノール水溶液でアイソクラティック洗浄を用いてOctyl Sepharose CL-4B TM で精製した。アベナシンより多い糖残基を含むアベナコシドを分画し、ＨＤＴ
ＭＡ+ 型のSP Sephadex C-25TMで精製した。なぜならこれらのアベナコシドは溶
媒として水を用いた場合でさえ、Octyl Sepharose CL-4B TMに完全に保持されな
かったからである。
型サポニン（即ちアベナコシドＡ，Ｂ，Ｃ等）の両方の個々の成分が、両方のゲ
ル型の及び洗浄溶媒組成の賢明な選択により疎水性相互作用クロマトグラフィー
によっても分離することができることが見い出された。これにより、アベナコシ
ドより相対的に無極性であるアベナシン型サポニンを分画して、２５％及び３０
％エタノール水溶液でアイソクラティック洗浄を用いてOctyl Sepharose CL-4B TM で精製した。アベナシンより多い糖残基を含むアベナコシドを分画し、ＨＤＴ
ＭＡ+ 型のSP Sephadex C-25TMで精製した。なぜならこれらのアベナコシドは溶
媒として水を用いた場合でさえ、Octyl Sepharose CL-4B TMに完全に保持されな
かったからである。
【００５８】 例えば、上述の通り調製した“アベナシンサブ画分”を１０mLの３０％エタノ
ール水溶液にとり、同溶媒で重力充填し、平衡化したOctyl Sepharose CL-4B TM の３０mL（＝Ｖb ）の目盛りのついたカラムに吸着させた。次にそのカラムを同
じ溶媒で洗い、次のＫ′値に対応する画分を収集し、ＴＬＣ及びＨＰＬＣにより
アベナシンについて分析した。２．５〜５．５のＫ′の画分は少量のアベナシン
及び微量のアベナコシド様化合物と共にＨＰＬＣプロフィールにおいて観察され
た全ての主なアベナシンを含んだ（ピーク３、図３ａ）。同じカラムであるが、
２５％エタノール水溶液を用いるこの画分の更なるクロマトグラフィーは、ＵＶ
分光光度分析（３６５nmでのダイオードアレイ検出）及びＨＰＬＣ−ＥＬＳＤ分
析により測定して８０％超の純度で６〜８のＫ′の画分に主要アベナシンピーク
を作り出した。この単離されたピークのマススペクトル分析は、そのアベナシン
Ａ−１としての同一性を確認した。図４ａは、ＨＩＣカラムから得られた画分の
ＨＰＬＣ−ＥＬＳＤプロフィールを示し、図４ｂは、このピークから得られたマ
ススペクトルを示し、アベナシンに割り当てられた構造を図４ｃに示す。同様に
、残りのピークは、混合物中の成分の相対的な疎水性結合を増加させ又は減少さ
せるためにアイソクラテック溶媒中のエタノール及び水の量を単に変化させるこ
とにより個々に精製することができる。
ール水溶液にとり、同溶媒で重力充填し、平衡化したOctyl Sepharose CL-4B TM の３０mL（＝Ｖb ）の目盛りのついたカラムに吸着させた。次にそのカラムを同
じ溶媒で洗い、次のＫ′値に対応する画分を収集し、ＴＬＣ及びＨＰＬＣにより
アベナシンについて分析した。２．５〜５．５のＫ′の画分は少量のアベナシン
及び微量のアベナコシド様化合物と共にＨＰＬＣプロフィールにおいて観察され
た全ての主なアベナシンを含んだ（ピーク３、図３ａ）。同じカラムであるが、
２５％エタノール水溶液を用いるこの画分の更なるクロマトグラフィーは、ＵＶ
分光光度分析（３６５nmでのダイオードアレイ検出）及びＨＰＬＣ−ＥＬＳＤ分
析により測定して８０％超の純度で６〜８のＫ′の画分に主要アベナシンピーク
を作り出した。この単離されたピークのマススペクトル分析は、そのアベナシン
Ａ−１としての同一性を確認した。図４ａは、ＨＩＣカラムから得られた画分の
ＨＰＬＣ−ＥＬＳＤプロフィールを示し、図４ｂは、このピークから得られたマ
ススペクトルを示し、アベナシンに割り当てられた構造を図４ｃに示す。同様に
、残りのピークは、混合物中の成分の相対的な疎水性結合を増加させ又は減少さ
せるためにアイソクラテック溶媒中のエタノール及び水の量を単に変化させるこ
とにより個々に精製することができる。
【００５９】 更なる例において、上述の通り調製した“アベナコシドサブ画分”を１０mLの
３２．５％エタノール水溶液にとり、同じ溶媒で重力充填し、平衡化したＨＤＴ
ＭＡ+ 型のSP Sephadex C-25TMの３０mL（＝Ｖb ）目盛りつきカラムに吸着させ
た。次にそのカラムを同じ溶媒で洗い、Ｋ′＜２．５，Ｋ′＝２．５〜５及びＫ
′＞５の画分を収集しＴＬＣ及びＨＰＬＣによりアベナコシドについて分析した
。Ｋ′＜２．５の画分は主にアベナコシドピーク２及び３を含み；Ｋ′＝２．５
〜５は少量のピーク４と共にアベナコシドピーク１及び３を含み、そしてＫ′＞
５画分は少量のピーク３と共に主にアベナコシドピーク４及び５を含んだ。
３２．５％エタノール水溶液にとり、同じ溶媒で重力充填し、平衡化したＨＤＴ
ＭＡ+ 型のSP Sephadex C-25TMの３０mL（＝Ｖb ）目盛りつきカラムに吸着させ
た。次にそのカラムを同じ溶媒で洗い、Ｋ′＜２．５，Ｋ′＝２．５〜５及びＫ
′＞５の画分を収集しＴＬＣ及びＨＰＬＣによりアベナコシドについて分析した
。Ｋ′＜２．５の画分は主にアベナコシドピーク２及び３を含み；Ｋ′＝２．５
〜５は少量のピーク４と共にアベナコシドピーク１及び３を含み、そしてＫ′＞
５画分は少量のピーク３と共に主にアベナコシドピーク４及び５を含んだ。
【００６０】 実施例２：Octyl Sepharose CL-4B TM及び新規置換化疎水性ゲルでの疎水性相
互作用クロマトグラフィーを用いるキノアフラワーからのサポニンの単離 以下の例において、キノアサポニンを単離し、ＨＩＣを用いて全体のグループ
として高度に精製した。利点は、本発明の作業範囲内でカチオン電荷を有するサ
ポニンはなく、これによりカチオン交換カラムを介しての抽出混合物の通過はそ
の混合物からいずれのサポニンも除去しないであろうという事実にもある。同様
の溶解度の妨害する化合物が実質的にない最終的なサポニンの豊富な画分を、エ
タノール、水、並びに揮発性酸及び塩基のみを用いて調製した。 薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ） ＴＬＣを実施例１に記載される通り行った。 高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ） ＨＰＬＣ分析を、C8 Keystone カラム１２０Å、５μｍ（２５０×４．６mm）
を用い、２７０nm（一般的なフェノール官能基吸収）をモニターするＵＶダイオ
ードアレイディテクター（Thermo Separation Products, Spectra SYSTEM UV 30
00）を実施例１で作動させたＥＬＳＤディテクターにタンデムでつなげたことを
除いて、実施例１に記載されるのと同じ装置を用いて行った。これにより、非サ
ポニンフェノール系成分を同時に検出することができた。その溶媒システムは、
アセトニトリル、Ｈ2 Ｏ、及び５％氷酢酸水溶液（ｖ％）からなっていた。
互作用クロマトグラフィーを用いるキノアフラワーからのサポニンの単離 以下の例において、キノアサポニンを単離し、ＨＩＣを用いて全体のグループ
として高度に精製した。利点は、本発明の作業範囲内でカチオン電荷を有するサ
ポニンはなく、これによりカチオン交換カラムを介しての抽出混合物の通過はそ
の混合物からいずれのサポニンも除去しないであろうという事実にもある。同様
の溶解度の妨害する化合物が実質的にない最終的なサポニンの豊富な画分を、エ
タノール、水、並びに揮発性酸及び塩基のみを用いて調製した。 薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ） ＴＬＣを実施例１に記載される通り行った。 高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ） ＨＰＬＣ分析を、C8 Keystone カラム１２０Å、５μｍ（２５０×４．６mm）
を用い、２７０nm（一般的なフェノール官能基吸収）をモニターするＵＶダイオ
ードアレイディテクター（Thermo Separation Products, Spectra SYSTEM UV 30
00）を実施例１で作動させたＥＬＳＤディテクターにタンデムでつなげたことを
除いて、実施例１に記載されるのと同じ装置を用いて行った。これにより、非サ
ポニンフェノール系成分を同時に検出することができた。その溶媒システムは、
アセトニトリル、Ｈ2 Ｏ、及び５％氷酢酸水溶液（ｖ％）からなっていた。
【００６１】 時間 アセトニトリル Ｈ2 Ｏ ５％酢酸 ０ １５ ７５ １０ ２５ ２５ ６５ １０ ２９ １００ ０ ０ ３３ １００ ０ ０ ３５ １５ ７５ １０ 流速は１．０mL／分であった。
