DE2309899A1 - Verfahren zum abtrennen von cephalosporin c aus waessrigen loesungen - Google Patents

Description

D R.-I N G. V O ij KREISLE R D R.-1 N G. SCHÖN VVA LΠ

DR.-IK¹G. YH. MEYER DR. FUES DIPL-CiIf./.. ALFK VON KREfSLCR DiPL-CHEM. CAPOLA KELLER DR.-ING. KLÖPSCH DIPL-ING. SELTING

KÖLN 1, DEICHMANNHAUS

Köln, den 2γ .2. Kl/Ax

Takcda Chemieal Tndustries, Ltd., 27, PoshoreachJ 2-chome, Hi^asln -ku, Osaka (Japan).

Verfahren_zurn Abtrennen von Cephalosporin^ aus

wäßrigen Lösungen

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Abtrennung von Cephalosporin C aus rohen wässrigen Lösungen, die Cephalosporin C enthaltene

Für die Abtrennung von Cephalosporin C von Kulturfiltraten von Mikroorganismen, die Cephalosporin C bilden (z.B. Cephalosporium), wurde bereits ein chromatograpbisches Verfahren vorgeschlagen, bei dem Anionenaustauscherharze verwendet werden. Dieses Verfahren hat jedoch den Nachteil, daß das Cephalosporin C nicht genügend weitgehend von den zwangsläufig in den Kulturfiltraten enthaltenen Verunreinigungen (z.B. Cephalosporin N, Pigmenten und Salzen) abgetrennt werden kann, und daß das Verfahren nicht nur eine äußerst große Menge eines komplizierten Elutionsmittels (einer Pufferlösung, die ein tertiäres Amin zusammen mit Schwefelsäure oder Oxalsäure enthält), sondern auch eine sehr umständliche Regenerierung für die V/ieilerverwondung der Aniononauijtauscherharze erfordert. Die Entwicklung eines von den vorstehend genannten Nachteilen freien, großtechnisch durchführbaren Chromatographieverfahrens für die Abtrennung von Cephalosporin C ist daher seit langen erwünscht„

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Es wurde nv.n überraschenderweise ^eiuaden, daß Cephalosporin C im wesentlichen ohne Abbau von Cephalosporin N, Pigmenten und Salzen, die in den Rnlturfiltraton der Cephalosporin bildenden Mikroorganismen enthalten sind, durch eine bestimmte Aufeinanderfolge bestimmter Veri'ahrensstufen abgetrennt werden kann, nämlich durch Behandlung des Kulturfiltrats mit Aktivkohle, wodurch das Cephalosporin C an der Aktivkohle adsorbiert wird, und fraktionierte Elution der Aktivkohle, die das Cephalosporin C adsorbiert hat, mit einem alkalischen Gemisch vor. Wasser und einem organischen Lösungsmittel« Berücksichtigt man, daß Cephalosporin C unter alkalischen Bedingungen bekanntlich sehr instabil ist, so ist die Tatsache, dai'3 Cephalosporin C ohne Abbau aus der Aktivkohle, an der Cephalosporin C adsorbiert worden ist, mit einem alkalischen Gemisch von Wasser und einem organischen Lösungsmittel fraktioniert eluiert werden kann, sehr überraschend, dies um so mehr, als selbst bei Verwendung eines neutralen oder sauren Gemisches von Wasser mit einem organischen Lösungsmittel als Elutionsmittel oder bei Verwendung, von Wasser, das alkalisch gemacht worden ist, das Cephalosporin C von den Verunreinigungen, insbesondere von den Pigmenten, nicht abgetrennt v/erden kann.

Gegenstand der Erfindung, der die vorstehenden Peststellungen zu Grunde liegen, ist demgemäß die Abtrennung von Cephalosporin C aus rohen wässrigen Lösungen, die Cephalosporin C enthalten, z.B. aus Kulturfiltraten von Cephalosporin C bildenden Mikroorganismen, nach einem neuen, großtechnisch durchführbaren Verfahren, bei dem Cephalosporin C mit hohem Wirkungsgrad von den Verunreinigungen einschließlich der Pigmente und Salze unter \^rerwendung einer geringen Menge; des Elutionsmittcla abgetrennt werden kann, und bei dem das Adsorptionsmittel nahezu beliebig oft wiederverwendet werden kann, ohne daß es einer besonderen Regenerierung unterworfen v.'ird.