【００６２】 これにより、キノア種子（Cultivar Colorado 407 (COO7)) を粉砕して２０メ
ッシュを通過させ、フラワーを作った。１００mLの酸性化８０％エタノール水溶
液（エタノール：水：氷酢酸 ８０：１９：１、ｖ：ｖ：ｖ）の加熱溶液（６０
℃）に、撹拌しながら２５ｇのフラワーを注意深く加えた（固体／液体＝１／４
ｖ：ｖ）。その混合物を３０分、撹拌し、次に室温まで冷却した。その混合物
を遠心し（２８３０×ｇ、７分）、その上清を取った。そのペレットを新しい溶
媒（２００mL）で洗い、再び遠心した。その上清をとり、ペレットを新しい溶媒
で３回、再び懸濁した。全ての上清を組み合わせて粗い焼結したガラスフィルタ
ーを介してろ過した。抽出物を構成する暗い黄色のろ液は７．０３のpHを有し、
凍結乾燥したサブサンプルの重力測定分析により測定して７．３％の可溶物を含
んだ。
ッシュを通過させ、フラワーを作った。１００mLの酸性化８０％エタノール水溶
液（エタノール：水：氷酢酸 ８０：１９：１、ｖ：ｖ：ｖ）の加熱溶液（６０
℃）に、撹拌しながら２５ｇのフラワーを注意深く加えた（固体／液体＝１／４
ｖ：ｖ）。その混合物を３０分、撹拌し、次に室温まで冷却した。その混合物
を遠心し（２８３０×ｇ、７分）、その上清を取った。そのペレットを新しい溶
媒（２００mL）で洗い、再び遠心した。その上清をとり、ペレットを新しい溶媒
で３回、再び懸濁した。全ての上清を組み合わせて粗い焼結したガラスフィルタ
ーを介してろ過した。抽出物を構成する暗い黄色のろ液は７．０３のpHを有し、
凍結乾燥したサブサンプルの重力測定分析により測定して７．３％の可溶物を含
んだ。
【００６３】 その抽出液を４０℃でロータリーエバポレーターにより真空下で乾燥するまで
エバポレートし、２．５mLの酸性化５０％エタノール水溶液（エタノール：水：
氷酢酸 ５０：４９：１、ｖ：ｖ：ｖ）にとった。その曇った懸濁液を、酸性化
４０％エタノール水溶液（エタノール：水：氷酢酸 ４０：５９：１、ｖ：ｖ：
ｖ）で予め平衡化し重力充填したOctyl Sepharose CL-4B TMカラム（最終充填Ｖ b ＝２５mL；即ち１mLゲル／gm抽出キノアフラワー）の目盛りのついたガラスカ
ラムに充填した。次にそのカラムを２×Ｖb の酸性化５０％エタノール水溶液で
洗ってＫ′≦２画分を供し、それをロータリーエバポレーションにより４０℃で
真空下で濃縮して黄色いシロップを供した。この画分（Ｋ′≦２）のＴＬＣ分析
は、それがとりわけ、キノアサポニン、糖、アミノ酸、有機酸、及びいくつかの
色素を含むことを示した。カラムに残った材料を：２×Ｖb の酸性化８０％エタ
ノール水溶液を流すことにより除去してＫ′≧２画分を供した（そしてカラムを
再使用のために再生した）。この画分のＴＬＣは、それが極性脂質のバルク及び
いくつかの色素を含むが微量のサポニンも含まないことを示した。重力測定分析
は、このＫ′≧２画分が、もとのキノアフラワーの約１．２％を構成し、サポニ
ンの豊富なＫ′≦２画分が６．４％を超えるフラワーを含むことを示した。
エバポレートし、２．５mLの酸性化５０％エタノール水溶液（エタノール：水：
氷酢酸 ５０：４９：１、ｖ：ｖ：ｖ）にとった。その曇った懸濁液を、酸性化
４０％エタノール水溶液（エタノール：水：氷酢酸 ４０：５９：１、ｖ：ｖ：
ｖ）で予め平衡化し重力充填したOctyl Sepharose CL-4B TMカラム（最終充填Ｖ b ＝２５mL；即ち１mLゲル／gm抽出キノアフラワー）の目盛りのついたガラスカ
ラムに充填した。次にそのカラムを２×Ｖb の酸性化５０％エタノール水溶液で
洗ってＫ′≦２画分を供し、それをロータリーエバポレーションにより４０℃で
真空下で濃縮して黄色いシロップを供した。この画分（Ｋ′≦２）のＴＬＣ分析
は、それがとりわけ、キノアサポニン、糖、アミノ酸、有機酸、及びいくつかの
色素を含むことを示した。カラムに残った材料を：２×Ｖb の酸性化８０％エタ
ノール水溶液を流すことにより除去してＫ′≧２画分を供した（そしてカラムを
再使用のために再生した）。この画分のＴＬＣは、それが極性脂質のバルク及び
いくつかの色素を含むが微量のサポニンも含まないことを示した。重力測定分析
は、このＫ′≧２画分が、もとのキノアフラワーの約１．２％を構成し、サポニ
ンの豊富なＫ′≦２画分が６．４％を超えるフラワーを含むことを示した。
【００６４】 上述の通り調製したＫ′≦２画分を５０mLのエタノール水溶液にとり、５０％
エタノール水溶液で予め平衡化し、重力で充填した、アンモニウム型のSP Sepha
dex C-25TMの目盛りのついたガラスカラムに適用した（最終充填Ｖb ＝２５mL；
即ち１mLゲル／gm抽出キノア）。次にそのカラムを２×Ｖb の５０％エタノール
水溶液で洗い、中性及びアニオン性成分を含むＫ′≦２画分を供し、それをロー
タリーエバポレーションにより４０℃で真空下で濃縮してうすい黄色のシロップ
を供した。次にカラム上のカチオン材料を、２×Ｖb の５％のアンモニアを含む
５０％エタノール水溶液（即ちエタノール：水：濃水酸化アンモニウム ５０：
４５：５ ｖ：ｖ：ｖ）を流すことにより回収し、ロータリーエバポレーション
により４０℃で真空下でＫ′≧２画分を濃縮することにより溶媒及び過剰なアン
モニアを除去した。重力測定分析により、カチオン画分は約１％のキノアフラワ
ーを含むことが見い出され、Ｋ′≦２画分は５．３％超を構成した。これらの画
分のＴＬＣ分析は、全てのサポニンがとりわけ、糖、有機酸、及びいくつかのア
ミノ酸、タンパク質及び色素と共にＫ′≦２画分に存在することを示し、Ｋ′≧
２画分は微量のサポニンも示さなかった。
エタノール水溶液で予め平衡化し、重力で充填した、アンモニウム型のSP Sepha
dex C-25TMの目盛りのついたガラスカラムに適用した（最終充填Ｖb ＝２５mL；
即ち１mLゲル／gm抽出キノア）。次にそのカラムを２×Ｖb の５０％エタノール
水溶液で洗い、中性及びアニオン性成分を含むＫ′≦２画分を供し、それをロー
タリーエバポレーションにより４０℃で真空下で濃縮してうすい黄色のシロップ
を供した。次にカラム上のカチオン材料を、２×Ｖb の５％のアンモニアを含む
５０％エタノール水溶液（即ちエタノール：水：濃水酸化アンモニウム ５０：
４５：５ ｖ：ｖ：ｖ）を流すことにより回収し、ロータリーエバポレーション
により４０℃で真空下でＫ′≧２画分を濃縮することにより溶媒及び過剰なアン
モニアを除去した。重力測定分析により、カチオン画分は約１％のキノアフラワ
ーを含むことが見い出され、Ｋ′≦２画分は５．３％超を構成した。これらの画
分のＴＬＣ分析は、全てのサポニンがとりわけ、糖、有機酸、及びいくつかのア
ミノ酸、タンパク質及び色素と共にＫ′≦２画分に存在することを示し、Ｋ′≧
２画分は微量のサポニンも示さなかった。
【００６５】 サポニンの更なる精製を、２０％エタノール水溶液で予め平衡化し、重力充填
した実施例１の通り調製したＨＤＴＭＡ+ 型のSP Sephadex C-25TMの２５mL目盛
り付きガラスカラムでＨＩＣを用いて行った（最終充填Ｖb ＝２５mL；即ち１mL
ゲル／gm抽出キノア）。上述の通り調製したアニオン性及び中性Ｋ′≦２画分を
２．５mL２０％エタノール水溶液にとり、カラムに充填して２×Ｖb の２０％エ
タノール水溶液で洗ってＫ′≦２画分を供した。まだカラムに吸着している材料
を、２×Ｖb の８０％エタノール水溶液をカラムに通過させることにより回収し
て豊富なサポニン画分を供した。次に両方の画分をロータリーエバポレーション
により４０℃で真空下で乾燥するまでエバポレートし、重力測定分析、ＴＬＣ及
びＨＰＬＣにより分析した。もとのキノアフラワーの約４．７５％を示すＫ′≦
２画分はサポニンを含まず、約０．５９％を構成するＫ′≧２画分はＨＰＬＣ及
びＴＬＣの両方により、極めて豊富な含有量を示した。キノアサポニンの単離及
びグループ分離のためのスキームを図５に要約する。
した実施例１の通り調製したＨＤＴＭＡ+ 型のSP Sephadex C-25TMの２５mL目盛
り付きガラスカラムでＨＩＣを用いて行った（最終充填Ｖb ＝２５mL；即ち１mL
ゲル／gm抽出キノア）。上述の通り調製したアニオン性及び中性Ｋ′≦２画分を
２．５mL２０％エタノール水溶液にとり、カラムに充填して２×Ｖb の２０％エ
タノール水溶液で洗ってＫ′≦２画分を供した。まだカラムに吸着している材料
を、２×Ｖb の８０％エタノール水溶液をカラムに通過させることにより回収し
て豊富なサポニン画分を供した。次に両方の画分をロータリーエバポレーション
により４０℃で真空下で乾燥するまでエバポレートし、重力測定分析、ＴＬＣ及
びＨＰＬＣにより分析した。もとのキノアフラワーの約４．７５％を示すＫ′≦
２画分はサポニンを含まず、約０．５９％を構成するＫ′≧２画分はＨＰＬＣ及
びＴＬＣの両方により、極めて豊富な含有量を示した。キノアサポニンの単離及
びグループ分離のためのスキームを図５に要約する。
【００６６】 この富化キノアサポニン画分の同時のＨＰＬＣ−ＵＶ分析を伴うＨＰＬＣ−Ｅ
ＬＳＤは、その画分が主要な妨害する非サポニン成分を実質的に含まないことを
示した。代表的なＨＰＬＣプロフィールを図６ａ及び６ｂに示す。ＨＰＬＣ−Ｅ
ＬＳＤプロフィール（図６ａ）は、２１〜２９分の保持時間で３つの主要なピー
クを示した。同じスケールの応答と比較した場合、ＨＰＬＣ−ＵＶプロフィール
（図６ｂ）は、ＥＬＳＤプロフィールにも存在する４〜８分の間に溶出する２７
０nmで吸収があるフェノール官能基を含むいくつかの小さな非サポニンピークを
示した。ＴＬＣ分析は、これらの非サポニン成分が、とりわけ、フェノール系色
素、いくつかのアミノ酸、及びいくつかのタンパク質様材料を含んでいることを
示した。全てのＥＬＳＤピークの分画統合は、この富化サポニン画分のおおよそ
の純度を９０％超と評価することができた。
ＬＳＤは、その画分が主要な妨害する非サポニン成分を実質的に含まないことを
示した。代表的なＨＰＬＣプロフィールを図６ａ及び６ｂに示す。ＨＰＬＣ−Ｅ
ＬＳＤプロフィール（図６ａ）は、２１〜２９分の保持時間で３つの主要なピー
クを示した。同じスケールの応答と比較した場合、ＨＰＬＣ−ＵＶプロフィール
（図６ｂ）は、ＥＬＳＤプロフィールにも存在する４〜８分の間に溶出する２７
０nmで吸収があるフェノール官能基を含むいくつかの小さな非サポニンピークを
示した。ＴＬＣ分析は、これらの非サポニン成分が、とりわけ、フェノール系色
素、いくつかのアミノ酸、及びいくつかのタンパク質様材料を含んでいることを
示した。全てのＥＬＳＤピークの分画統合は、この富化サポニン画分のおおよそ
の純度を９０％超と評価することができた。
【００６７】 ＨＰＬＣ分析に用いた溶出勾配を考慮して、キノアサポニンは、相対的疎水性
に基づいて図６ｃに示す通り２つの主なグループにおおよそ分けることができる
。相対的に低い疎水性のキノアグループ１サポニンは溶媒中１５％〜２５％アセ
トニトリルを利用する勾配の部分で１４〜２７分で溶出した。このグループは、
主要成分を構成するピーク５及び６で少くとも１２のクロマトグラフィーで明確
なサポニンからなる。他方、キノアグループ２サポニンは、１００％アセトニト
リルまでの溶出勾配の迅速な勾配の後でのみ溶出し、１つの主要成分ピーク１３
及び少くとも２の更なるサポニンを含み、この特定の品種から全部で少くとも１
５のサポニンを形成した。
に基づいて図６ｃに示す通り２つの主なグループにおおよそ分けることができる
。相対的に低い疎水性のキノアグループ１サポニンは溶媒中１５％〜２５％アセ
トニトリルを利用する勾配の部分で１４〜２７分で溶出した。このグループは、
主要成分を構成するピーク５及び６で少くとも１２のクロマトグラフィーで明確
なサポニンからなる。他方、キノアグループ２サポニンは、１００％アセトニト
リルまでの溶出勾配の迅速な勾配の後でのみ溶出し、１つの主要成分ピーク１３
及び少くとも２の更なるサポニンを含み、この特定の品種から全部で少くとも１
５のサポニンを形成した。
【００６８】 本発明のクロマトグラフィー精製適用の更なる例として、キノアサポニンをグ
ループ１サポニン及びグループ２サポニンへの更なる分画にかけ、残りの非サポ
ニン成分を同時に除去した。この適用において、２つのサポニングループ及び新
しい置換化疎水性ゲルへの相対的な疎水性結合の間の差から使用を行った。非サ
ポニン成分のいくつかをアニオン交換クロマトグラフィーにより最初に除去した
。
ループ１サポニン及びグループ２サポニンへの更なる分画にかけ、残りの非サポ
ニン成分を同時に除去した。この適用において、２つのサポニングループ及び新
しい置換化疎水性ゲルへの相対的な疎水性結合の間の差から使用を行った。非サ
ポニン成分のいくつかをアニオン交換クロマトグラフィーにより最初に除去した
。
【００６９】 これより、上述の通り調製した富化サポニン画分（即ちＨＤＴＭＡ+ 型のSP S
ephadex C-25TMでの２０％エタノール中Ｋ′≧２）を減圧下で乾燥するまでエバ
ポレートして５０％エタノール水溶液にとった（５mL）。黄色がかった溶液を、
本質的に実施例１に記載されるように調製したQAE Sephadex A-25 TMの２５mLア
ニオン交換カラムに適用した。但し、アセテート型のかわりにホルメート型に変
換し、そして５０％エタノール水溶液で予め平衡化した（最終充填容量Ｖb ＝２
５mL；即ち１mLゲル／gm抽出キノアフラワー）。次にそのカラムを２×Ｖb の５
０％エタノール水溶液で洗い、Ｋ′≦２画分を供して、ロータリーエバポレーシ
ョンにより４０℃で真空下で乾燥するまでエバポレートした。次に、まだカラム
に吸着している材料を、３×Ｖb の酸性化５０％エタノール水溶液（エタノール
：水：ギ酢酸 ５０：４５：５、ｖ：ｖ：ｖ）をカラムに流すことにより除去し
てＫ′≧２画分を生成し、それもロータリーエバポレーションにより４０℃で真
空下で乾燥するまでエバポレートした。次に両方の画分をＴＬＣ及びＨＰＬＣに
より分析した。Ｋ′≦２画分のＴＬＣプレートの再生（図７ａ）に示す通り、こ
の画分は、黄色の色素と共に全てのサポニンを含んだ。Ｋ′≧２画分においてサ
ポニンは検出されなかった。
ephadex C-25TMでの２０％エタノール中Ｋ′≧２）を減圧下で乾燥するまでエバ
ポレートして５０％エタノール水溶液にとった（５mL）。黄色がかった溶液を、
本質的に実施例１に記載されるように調製したQAE Sephadex A-25 TMの２５mLア
ニオン交換カラムに適用した。但し、アセテート型のかわりにホルメート型に変
換し、そして５０％エタノール水溶液で予め平衡化した（最終充填容量Ｖb ＝２
５mL；即ち１mLゲル／gm抽出キノアフラワー）。次にそのカラムを２×Ｖb の５
０％エタノール水溶液で洗い、Ｋ′≦２画分を供して、ロータリーエバポレーシ
ョンにより４０℃で真空下で乾燥するまでエバポレートした。次に、まだカラム
に吸着している材料を、３×Ｖb の酸性化５０％エタノール水溶液（エタノール
：水：ギ酢酸 ５０：４５：５、ｖ：ｖ：ｖ）をカラムに流すことにより除去し
てＫ′≧２画分を生成し、それもロータリーエバポレーションにより４０℃で真
空下で乾燥するまでエバポレートした。次に両方の画分をＴＬＣ及びＨＰＬＣに
より分析した。Ｋ′≦２画分のＴＬＣプレートの再生（図７ａ）に示す通り、こ
の画分は、黄色の色素と共に全てのサポニンを含んだ。Ｋ′≧２画分においてサ
ポニンは検出されなかった。
【００７０】 次のステップは、ＨＤＴＭＡ+ 型のSP Sephadex C-25TMでのＨＩＣによりグル
ープ２サポニンからグループ１サポニンを分離することであった。これにより、
先のアニオン交換ステップからのＫ′≦２画分を２．５mLの５０％エタノール水
溶液にとり、上述のように調製し、重力充填した５０％エタノール水溶液で予め
平衡化したＨＤＴＭＡ+ 型のSP Sephadex C-25TMの目盛りつきガラスカラムに吸
着させた（最終充填容量Ｖb ＝２５mL；即ち１mLゲル／gm抽出キノアフラワー）
。次にそのカラムを２×Ｖb の５０％エタノール水溶液で洗ってＫ′≦２画分を
供した。まだカラムに吸着している材料を、２×Ｖb の８０％エタノール水溶液
をカラムに流すことにより除去してＫ′≧２画分を作った。次に両方の画分をロ
ータリーエバポレーターにより４０℃で真空下で乾燥するまでエバポレートし、
ＴＬＣ及びＨＰＬＣにより分析した。Ｋ′≦２画分のＴＬＣプレートの再生にお
いて（図７ｂ）示したように、この画分は、ＨＰＬＣ−ＥＬＳＤ分析により測定
して本質的にグループ１キノアサポニンのみを含み、色素は含まなかった。ＨＰ
ＬＣ−ＥＬＳＤ分画統合及びＴＬＣスポット強度の比較により、０．１９〜０．
２６の間のＲｆ値のＴＬＣプレートの主要ゾーン（図７ｂ）は、ピークＢに対応
した。ＥＬＳＤピークの分画統合は、このサポニン画分のおおよその純度を９９
％超と評価した。Ｋ′≧２画分は、同じＨＩＣゲルを用いるかより高い水含量の
溶媒を用いる最終的な処理により分離することができるサポニンの残り及びフェ
ノール系色素を含んだ。これにより、グループ２サポニン及び色素を含むＫ′≧