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Beim Verfahren gemäß der Erfindung wird eine wässrige Lösung, die Cephalosporin C enthält, mit Aktivkohle behandelt, wobei das Cephalosporin C an eier Aktivkohle adsorbiert wird. Als Beispiele roher wässriger Lösungen, die Cephalsoporin C enthalten, sind Kulturmedien von Cephalosporin C bildenden Mikroorganismen und ihre flüssigen verarbeiteten Materialien, z.B. KuI turi'iltrate, Waschflüssigkeiten, Konzentrate und Flüssigkeiten, die bei deren p_H-Einstellung erhältlich sind, au nennen. Zweckmäßig werden diese Lösungen vor der Behandlung mit der Aktivkohle beispielsweise mit verdünnter Schwefelsäure auf einen p„-Wert von etwa 4,5 bis 6,0, insbesondere etwa 5 bis 6, eingestellt.

Als Aktivkohlen eignen sich beispielsweise die Produkte, die durch Carbonisierung und anschließende Aktivierung mit Wasserdampf oder chemische Aktivierung (z.B. mit Zinkchlorid) von Sägemehl, Kokosnußschalen, Steinkohle u.dgl. hergestellt werden können» Eesonders vorteilhaft sind Aktivkohlen, die mit Zinkchlorid aktiviert worden sind,, Diese Aktivkohlen können in körniger Form oder Pulverform verwendet werden. Vorteilhaft ist die Verwendung von Aktivkohlen, die eine Korngröße von etwa 0,3 bis 2 mm

2 und eine Oberfläche von etwa J50G bis 2000 m"/gj insbesondere von etwa 600 bis 1500 m /g, haben.

Die Adsorption von Cephalosporin C an der Aktivkohle kann nach beliebigen Verfahren einschließlich der Chargenbehandlung erfolgen. Zur Erzielung einer ausreichenden Abtrennung durch die anschließende Elution ist es vorteilhaft, die das Cephalosporin C enthaltende rohe wässrige Lösung von oben nach unten durch die Aktivkohlesäule zu leiten. Hierbei ist die^optimale Rnumotrömungsgeschwindigkeit (Vol.-Einheiten der durchzuleitenden rohen wässrigen Lösung pro Volumeneinheit Aktivkohle pro Stunde) verschieden in Abhängigkeit von Faktoren wie der Konzentration von Cephalosporin C in der rohen wässrigen Lösung und der

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Länge der Aktivkohlesäule. Die vorteilhafteste Raumströmungsgeschwindigkeit, die im wesentlichen vollständige Adsorption von Cephalosporin C an der Aktivkohle ermöglicht, liegt bei etwa 0,1 bis 2,0, insbesondere bei etwa 0,5 bis 2,0 V/V/Stdo

Wenn die rohe wässrige Lösung chargenweise mit der Aktivkohle zusammengeführt wird, z.B. durch Mischen der Lösung mit der Aktivkohle, wird die das Cephalosporin C adsorbierende Aktivkohle vor der anschließenden Elution in eine Kolonne gefüllt.

Durch die vorstehend be-schriebene Behandlung der das Cephalosporin C enthaltenden rohen wässrigen Lösung mit Aktivkohle wird im wesentlichen die gesamte Menge an Cephalosporin C, die in der Lösung enthalten ist, an der Aktivkohle adsorbiert. Gleichzeitig werden von den in der Lösung enthaltenen Verunreinigungen das Cephalosporin K und die Pigmente ebenfalls an der Aktivkohle adsorbierte Diese Adsorption kann fortgesetzt werden, bis die Aktivkohle mit der adsorbierten Menge an Cephalosporin C gesättigt ist, d.h. ihr Adsorptionsverrnögen für Cephalosporin C gefallen ist. Es ist vorteilhaft, die Aktivkohle, die genügend Cephalosporin C adsorbiert hat, vor der anschließenden Elution mit Wasser zu waschen.