２画分を２．５mLの３５％エタノール水溶液にとり、３５％エタノール水溶液で
予め平衡化したＨＤＴＭＡ+ 型のSP Sephadex C-25TMの同じカラムに吸着させた
（最終充填容量Ｖb ＝２５mL；即ち１mLゲル／gm抽出キノアフラワー）。そのカ
ラムを４×Ｖb の３５％エタノール水溶液で洗ってＫ′≦４画分を供し、それを
ロータリーエバポレーションにより４０℃で真空下で乾燥するまでエバポレート
して黄色がかった液体を供した。まだカラムに吸着している材料を次に、２×Ｖ b の６０％エタノール水溶液をカラムに流すことにより除去してＫ′≧４画分を
供した。この画分の４０℃での真空下での乾燥するまでのロータリーエバポレー
ションにより白色粉末を供した。Ｋ′≦４のＴＬＣ及びＨＰＬＣ−ＥＬＳＤ分析
は、この画分にサポニンはないが、全てでないならほとんどの色素を含んだ。他
方、Ｋ′≧４画分のＴＬＣプレートの再生に示す通り（図７ｃ）、この画分は、
ＨＰＬＣ−ＥＬＳＤ分析により測定して本質的にグループ２キノアサポニンのみ
を含み、色素はなかった。主要ピークは、０．４０〜０．４８の間、Ｒｆ値でＴ
ＬＣプレート上の流動ゾーン近くに現れた。全てのＥＬＳＤピークの分画統合は
、このサポニン画分のおおよその純度を９９％超であると評価した。キノアグル
ープ１及び２サポニンの精製及び分離のためのスキームを図８に要約する。
ープ２サポニンからグループ１サポニンを分離することであった。これにより、
先のアニオン交換ステップからのＫ′≦２画分を２．５mLの５０％エタノール水
溶液にとり、上述のように調製し、重力充填した５０％エタノール水溶液で予め
平衡化したＨＤＴＭＡ+ 型のSP Sephadex C-25TMの目盛りつきガラスカラムに吸
着させた（最終充填容量Ｖb ＝２５mL；即ち１mLゲル／gm抽出キノアフラワー）
。次にそのカラムを２×Ｖb の５０％エタノール水溶液で洗ってＫ′≦２画分を
供した。まだカラムに吸着している材料を、２×Ｖb の８０％エタノール水溶液
をカラムに流すことにより除去してＫ′≧２画分を作った。次に両方の画分をロ
ータリーエバポレーターにより４０℃で真空下で乾燥するまでエバポレートし、
ＴＬＣ及びＨＰＬＣにより分析した。Ｋ′≦２画分のＴＬＣプレートの再生にお
いて（図７ｂ）示したように、この画分は、ＨＰＬＣ−ＥＬＳＤ分析により測定
して本質的にグループ１キノアサポニンのみを含み、色素は含まなかった。ＨＰ
ＬＣ−ＥＬＳＤ分画統合及びＴＬＣスポット強度の比較により、０．１９〜０．
２６の間のＲｆ値のＴＬＣプレートの主要ゾーン（図７ｂ）は、ピークＢに対応
した。ＥＬＳＤピークの分画統合は、このサポニン画分のおおよその純度を９９
％超と評価した。Ｋ′≧２画分は、同じＨＩＣゲルを用いるかより高い水含量の
溶媒を用いる最終的な処理により分離することができるサポニンの残り及びフェ
ノール系色素を含んだ。これにより、グループ２サポニン及び色素を含むＫ′≧
２画分を２．５mLの３５％エタノール水溶液にとり、３５％エタノール水溶液で
予め平衡化したＨＤＴＭＡ+ 型のSP Sephadex C-25TMの同じカラムに吸着させた
（最終充填容量Ｖb ＝２５mL；即ち１mLゲル／gm抽出キノアフラワー）。そのカ
ラムを４×Ｖb の３５％エタノール水溶液で洗ってＫ′≦４画分を供し、それを
ロータリーエバポレーションにより４０℃で真空下で乾燥するまでエバポレート
して黄色がかった液体を供した。まだカラムに吸着している材料を次に、２×Ｖ b の６０％エタノール水溶液をカラムに流すことにより除去してＫ′≧４画分を
供した。この画分の４０℃での真空下での乾燥するまでのロータリーエバポレー
ションにより白色粉末を供した。Ｋ′≦４のＴＬＣ及びＨＰＬＣ−ＥＬＳＤ分析
は、この画分にサポニンはないが、全てでないならほとんどの色素を含んだ。他
方、Ｋ′≧４画分のＴＬＣプレートの再生に示す通り（図７ｃ）、この画分は、
ＨＰＬＣ−ＥＬＳＤ分析により測定して本質的にグループ２キノアサポニンのみ
を含み、色素はなかった。主要ピークは、０．４０〜０．４８の間、Ｒｆ値でＴ
ＬＣプレート上の流動ゾーン近くに現れた。全てのＥＬＳＤピークの分画統合は
、このサポニン画分のおおよその純度を９９％超であると評価した。キノアグル
ープ１及び２サポニンの精製及び分離のためのスキームを図８に要約する。
【００７１】 実施例３：疎水性相互作用クロマトグラフィーを用いるサポニンの分離及び精
製のためのイオン置換化対共通結合置換化ゲルの利用性の比較 ポリサッカライド骨格に基づき、１２までの鎖長のいくつかの異なる共有結合
したアルキルリガンドのいずれか一つを含むマクロポーラスクロマトグラフィー
媒体は市販されている。このような製品の例には、例えばButyl Sepharose TM（
Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ）、アミノヘキシルアガロース（
Ｃ6 ）及びドデシルアガロース（Ｃ12）（Sigma Chemical Co., St.Louis, MO）
がある。これらのゲルは、ほとんどの部分、低リガンド置換率、典型的には４０
μＭリガンド／mLゲル以下であり、低分子量化合物について比較的低い疎水性相
互作用活性及び高いコストとなっている。本発明によれば、疎水性相互作用クロ
マトグラフィー分離は、広範囲の種々の疎水性対イオンのうちのいづれか１つを
用いて、マクロポーラスの、高度に置換されたアニオンに又はカチオンに荷電し
たポリサッカライドゲルで有効にかつ効率よく行うことができる。このようなゲ
ルは使用の時に容易かつ可逆的に生成され、ほとんどの生理的及び生化学的作業
条件下で安定である。
製のためのイオン置換化対共通結合置換化ゲルの利用性の比較 ポリサッカライド骨格に基づき、１２までの鎖長のいくつかの異なる共有結合
したアルキルリガンドのいずれか一つを含むマクロポーラスクロマトグラフィー
媒体は市販されている。このような製品の例には、例えばButyl Sepharose TM（
Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ）、アミノヘキシルアガロース（
Ｃ6 ）及びドデシルアガロース（Ｃ12）（Sigma Chemical Co., St.Louis, MO）
がある。これらのゲルは、ほとんどの部分、低リガンド置換率、典型的には４０
μＭリガンド／mLゲル以下であり、低分子量化合物について比較的低い疎水性相
互作用活性及び高いコストとなっている。本発明によれば、疎水性相互作用クロ
マトグラフィー分離は、広範囲の種々の疎水性対イオンのうちのいづれか１つを
用いて、マクロポーラスの、高度に置換されたアニオンに又はカチオンに荷電し
たポリサッカライドゲルで有効にかつ効率よく行うことができる。このようなゲ
ルは使用の時に容易かつ可逆的に生成され、ほとんどの生理的及び生化学的作業
条件下で安定である。
【００７２】 逆相及び疎水性相互作用クロマトグラフィーの実施は、一般に、同一溶出条件
下で、定常相上で置換された疎水性リガンドに対する特定の基質の相対的結合ア
フィニティーがリガンドの鎖長の増加に伴って増加するであろうことを教示する
。これらの直ちに修飾されるゲルの利用性を示すため及びそれらの相対的結合特
性を比較するため、一連の実験を、同一のカラム及び基質条件を用いるが定常相
ゲルリガンド鎖長の型及び回収溶媒組成（即ちエタノール水溶液）を変化させて
行った。ゲルマトリックスは次の通りであった：製造元から供されるButyl Seph
arose TM及びOctyl Sepharose CL-4B TM；以下の通り調製したドデシルスルフェ
ート型のQAE Sephadex A-25 TM、及び以下の通り調製したヘキサデシルトリメチ
ルアンモニウム型のSP Sephadex C-25TM。長い波長のＵＶ光（３６５nm）におい
てこれらのゲルで、いずれの適切な吸光又は蛍光を示すものはなかった点を指摘
するべきである。その基質は、実施例１に記載されるようにオートグロートから
調製され、精製されるサポニンアベナシンＡ−１であった。このサポニンは、長
い波長のＵＶ光下で目盛りのついたガラスカラムを単に観察することによりゲル
マトリックスを介してのそのマイグレーションのカラム上のモニタリングを許容
する３６５nmでの溶液中での強力な自己蛍光であるＮ−メチルアントラニロイル
成分を含む。カラムベッドは中孔質ポリプロピレンフリットディスクを備えた容
量測定の目盛りがついたガラスカラム中３０mL重力充填であった。
下で、定常相上で置換された疎水性リガンドに対する特定の基質の相対的結合ア
フィニティーがリガンドの鎖長の増加に伴って増加するであろうことを教示する
。これらの直ちに修飾されるゲルの利用性を示すため及びそれらの相対的結合特
性を比較するため、一連の実験を、同一のカラム及び基質条件を用いるが定常相
ゲルリガンド鎖長の型及び回収溶媒組成（即ちエタノール水溶液）を変化させて
行った。ゲルマトリックスは次の通りであった：製造元から供されるButyl Seph
arose TM及びOctyl Sepharose CL-4B TM；以下の通り調製したドデシルスルフェ
ート型のQAE Sephadex A-25 TM、及び以下の通り調製したヘキサデシルトリメチ
ルアンモニウム型のSP Sephadex C-25TM。長い波長のＵＶ光（３６５nm）におい
てこれらのゲルで、いずれの適切な吸光又は蛍光を示すものはなかった点を指摘
するべきである。その基質は、実施例１に記載されるようにオートグロートから
調製され、精製されるサポニンアベナシンＡ−１であった。このサポニンは、長
い波長のＵＶ光下で目盛りのついたガラスカラムを単に観察することによりゲル
マトリックスを介してのそのマイグレーションのカラム上のモニタリングを許容
する３６５nmでの溶液中での強力な自己蛍光であるＮ−メチルアントラニロイル
成分を含む。カラムベッドは中孔質ポリプロピレンフリットディスクを備えた容
量測定の目盛りがついたガラスカラム中３０mL重力充填であった。
【００７３】 基本的に、２つの異なる型のイオン交換体、アニオン性又はカチオン性、好ま
しくはイオンで置換されたポリサッカライドゲルからなるものを親水性コアとし
て用いることができる。このコアに、ポリサッカライドの電荷と反対の電荷の強
くイオン化できる官能基を含む疎水性リガンドを、そのもとのポリサッカライド
内の利用できるイオン性部位の全て又は実質的に全てがリガンドにより占有され
て修飾された疎水性相成分を形成するように、イオン交換により結合される。こ
れにより、この例において、０．５ミリ等量／mL交換能力を含む（製造元から得
られる）クロライド型のQAE Sephadex A-25 TMアニオン交換クロマトグラフィー
ゲル（Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ）を膨潤させ、５０％エタ
ノール水溶液で平衡化して容量測定で較正したクロマトグラフィーカラムに重力
充填して周知の容量のベッドを供した。そのカラムを最初に、５０％エタノール
中０．５Ｎ ＮａＯＨの過剰量をカラムに流し、そのベッドを中性pHに、５０％
エタノール水溶液で洗うことによりヒドロキシド型に変換した。次にそのベッド
を２倍ミリ等量過剰な５０％エタノール水溶液中ドデシル硫酸ナトリウム（SDS,
Fisher Scientific, Ottawa, ON）を流し、再びそのカラムを５０％エタノール
水溶液で洗って過剰なＳＤＳを除去することにより、ラウリルスルフェート型に
変換した。１２炭素の直鎖脂肪成分を含む強力にイオン化された（例えばスルフ
ェート）アニオン界面活性剤を用いることにより、クロマトグラフィー媒体は実
質的にＨＩＣカラムを供するよう改変されている。それは、pH域２．５〜１１に
わたって比較的安定であり、直ちに利用できるゲルより長いアルキル鎖長（Ｃ−
１２対Octyl-Sepharose CL-4B TMについてＣ−８）、及び約１０倍大きい置換の
割合（例えば名目上０．５ミリモル／mL対Octyl-Sepharose CL-4B TMについて５
０μモル／mL）のため、疎水性相互作用のための増加された能力を有し、なおＨ
ＩＣ適用のために適した特性を維持する。
しくはイオンで置換されたポリサッカライドゲルからなるものを親水性コアとし
て用いることができる。このコアに、ポリサッカライドの電荷と反対の電荷の強
くイオン化できる官能基を含む疎水性リガンドを、そのもとのポリサッカライド
内の利用できるイオン性部位の全て又は実質的に全てがリガンドにより占有され
て修飾された疎水性相成分を形成するように、イオン交換により結合される。こ
れにより、この例において、０．５ミリ等量／mL交換能力を含む（製造元から得
られる）クロライド型のQAE Sephadex A-25 TMアニオン交換クロマトグラフィー
ゲル（Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ）を膨潤させ、５０％エタ
ノール水溶液で平衡化して容量測定で較正したクロマトグラフィーカラムに重力
充填して周知の容量のベッドを供した。そのカラムを最初に、５０％エタノール
中０．５Ｎ ＮａＯＨの過剰量をカラムに流し、そのベッドを中性pHに、５０％
エタノール水溶液で洗うことによりヒドロキシド型に変換した。次にそのベッド
を２倍ミリ等量過剰な５０％エタノール水溶液中ドデシル硫酸ナトリウム（SDS,
Fisher Scientific, Ottawa, ON）を流し、再びそのカラムを５０％エタノール
水溶液で洗って過剰なＳＤＳを除去することにより、ラウリルスルフェート型に
変換した。１２炭素の直鎖脂肪成分を含む強力にイオン化された（例えばスルフ
ェート）アニオン界面活性剤を用いることにより、クロマトグラフィー媒体は実
質的にＨＩＣカラムを供するよう改変されている。それは、pH域２．５〜１１に
わたって比較的安定であり、直ちに利用できるゲルより長いアルキル鎖長（Ｃ−
１２対Octyl-Sepharose CL-4B TMについてＣ−８）、及び約１０倍大きい置換の
割合（例えば名目上０．５ミリモル／mL対Octyl-Sepharose CL-4B TMについて５
０μモル／mL）のため、疎水性相互作用のための増加された能力を有し、なおＨ
ＩＣ適用のために適した特性を維持する。
【００７４】 同様に、ＨＩＣのために適した修飾クロマトグラフィー媒体を、同様の方法及
びカチオンイオン交換体を用いて調製した。これにより、例えば０．３ミリ等量
／mL交換能力を含む（製造元から得られる）ナトリウム型のSP Sephadex C-25TM カチオン交換クロマトグラフィーゲル（Amersham Pharmacia Biotech, Piscataw
ay, NJ）を膨潤させて、５０％エタノール水溶液で平衡化させ、容量測定で較正
したクロマトグラフィーカラムに重力充填して周知の容量のベッドを供した。そ
のカラムを、最初に５０％エタノール水溶液中０．１Ｎ ＨＣｌの過剰量をカラ
ムに流し、そしてそのベッドを５０％エタノール水溶液で中性pHまで洗うことに
よりヒドロニウム型に変換した。次にそのベッドを、２倍ミリ等量過剰な５０％
エタノール水溶液中ヘキサデシルトリメチルアンモニウムを流し（HDTMA, Sigma
Chemical Co., St.Louis, MO ）、そのカラムを５０％エタノール水溶液で洗っ
て過剰なＨＤＴＭＡを除去することにより、ヘキサデシルトリメチルアンモニウ
ム型に変換した。再び、１６炭素の直鎖脂肪族成分を含む強力にイオン化した（
例えば第四アミン）カチオン界面活性剤を用いることにより、クロマトグラフィ
ー媒体はＨＩＣカラムを供するよう改変された。これは、pH域２．０〜１３にわ
たって比較的安定であり、直ちに利用できるゲルより長いアルキル鎖長（Ｃ−１
６対Octyl-Sepharose CL-4B TMについてＣ−８）、及び約１０倍大きい置換の程
度（例えば名目上、０．３ミリモル／mL対Octyl-Sepharose CL-4B TMについて５
０μモル／mL）のため、相水性相互作用のための能力が増加しており、なおＨＩ
Ｃ適用のために適した特性を維持する。
びカチオンイオン交換体を用いて調製した。これにより、例えば０．３ミリ等量
／mL交換能力を含む（製造元から得られる）ナトリウム型のSP Sephadex C-25TM カチオン交換クロマトグラフィーゲル（Amersham Pharmacia Biotech, Piscataw
ay, NJ）を膨潤させて、５０％エタノール水溶液で平衡化させ、容量測定で較正
したクロマトグラフィーカラムに重力充填して周知の容量のベッドを供した。そ
のカラムを、最初に５０％エタノール水溶液中０．１Ｎ ＨＣｌの過剰量をカラ
ムに流し、そしてそのベッドを５０％エタノール水溶液で中性pHまで洗うことに
よりヒドロニウム型に変換した。次にそのベッドを、２倍ミリ等量過剰な５０％
エタノール水溶液中ヘキサデシルトリメチルアンモニウムを流し（HDTMA, Sigma
Chemical Co., St.Louis, MO ）、そのカラムを５０％エタノール水溶液で洗っ
て過剰なＨＤＴＭＡを除去することにより、ヘキサデシルトリメチルアンモニウ