Gemäß der Erfindung werden Cephalosporin C und andere an der Aktivkohle adsorbierte gelöste Stoffe mit einem alkalischen Gemisch von Wasser und einem organischen Lösungsmittel von der Aktivkohle eluiert. Als organische Losungsmittel eignen sich hydrophile organische Lösungsmittel, z.B. niedere Alkohole (z.B. Methanol, Äthanol, Propanol, Isopropanol, Butanol und Isobutanol), insbesondere solche mit bib au 5 C-Atomen, niedex'e Ketone (z„B. Aceton und Methylethylketon), insbesondere solche mit bis zu 4 C-Atomen, niedere Alkylester von niederen Fettsäuren (z.B. Methylacetat, Äthylacetat und Methylpropionat), insbeson-

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dere solche rait bis zu 7 C-Atomen, cyclische Äther (ζ.Ή=, Dioxan und Tetrahydrofuran) und Gemische dieser Lösungsmittel. Daa Mengenverhältnis von Wasser und organischem Lösungsmittel im Gemisch wird in Abhängigkeit von Faktoren wie der Art der organischen Lösungsmittel gewählt. Im allgemeinen liegt das optimale VolumenverhäXtnis von Wasser zu organischem Lösungsmittel bei etwa I5i1 bis 1:3, insbesondere etwa 15:1 bis 1:1. Das Gemisch des V/assers mit dem organischen Lösungsmittel wird vor der Verwendung alkalisch gemacht. Die Einstellung des Gemisches auf eine geeignete Alkalität erfolgt zweckmäßig mit einer Base, z.B. Alkali- und Erdalkalihydroxyden (z.B. Natriumhydroxyd, Kaliumhydroxyd, Calciumhydroxyd und Magnesiumhydroxyd), Ammoniak oder mit organischen Aminen, z.B. Trimethylamine Die optimale Alkalinität ändert sich etwas mit Faktoren wie der Art der organischen Lösungsmittel, jedoch liegt der p^-Wert im allgemeinen im Bereich von etwa 7,5 bis 13,0, insbesondere im Bereich von etwa 9,5 bis 12,0.

Das alkalische Gemisch wird zweckmäßig von oben nach unten durch die Säule der Aktivkohle, die das Cephalosporin C adsorbiert hat, geleitet. Das Eluat wird in bestimmten Fraktionen aufgefangen, so daß das Cephalosporin C in andere Fraktionen als die übrigen adsorbierten gelösten Stoffe einschließlich Cephalosporin N und der Pigmente eluiert wird. Die optimale Raumströmungsgeschwindigkeit (Volumeneinheiten des durchzuleitenden alkalischen Gemisches pro Volumeneinheit Aktivkohle pro Stunde) bei dieser fraktionierten Elution ändert sich mit Faktoren wie der an der Aktivkohle adsorbierten Menge an Cephalosporin C, der Art der verwendeten organischen Lösungsmittel und der Länge der Aktivkohlesäule. Die vorteilhafteste Raumströmungsgeschwindigkeit liegt zwischen etwa 0,1 und 2,0, insbesondere etwa 0,3 und 0,8 V/V/Std.

Die das Cephalosporin C enthaltenden Fraktionen können aufgefangen werden, indem beispielsweise die Cephalosporin-C-

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Aktivität oder die optische Dichte der jeweiligen Fraktionen bei 260 nju überwacht wird. Die hierbei erhaltenen Cephalosporin-C-Fraktionen enthalten das von Cephalosporin N, Pigmenten, Salzen und anderen Verunreinigungen abgetrennte Cephalosporin C in hoher Konzentration. Das Cephalosporin C kann aus den Fraktionen, die es enthalten, nach an sich bekannten Verfahren isoliert werden, z.B. durch Einengung der Fraktionen, wobei das Cephalosporin C beispielsweise als entsprechendes Alkalisalz auskristallisiert, worauf das Salz von der Mutterlauge abgetrennt und getrocknet werden kann. Das Verfahren gemäß der Erfindung kann auch in Verbindung mit verschiedenen anderen Reinigungsverfahren durchgeführt werden. Eine der vorteilhaften Kombinationen besteht darin, daß man die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltenen, das Cephalosporin C enthaltenden Fraktionen einer Acylierungsreaktion unterwirft und dann das erhaltene fettlösliche acylierte Derivat vom Reaktionsgemisch abtrennt.

Durch die beschriebene Elution der Aktivkohle mit dem alkalischen Gemisch von Wasser und organischem Lösungsmittel werden Cephalosporin C und andere an der Kohle adsorbierte gelöste Stoffe in das Elutionsmlttel desorbiert, und die Aktivkohle wird regeneriert. Die regenerierte Aktivkohle kann in fast unendlicher Wiederholung für die Zyklen aus Adsorption und Elution verwendet werden.

Die in den folgenden Beispielen genannten Oberflächenwerte wurden nach der Methode von Brunauer, Emett und Teller (BET-Methode) ermittelt, die z.B. in "J.A.C.S." 60 (I938) 309 beschrieben wird. Die Titer von Cephalosporin C und Cephalosporin N wurden nach der Biotestmethode gemessen, die z.B. in "Antimicrobial Agents and Chemotherapy" (1962), 682, beschrieben wird. Die Prozentsätze beziehen sich auf das Volumen, falls nicht anders angegeben.

Beispiel 1

Ein Cephalosporin bildender Mikroorganismus der Gattung Cephalosporium (Cephalosporium acremonium ATCC-1^553, aufgeführt in "The American Type Culture Collection, Catalogue of Strains, 9. Auflage,I970") wurde 7 Tage im

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Schrägröbrchen auf Kartoffel-Doxtrose-Aearnährboden kultiviert, wobei gutes Wachstum erzielt wurde. In einen 2 1-Kolben wurden 5CO ml eines Mediums (p^ 6,8) gegeben, dan 1,5% Fleischextrakt, 0,5$ Maisquellwasuer, 3,0$ Saccharose und 0,15$ Calciumcarbonat enthielt. Anschließend wurde im Autoklaven sterilisierte Der Kolben wurde mit Sporen aus der erhaltenen Schrägkultur beimpft und 3 Tage unter Schütteln bei 28⁰G bebrütet.

In einen Permentationsbehälter aus nichtrostendem Stahl wurden 25 1 eines Mediums gefüllt, das 3,0$ rohes Sojabohnenmehl, 10$ Saccharose, 1$ DL-Metbionin, 0,15$ Calciumchlorid, 3,0$ Baumwollsaatmehl und 0,05$ Sojabohnenöl enthielt. Nach Sterilisation unter hohem Druck und Abkühlung wurde der Behälter aseptisch mit der vorstehend genannten Vorkultur beimpft und bei 24 C unter Belüftung und Rühren (100$ Belüftung pro Minute, 280 UpM) bebrütet.

Nach einer Kultivierungszeit von 140 Stunden wurde das Kulturmedium (25 1) aus dem Behälter genommen und mit verdünnter Schwefelsäure auf p„ 5,0 eingestellt. Dann wurden 0,5 kg des Filterhilfsmittels "Hyflo Super CeI" (Johns & Manville Co., USA) zugesetzt, worauf die Zellen mit einer Filterpresse, die mit 0,25 kg des Filterhilfsmittels vorfrescbichtet war, abgetrennt wurden. Das hierbei erhaltene klare rötlichbraune Filtrat enthielt pro ml 2000 Cephalosporin C und 1000 >ug Cephalosporin N.