ム型に変換した。再び、１６炭素の直鎖脂肪族成分を含む強力にイオン化した（
例えば第四アミン）カチオン界面活性剤を用いることにより、クロマトグラフィ
ー媒体はＨＩＣカラムを供するよう改変された。これは、pH域２．０〜１３にわ
たって比較的安定であり、直ちに利用できるゲルより長いアルキル鎖長（Ｃ−１
６対Octyl-Sepharose CL-4B TMについてＣ−８）、及び約１０倍大きい置換の程
度（例えば名目上、０．３ミリモル／mL対Octyl-Sepharose CL-4B TMについて５
０μモル／mL）のため、相水性相互作用のための能力が増加しており、なおＨＩ
Ｃ適用のために適した特性を維持する。
【００７５】 基質の相対的な相水性相互作用の程度は、カラム上の蛍光バンドの直接の測定
により先に規定されるような、Ｋ′値から得られた。Ｋ′値を、蛍光ゾーンのリ
ーディング及びテーリング端の両方について記録し、これらのＫ′値を平均化し
た。結果を、異なる鎖長で置換したアルキルトリメチルアンモニウム型のSP Sep
hadex C-25TMカラムを用いて表１に要約する。
により先に規定されるような、Ｋ′値から得られた。Ｋ′値を、蛍光ゾーンのリ
ーディング及びテーリング端の両方について記録し、これらのＫ′値を平均化し
た。結果を、異なる鎖長で置換したアルキルトリメチルアンモニウム型のSP Sep
hadex C-25TMカラムを用いて表１に要約する。
【００７６】 表 １ アベナシンＡ−１の結合への疎水性リガンド鎖長の効果 ─────────────────────────────────── 洗浄溶媒 種々のリガンド側鎖での平均Ｋ′値 (EtOH:H2O) Ｃ4 Ｃ8 Ｃ12 Ｃ14 Ｃ16 Ｃ18 (v:v) ─────────────────────────────────── 10：90 12.75 19.5 20：80 5.66 11.75 30：70 1.74 3.99 40：60 1.24 1.45 4.83 5.25 7.56 9.82 50：50 1.19 1.63 1.68 1.92 2.44 60：40 1.08 1.18 1.26 1.55 ─────────────────────────────────── これらの結果を図９及び１０に示す。図９に、異なる鎖長置換を用いるアベナ
シンＡ−１のＫ′値へのエタノール濃度の効果を示す。本発明によれば、分離は
、グラフの急勾配において最も有効であろう。このグラフの領域においてエタノ
ール濃度の小さな変化はＫ′値の大きな変化になり、これにより、それが互いか
ら単離することができるように、２つの化合物間の有効な分離を許容する。他方
、曲線の勾配が収集しているグラフの終りでは、２つの化合物は一緒にカラムか
ら溶出し、エタノールの濃度の変化はＫ′値に大きな変化を与えないであろう。
図１０は鎖長の関数としてのアベナシンＡ−１についてのＫ′値へのエタノール
濃度及び基質疎水性の効果を示す同じ結果のプロットである。これにより、これ
らのグラフは、化合物型、この例においてアベナシンＡ−１からの分離のための
至適エタノール濃度及びカラム鎖長を選択する助けとして用いることができる。
当業者に明らかであろうように、類似した一連の実験を、適切な精製ストラテジ
ーを導き出すために、単離すべき関心の他の化合物で行うことができる。
シンＡ−１のＫ′値へのエタノール濃度の効果を示す。本発明によれば、分離は
、グラフの急勾配において最も有効であろう。このグラフの領域においてエタノ
ール濃度の小さな変化はＫ′値の大きな変化になり、これにより、それが互いか
ら単離することができるように、２つの化合物間の有効な分離を許容する。他方
、曲線の勾配が収集しているグラフの終りでは、２つの化合物は一緒にカラムか
ら溶出し、エタノールの濃度の変化はＫ′値に大きな変化を与えないであろう。
図１０は鎖長の関数としてのアベナシンＡ−１についてのＫ′値へのエタノール
濃度及び基質疎水性の効果を示す同じ結果のプロットである。これにより、これ
らのグラフは、化合物型、この例においてアベナシンＡ−１からの分離のための
至適エタノール濃度及びカラム鎖長を選択する助けとして用いることができる。
当業者に明らかであろうように、類似した一連の実験を、適切な精製ストラテジ
ーを導き出すために、単離すべき関心の他の化合物で行うことができる。
【００７７】 表２は、QAE Sephadex A-25 TMドデシル硫酸カラム及びSP Sephadex C-25TMド
デシルトリメチルアンモニウムカラムの使用の間の比較を示す。２つのカラム間
でＫ′値に差があるが、Ｋ′値間の関係及びエタノールの濃度は同じである。 表 ２ アベナシンＡ−１の結合へのカラム型の効果 ─────────────────────────────────── 洗浄溶媒 平均Ｋ′値 (EtOH:H2O) QAE Sephadex A-25TM SP Sephadex C-25TMドデシ (v:v) ドデシルスルフェート ルトリメチルアンモニウム (C12) (C12) ─────────────────────────────────── 10：90 20：80 30：70 40：60 3.33 4.83 50：50 0.70 1.63 60：40 0.53 1.08 ─────────────────────────────────── 全ての科学文献及び特許文献は引用により本明細書に組み込まれる。
デシルトリメチルアンモニウムカラムの使用の間の比較を示す。２つのカラム間
でＫ′値に差があるが、Ｋ′値間の関係及びエタノールの濃度は同じである。 表 ２ アベナシンＡ−１の結合へのカラム型の効果 ─────────────────────────────────── 洗浄溶媒 平均Ｋ′値 (EtOH:H2O) QAE Sephadex A-25TM SP Sephadex C-25TMドデシ (v:v) ドデシルスルフェート ルトリメチルアンモニウム (C12) (C12) ─────────────────────────────────── 10：90 20：80 30：70 40：60 3.33 4.83 50：50 0.70 1.63 60：40 0.53 1.08 ─────────────────────────────────── 全ての科学文献及び特許文献は引用により本明細書に組み込まれる。
【００７８】 本発明は、好ましい実施形態に関して記載されている。しかしながら、以下の
請求の範囲に記載される本発明の範囲から逸脱することなく、いくつかのバリエ
ーション及び改変を行うことができることが当業者に理解されよう。
請求の範囲に記載される本発明の範囲から逸脱することなく、いくつかのバリエ
ーション及び改変を行うことができることが当業者に理解されよう。
【００７９】 本発明のこれら及び他の特徴は、以下の添付図面を引用して、以下の記載から
より明らかになるであろう。
より明らかになるであろう。
【図１】 オートのサポニンの抽出及びグループ分離を示す。
【図２】 アベナシン型及びアベナコシド型オートサポニンの分離を示す。
【図３Ａ】 オートアベナシンサポニンのＨＰＬＣ−ＥＬＳＤプロフィールを示す。
【図３Ｂ】 オートアベナコシドサポニンのＨＰＬＣ−ＥＬＳＤプロフィールを示す。
【図４Ａ】 Octyl Sepharose CL-4B TMで精製したAvenacia A-1のＨＰＬＣ−ＥＬＳＤプロ
フィールを示す。
フィールを示す。
【図４Ｂ】 精製されたAvenacia A-1の質量分析を示す。
【図４Ｃ】 オートグロート（oat groats）からのAvenacia A-1の構造を示す。
【図５】 キノアからのサポニンの単離及びグループ分離を示す。
【図６Ａ】 キノアサポニン画分のＨＰＬＣ−ＥＬＳＤプロフィールを示す。
【図６Ｂ】 キノアサポニン画分のＨＰＬＣ−ＵＶプロフィールを示す。
【図６Ｃ】 キノアサポニンについてのＨＰＬＣ−ＥＬＳＤアサインメントを示す。
【図７】 図７Ａはキノア富化サポニン画分のＴＬＣプロフィールを示す。 図７Ｂはキノアグループ１サポニン画分のＴＬＣプロフィールを示す。 図７Ｃはキノアグループ２サポニン画分のＴＬＣプロフィールを示す。
【図８】 グループ１及び２サポニンの精製及び分離を示す。
【図９】 異なる鎖長のSP Sephadex C-25TMアルキルトリメチルアンモニウムカラムでの
Avenacia A-1の種々のＫ′値についてのエタノール濃度と鎖長との間の関係を示
す。
Avenacia A-1の種々のＫ′値についてのエタノール濃度と鎖長との間の関係を示
す。
【図１０】 鎖長に関してのみ表した図９におけるＫ′値へのエタノール濃度間の関係を示
す。