2000 ml des Kulturfiltrats wurden durch eine Säule (61 cm Höhe, 3,7 cm Durchmesser), die mit 550 ml chromatographischer Aktivkohle gefüllt war, die eine Korngröße vor etwa 0,42 mm und eine Oberfläche von 1460 m /g hatte, mit einer Raumströmungsgeschwindigkeit von 0,9 V/V/Stdo geleitet. Die Säule wurde mit 1000 ml reinem V/asser gewaschen. Der Ablauf wurde mit der Waschflüssigkeit vereinigt. Die Gesamtlösung wurde der Dünnschichtchromato-graphie an mikrokristalliner Cellulose unter Verwendung eines aus n-Butanol, Eisessig und Wasser (Vclumenverhält-

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ηΐ3 3:1:1) bestehenden Lösungsmittelsystems unterworfen» Das Chromatogramm zeigte einen Flecken bei Rf 0,3 für Cephalosporin N und einige andere Flecken, die von dem Flecken, der dern Cephalosporin C zuzuschreiben war, zu unterscheiden waren und positive Ninhydrin- und Jodreaktionen zeigten»

Die Säule wurde mit einem Lösungsmittelgemisch (p^ 12,0) von 2000 ml einer ifoigen wässrigen n-Butanollösung und 200 ml einer wässrigen 0,IN-Natriumhydroxydlösung bei einer Raumströmungsgeschwindigkeit von 0,45 V/V/Std» eluiert. Das Eluat wurde in Fraktionen von je 50 ml aufgefangen. Die Mengen an Cephalosporin C in diesen Fraktionen wurden durch Ablesen der optischen Dichten (Extinktionen) jeder Fraktion bei 260 mu für Cephalosporin C und bei 420 mu für Pigmente am Beckmann-Spektrophotometer überwacht.

Die optische Dichte bei 260 mu stieg beginnend mit der Fraktion 15 steil an, erreichte eine Spitze bei der Fraktion 20 und fiel dann, bis sie bei der Fraktion 30 fast bei 0 war. Die Extinktion der Fraktion 20 betrug 320 und der Titer von Cephalosporin C in der gleichen Fraktion

Die optische Dichte bei 420 mu begann bei der Fraktion steil zu steigen, erreichte einen Spitzenwert bei der Fraktion 27 und fiel dann bei der Fraktion 30 bis fast auf 0. Die optischen Dichten der Fraktion 27 betrug 1,2 bei 420 im und 100 bei 260 mu. Der Titer von Cephalosporin C in dieser Fraktion betrug 2500 ug/n;l.

Die Fraktionen 10 bis 18 wurden zusammengegossen und der Dünnschichtchromatographie an mikrokristalliner Cellulose in einem Lösungsmittelsystem aus n-£utanol, Eisessig und Wasser (Volumenverhältnis 3:1:1) unterworfen. Das Chrornatograram zeigte den Flecken, der Cephalosporin J zuzuordnen ist, und einige weitere Flecken, die positive I\i.in~

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hydrin- und Jodtests zeigten. Im wesentlichen kein Flecken konnte bei Rf 2,0 entsprechend Cephalosporin C festgestellt werden.

Die blaßgelben Fraktionen 19 bis 26, die überwiegend Cepalosporin C enthielten, wurden zusammengegossen, mit 1N-Natriunihydroxyd auf p_H 6,5 eingestellt und bei einer Außentemperatur von nicht mehr als 3O°C eingeengt. Die gebildeten Kristalle des Natriumsalzes von Cephalosporin C wurden abfiltriert und getrocknet, wobei 960 mg im wesentlichen farbloser Kristalle als erste Ausbeute erhalten wurden.

Die Wiederholung der vorstehend beschriebenen Behandlung ergab weitere Ausbeuten von Kristallen aus den Mutterlaugen. Die Gesamtausbeute betrug 2,21 g. Ein Biotest

19& im Vergleich zu einer authentischen Probe Ci₁^- = 190) des Natriumsalzes von Cephalosporin C zeigte, daß der Gehalt an Cephalosporin C-Natrium in den vorstehend genannten Kristallen 90,6 Gew.-^ betrug. Die Aktivitätsausbeute von Cephalosporin C aus dem Kulturfiltrat betrug etwa 50/£. Das Dünnschichtchromatogramm des Produkts an mikrokristalliner Cellulose in einem Lösungsmittelsystem aus n-Butanol, Eisessig und Wasser (3:1:1) zeigte einen Flecken bei Rf 0,2 für Cephalosporin C und eine Spur eines Fleckens bei Rf 0,3« Zur Gewinnung von reinem Cephalosporin C wurde das vorstehende Produkt aus 10 ml eines Gemisches von Wasser und Äthanol (Voluraenverhältnis 1:1) umkristallisiert. Die Ausbeute nach der Umkristallisation betrug 1,68 £. Das Dünnschichtchromatogramm und die Ultraviolett- und Infrarotspektren dieses Produkts stimmten mit der authentischen Probe vollständig überein.

Beispiel 2

Unter den in Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen wurden 2000 ml des auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise erhaltenen Kulturfiltrats durch eine Aktivkohlesäule geleitet. Die Säule wurde mit Wasser gewaschen und dann mit

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einem Löaungsmittelgemisch (_p 11,5) aus 2000 ml einer 7?oigen wässrigen Lösung von n-Butanol und 100 ml einer wässrigen 0,IN-Kaliumhydroxydlösung bei einer Raumströmungsgeschwindigkeit von 0,5 V/V/Std. eluiert. Das Eluat wurde in Fraktionen von je 50 ml aufgefangen. Jede Fraktion wurde nach den in Beispiel 1 beschriebenen Methoden analysiert.

Der Verlauf der optischen Dichte der Fraktionen bei 260 mn und 420 mu war im wesentlichen identisch mit dem in Beispiel 1 genannten Verlauf. Das Dünnschichtchromatogramm jeder Fraktion wurde den Ninhydrin- und Jodtests unterworfen. Die blaßgelben Fraktionen 27 bis 36, die überwiegend Cephalosporin C enthielten, wurden vereinigt« Die Lösung wurde zur Entfernung des Kaliumions mit einer Rauraströmungsgeschwindigkeit von 1,0 V/V/Std. von oben nach unten durch eine Säule (40 χ 2,5 cm) geleitet, die mit 200 ml eines stark sauren Kationenaustauscherharzes (freie Form, z.B. Amberlite IR-120, Hersteller Rohm and Haas Co., USA) gefüllt war. Der Ablauf (einschließlich der Waschflüs3igkeiten) wurde mit 1N-Natriumhydroxyd auf p„ 6,5 eingestellt und bei einer Außentemperatur von nicht mehr als 30 C eingeengt. Die hierbei gebildeten Kristalle des Natriurasalzes von Cephalosporin C wurden abfiltriert und getrocknet, wobei 1000 mg im wesentlichen farbloser Kristalle als erste Ausbeute erhalten wurden. Weitere Ausbeuten an Kristallen wurden aus den Mutterlaugen gewonnen. Die Gesamtausbeute betrug 2,26 g„ Die Analyse gegen eine authentische Probe (£ A =190) von Cephalosporin-0-Natrium ergab, daß die Kristalle 92 Gew.-/j Cephalosporin-C-Natrium enthielten» Die Ausbeute an Cephalosporin C-Aktivität aus dem Kulturfiltrat betrug 52$. Dieses Produkt wurde aus 2 ml V/asser umkristallisiert, wobei 1,6 g reines Produkt erhalten wurden. Dieses Produkt stimmte im Dünnschichtchromato»ramm und in den Ultraviolett- und Infrarotspektren mit der authentischen Probe vollständig übeiein.