す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 35/78 Ａ６１Ｋ 35/78 Ｎ Ｂ０１Ｊ 20/32 Ｂ０１Ｊ 20/32 Ｚ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ， ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，Ｌ Ｖ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ， ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，Ｕ Ｓ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 コリンズ，エフ．ウイリアム カナダ国，オンタリオ ケー１ワイ １ジ ェイ２，オタワ，パークデイル アベニュ 596 (72)発明者 サール，エー．ベイチル カナダ国，オンタリオ ケー２エイチ ７ ビー４，オタワ，ベースライン ロード 2672 (72)発明者 フィールダー，デビッド エー． カナダ国，オンタリオ ケー１エス １ケ ー７，オタワ，マクギリブレイ ストリー ト 185 Ｆターム(参考） 4C088 AB26 AB40 AB43 AB59 AB61 AB73 AB74 BA08 CA14 4G066 AC01B BA28 CA56 EA01 【要約の続き】 は有機溶媒の存在下でその濃縮及び選択の結果として吸 着し、脱離するその方法は、更に、更なる使用のために ゲルマトリックスを再生する任意ステップを含む。
Claims (57)
- 【請求項１】 マクロポーラスイオン性ポリサッカライドクロマトグラフィ
ーマトリックスから、静電的に結合した脂肪族又は脂環式置換化アニオン又はカ
チオン性ポリサッカライドゲルを調製する方法であって、 イオン交換により、ポリサッカライドのものと反対の電荷の強力にイオン化可
能な官能基を含む疎水性リガンドを、前記ポリサッカライドの実質的な量の利用
できるイオン性部位が前記リガンドにより占有されて修飾された疎水性相成分を
形成するように結合させることを含む方法。 - 【請求項２】 前記カチオン性ポリサッカライドゲルが、共有結合したカチ
オンに荷電した官能基を含むアンヒドロガラクタン又はデキストラン種の中性ポ
リサッカライドであることを特徴とする請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】 前記カチオンに荷電した官能基が、第三級アミン及び第四級
アミンからなる群から選択されることを特徴とする請求項２に記載の方法。 - 【請求項４】 前記カチオン性ポリサッカライドゲルが、DEAE Sephadex A-
25TM, QAE Sephadex A-25 TM及びQ Sepharose TMからなる群から選択されること
を特徴とする請求項３に記載の方法。 - 【請求項５】 前記アニオン性ポリサッカライドゲルが、共有結合したアニ
オンに荷電した官能基を含むアンヒドロガラクタン又はデキストラン種の中性ポ
リサッカライドであることを特徴とする請求項１に記載の方法。 - 【請求項６】 前記アニオンに荷電した官能基が、アルキルスルホネート又
はアルケニルスルホネート及びアルキルホスホネート又はアルケニルホスホネー
トからなる群から選択されることを特徴とする請求項５に記載の方法。 - 【請求項７】 前記アニオン性ポリサッカライドゲルが、SP Sephadex C-25 TM 及びS Sepharose TMからなる群から選択されることを特徴とする請求項６に記
載の方法。 - 【請求項８】 前記疎水性リガンドが、アルキルスルホネート又はアルケニ
ルスルホネート及びアルキルスルフェート又はアルケニルスルフェート、アルキ
ルベンゼンスルホネート又はアルケニルベンゼンスルホネート；タウロコレート
及びタウロデオキシコレート、アルキルホスホネート又はアルケニルホスホネー
ト及びアルキルホスフェート又はアルケニルホスフェート、並びにモノ−及びジ
−アルキルホスファチジン酸又はモノ−及びジ−アルケニルホスファチジン酸か
らなる群から選択されるアニオン性界面活性剤であることを特徴とする請求項４
に記載の方法。 - 【請求項９】 前記アルキル又はアルケニル基が、約４〜約１８の炭素を含
むことを特徴とする請求項８に記載の方法。 - 【請求項１０】 前記アニオン性界面活性剤がドデシル硫酸ナトリウムであ
ることを特徴とする請求項８に記載の方法。 - 【請求項１１】 前記疎水性リガンドが、アルキルトリメチルアンモニウム
ハライド又はアルケニルトリメチルアンモニウムハライド、及び第四級アルキル
アンモニウムハライド又は第四級アルケニルアンモニウムハライド、第四級アル
キルピリジニウムハライド又は第四級アルケニルピリジニウムハライド、及びア
ルキルマグネシウムハライド又はアルケニルマグネシウムハライドからなる群か
ら選択されるカチオン性界面活性剤であることを特徴とする請求項７に記載の方
法。 - 【請求項１２】 前記アルキル基又はアルケニル基が、約４〜約１８の炭素
を含むことを特徴とする請求項１１に記載の方法。 - 【請求項１３】 前記カチオン性界面活性剤がヘキサデシルトリメチルアン
モニウムブロミドであることを特徴とする請求項１１に記載の方法。 - 【請求項１４】 エタノール水溶液で平衡化された前記カチオン性ポリサッ
カライドゲルを、水酸化物イオン等量で過剰な希釈塩基を用いて水酸化物に変換
し、そして次にイオン等量で過剰なアニオン性界面活性剤を用いてアニオン性界
面活性剤置換化型に変換することを特徴とする請求項１に記載の方法。 - 【請求項１５】 前記カチオン性ポリサッカライドゲルが、QAE Sephadex A
-25 TMであり、希釈塩基が５０％エタノール水溶液中０．５ＮのＮａＯＨであり
、前記アニオン性界面活性剤が、ドデシル硫酸ナトリウムであることを特徴とす
る請求項１４に記載の方法。 - 【請求項１６】 エタノール水溶液で平衡化された前記アニオン性ポリサッ
カライドゲルを、水素イオン等量で過剰な希釈酸を用いて水素型に変換し、そし
て次にイオン等量で過剰なカチオン性界面活性剤を用いてカチオン性界面活性剤
置換化型に変換することを特徴とする請求項１に記載の方法。 - 【請求項１７】 前記アニオン性ポリサッカライドゲルが、SP Sephadex C-
25TMであり、希釈酸が５０％エタノール水溶液中０．１ＮのＨＣｌであり、前記
カチオン性界面活性剤が、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミドである
ことを特徴とする請求項１６に記載の方法。 - 【請求項１８】 静電的に結合した脂肪族又は脂環式置換化アニオン又はカ
チオン性ポリサッカライドゲルであって、マクロポーラスイオン性ポリサッカラ
イドゲルマトリックスに静電的に結合したイオン性疎水性リガンドを、前記イオ
ン性ポリサッカライドゲルマトリックスの実質的な量の利用できるイオン性部位
が前記リガンドにより占有されて修飾された疎水性相成分を形成するように含み
、ここで前記リガンドが前記イオン性ポリサッカライドゲルマトリックスのもの
と反対の電荷の強力にイオン化可能な官能基を含むことを特徴とするポリサッカ
ライドゲル。 - 【請求項１９】 前記カチオン性ポリサッカライドゲルが、共有結合したカ
チオンに荷電した官能基を含むアンヒドロガラクタン又はデキストラン種の中性
ポリサッカライドであることを特徴とする請求項１８に記載のポリサッカライド
ゲル。 - 【請求項２０】 前記カチオンに荷電した官能基が、第三級アミン及び第四
級アミンからなる群から選択されることを特徴とする請求項１９に記載のポリサ
ッカライドゲル。 - 【請求項２１】 前記カチオン性ポリサッカライドゲルが、DEAE Sephadex
A-25TM, QAE Sephadex A-25 TM及びQ Sepharose TMからなる群から選択されるこ
とを特徴とする請求項２０に記載のポリサッカライドゲル。 - 【請求項２２】 前記アニオン性ポリサッカライドゲルが、共有結合したア
ニオンに荷電した官能基を含むアンヒドロガラクタン又はデキストラン種の中性
ポリサッカライドであることを特徴とする請求項１８に記載のポリサッカライド
ゲル。 - 【請求項２３】 前記アニオンに荷電した官能基が、アルキルスルホネート
又はアルケニルスルホネート及びアルキルホスホネート又はアルケニルホスホネ
ートからなる群から選択されることを特徴とする請求項２２に記載のポリサッカ
ライドゲル。 - 【請求項２４】 前記アニオン性ポリサッカライドゲルが、SP Sephadex C-
25TM及びS Sepharose TMからなる群から選択されることを特徴とする請求項２３
に記載のポリサッカライドゲル。 - 【請求項２５】 前記疎水性リガンドが、アルキルスルホネート又はアルケ
ニルスルホネート及びアルキルスルフェート又はアルケニルスルフェート、アル
キルベンゼンスルホネート又はアルケニルベンゼンスルホネート；タウロコレー
ト及びタウロデオキシコレート、アルキルホスホネート又はアルケニルホスホネ
ート及びアルキルホスフェート又はアルケニルホスフェート、並びにモノ−及び
ジ−アルキルホスファチジン酸又はモノ−及びジ−アルケニルホスファチジン酸
からなる群から選択されるアニオン性界面活性剤であることを特徴とする請求項
２１に記載のポリサッカライドゲル。 - 【請求項２６】 前記アルキル又はアルケニル基が、約４〜約１８の炭素を
含むことを特徴とする請求項２５に記載のポリサッカライドゲル。 - 【請求項２７】 前記アニオン性界面活性剤がドデシル硫酸ナトリウムであ
ることを特徴とする請求項２５に記載のポリサッカライドゲル。 - 【請求項２８】 前記疎水性リガンドが、アルキルトリメチルアンモニウム
ハライド又はアルケニルトリメチルアンモニウムハライド、及び第四級アルキル
アンモニウムハライド又は第四級アルケニルアンモニウムハライド、第四級アル
キルピリジニウムハライド又は第四級アルケニルピリジニウムハライド、及びア
ルキルマグネシウムハライド又はアルケニルマグネシウムハライドからなる群か
ら選択されるカチオン性界面活性剤であることを特徴とする請求項２４に記載の
ポリサッカライドゲル。 - 【請求項２９】 前記アルキル基又はアルケニル基が、約４〜約１８の炭素
を含むことを特徴とする請求項２８に記載のポリサッカライドゲル。 - 【請求項３０】 前記カチオン性界面活性剤がヘキサデシルトリメチルアン
モニウムブロミドであることを特徴とする請求項２８に記載のポリサッカライド
ゲル。 - 【請求項３１】 無極性エキスを単離する方法であって、 水性有機溶液中の前記無極性エキスを、静電的に結合した、脂肪族又は脂環式
置換化アニオン性又はカチオン性ポリサッカライドゲルの群から選択されるゲル
マトリックスに接触させ； 該ゲルマトリックスを前記水性有機溶媒溶液で洗い； 該ゲルマトリックスを更なる水性有機溶媒溶液で洗い、ここで該溶液中の有機
溶媒の割合が増加し；そして 流出物から前記エキスを回収すること を含む方法。 - 【請求項３２】 再使用のためにゲルマトリックスを再生することを更に含
む請求項３１に記載の方法。 - 【請求項３３】 前記無極性植物エキスが、ステロイド及びトリテルペノイ
ド、フラボノイド、フェノール系コンジュゲート、極性脂質、及びプロラミンか
らなる群から選択されることを特徴とする請求項３１に記載の方法。 - 【請求項３４】 前記ステロイド及びトリテルペノイドが、サポニン、強心
配糖体及びステリルコンジュゲートからなる群から選択されることを特徴とする
請求項３３に記載の方法。 - 【請求項３５】 前記フラボノイドが、フラボン、フラボノール、イソフラ
ボン及びそれらの全てのグリコシドからなる群から選択されることを特徴とする
請求項３３に記載の方法。 - 【請求項３６】 前記フェノール系コンジュゲートが、脂肪族アルコールエ
ステル及びアミドからなる群から選択されることを特徴とする請求項３３に記載
の方法。 - 【請求項３７】 前記極性脂質が、モノ−及びジ−グリセリド並びにそれら
の誘導体並びにアルキルレソルシノール又はアルケニルレソルシノールからなる
群から選択されることを特徴とする請求項３３に記載の方法。 - 【請求項３８】 前記プロラミンが、ゼイン、アベニン、ホルディン及びグ
リアジンからなる群から選択されることを特徴とする請求項３３に記載の方法。 - 【請求項３９】 前記無極性エキスが、合成又は天然のソースからのもので
あることを特徴とする請求項３３に記載の方法。 - 【請求項４０】 前記無極性エキスの天然のソースが、植物材料、藻類、真
菌及び単細胞生物からなる群から選択されることを特徴とする請求項３９に記載
の方法。 - 【請求項４１】 前記植物材料が、農業物、ブドウ栽培物、園芸物、水産養
殖物並びに陸地及び海洋にある自然の植物からなる群から選択されることを特徴
とする請求項４０に記載の方法。 - 【請求項４２】 前記農業植物材料が、コムギ、オート、ライムギ、コーン
、コメ、キノア、アマランス、ソバ、ライコムギもしくはオオムギ；又は脂肪種
子、例えばダイズ、カノーラ、亜麻仁、ヒマワリ、ベニバナもしくはマスタード
；又はマメ作物、例えばエンドウ、ヒラマメもしくはインゲンマメ；又は飼料作
物、例えばフェスキュー、ティモシー、クローバー、アルファルファもしくはホ
ウィートグラス；又はハーブ、例えばパセリ、ローズマリー、セージ、又はミン
トからなる群から選択されることを特徴とする請求項４１に記載の方法。 - 【請求項４３】 前記有機溶媒溶液が、低級アルコール、ケトン又はそれら
の組合せを含む溶液であることを特徴とする請求項３１に記載の方法。 - 【請求項４４】 前記低級アルコールが、メタノール、エタノール、プロパ
ノール及びイソプロパノールからなる群から選択されることを特徴とする請求項
４３に記載の方法。 - 【請求項４５】 前記ケトンがアセトンであることを特徴とする請求項４３
に記載の方法。 - 【請求項４６】 前記カチオン性ポリサッカライドゲルが、共有結合したカ
チオンに荷電した官能基を含むアンヒドロガラクタン又はデキストラン種の中性
ポリサッカライドであることを特徴とする請求項３１に記載の方法。 - 【請求項４７】 前記カチオンに荷電した官能基が、第三級アミン及び第四
級アミンからなる群から選択されることを特徴とする請求項４６に記載の方法。 - 【請求項４８】 前記カチオン性ポリサッカライドゲルが、DEAE Sephadex
A-25TM, QAE Sephadex A-25 TM及びQ Sepharose TMからなる群から選択されるこ
とを特徴とする請求項３１に記載の方法。 - 【請求項４９】 前記アニオン性ポリサッカライドゲルが、共有結合したア
ニオンに荷電した官能基を含むアンヒドロガラクタン又はデキストラン種の中性
ポリサッカライドであることを特徴とする請求項３１に記載の方法。 - 【請求項５０】 前記アニオンに荷電した官能基が、アルキルスルホネート
又はアルケニルスルホネート及びアルキルホスホネート又はアルケニルホスホネ
ートからなる群から選択されることを特徴とする請求項４９に記載の方法。 - 【請求項５１】 前記アニオン性ポリサッカライドゲルが、SP Sephadex C-
25TM及びS Sepharose TMからなる群から選択されることを特徴とする請求項３１
に記載の方法。 - 【請求項５２】 前記疎水性リガンドが、アルキルスルホネート又はアルケ
ニルスルホネート及びアルキルスルフェート又はアルケニルスルフェート、アル
キルベンゼンスルホネート又はアルケニルベンゼンスルホネート；タウロコレー
ト及びタウロデオキシコレート、アルキルホスホネート又はアルケニルホスホネ
ート及びアルキルホスフェート又はアルケニルホスフェート、並びにモノ−及び
ジ−アルキルホスファチジン酸又はモノ−及びジ−アルケニルホスファチジン酸
からなる群から選択されるアニオン性界面活性剤であることを特徴とする請求項
３１に記載の方法。 - 【請求項５３】 前記アルキル又はアルケニル基が、約４〜約１８の炭素を
含むことを特徴とする請求項５２に記載の方法。 - 【請求項５４】 前記アニオン性界面活性剤がドデシル硫酸ナトリウムであ
ることを特徴とする請求項５２に記載の方法。 - 【請求項５５】 前記疎水性リガンドが、アルキルトリメチルアンモニウム
ハライド又はアルケニルトリメチルアンモニウムハライド、及び第四級アルキル
アンモニウムハライド又は第四級アルケニルアンモニウムハライド、第四級アル
キルピリジニウムハライド又は第四級アルケニルピリジニウムハライド、及びア
ルキルマグネシウムハライド又はアルケニルマグネシウムハライドからなる群か
ら選択されるカチオン性界面活性剤であることを特徴とする請求項３１に記載の
方法。 - 【請求項５６】 前記アルキル基又はアルケニル基が、約４〜約１８の炭素
を含むことを特徴とする請求項５５に記載の方法。 - 【請求項５７】 前記カチオン性界面活性剤がヘキサデシルトリメチルアン
モニウムブロミドであることを特徴とする請求項５５に記載の方法。
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