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Beispiel 3

Unter den in Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen wurden 2000 ml des auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise erhaltenen Kulturfiltrata durch eine Aktivkohlesäule geleitet, die dann mit Wasser gewaschen wurde» Die Kolonne wurde dann mit einem Lösungsmittelgemisch (p^ 10,6) aus 2000 ml einer 7#igen wässrigen n-Butanollösung und 200 ml wässrigem 0,IN-Ammoniak bei einer Raumströmungsgeschwindigkeit von 0,45 V/V/Std. eluiert. Das Eluat wurde in Fraktionen von je 50 ml aufgefangen. Diese Fraktionen wurden nach den in Beispiel 1 beschriebenen Methoden analysiert. Die blaßgelben Fraktionen 23 bis 32, die überwiegend Cephalosporin C enthielten, wurden vereinigt. Das Ammoniak wurde bei niedriger Temperatur von nicht mehr als 30⁰C abgedampft und dann chargenweise durch Zugabe von 200 ml eines stark sauren Kationenaustauscherharzes (freie Form, z.B. Amberlite IR-120, Hersteller Rohm and Haas Co., USA) entfernt, worauf mit 400 ml Wasser gewaschen wurde. Das Filtrat und das Waschwasser wurden zusammengegossen, mit 1N-Natriumhydroxyd auf p._T 6,5 eingestellt und bei einer Außentemperatur von nicht mehr als 30 C eingeengt. Die hierbei gebildeton Kristalle von Cephalosporin C-Natrium wurden abfiltriert und getrocknet, wobei 800 mg im wesentlichen farblose Kristalle als erste Ausbeute erhalten wurden. Durch wiederholte Kristallisation aus der Mutterlauge wurden insgesamt 2,22 g erhalten. Ein Biotest gegen eine authentische Probe

1 tf (t _Λ° - 190) von Cephalosporin C-Natrium ergab, daß das Produkt SO Gew„-$ Cephalosporin C-Natrium enthielt., Die Aktivitätsausbeute aus dern Kulturfiltrat betrug 50^C. Das Produkt wurde weiter aus 1,1 ml Wasser umkristallisiert, wobei i,5 g reines Produkt erhalten wurden. Dieses reine Produkt stimmte im Dünnschicbtchrornotogramm und in den Ultraviolett- und Infrarotspektren mit der authentischen Probe völlig überein.

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Beispiel 4

150 ml Kulturfiltrat, das auf die in Beispiel 1 "beschriebene Weise erhalten worden war, wurden mit einer Raumströmungsgeschwindigkeit von 1,0 V/V/Std. durch eine Säule (30 cm Höhe, 2 cm Durchmesser) geleitet, die mit 50 ml chromatographischer Aktivkohle gefüllt war, die eine Korngröße von etwa 0,42 mm und eine Oberfläche von

1500 m /g hatte ο Die Kolonne wurde mit 250 ml V/asser gewaschen und dann mit einem Lösungsmittelgemisch (p_H 12,0) aus 1000 ml einer 7?£igen wässrigen Äthylacetatlösung und 100 ml einer wässrigen 0,IN-Natriumhydroxydlösung bei einer Raumströmungsgeschwindigkeit von 0,5 V/V/Std. eluiert. Das Eluat wurde in Fraktionen von je 50 ml aufgefangen. Diese Fraktionen wurden den in Beispiel 1 beschriebenen Analysen unterworfen»

Die optische Dichte bei 260 mu stieg beginnend mit der Fraktion 10 steil an, erreichte einen Spitzenwert bei der Fraktion 12 und fiel dann, bis sie bei der Fraktion 20 fast 0 erreicht hatte. Die optische Dichte bei 420 mu stieg beginnend mit der Fraktion 14 allmählich an und erreichte bei der Fraktion 17 einen Spitzenwert, worauf sie fiel, bis sie bei der Fraktion 25 nahezu 0 erreicht hatte.

Die blaßgelben Fraktionen 10 bis 16, die überwiegend Cephalosporin C enthielten, wurden zusammengegossen, mit 1N-Natriumhydroxyd auf Ρττ 6,5 eingestellt und bei einer Außentemperatur von nicht mehr als 3O⁰C eingeengt. Die erhaltenen Kristalle des Natriumsalzes von Cephalosporin C wurden abfiltriert und getrocknet, wobei 100 Eg im wesentlichen farblose Kristalle als erste Ausbeute erhalten wurden.

Weitere Kristallisationen aus der Mutterlauge ergaben insgesamt 170 mg Kristalle. Ein Eiotest gegen eine authentische Probe (£ ₁ ^_m = 190) von Cephalosporin C--:-;atrium er-

I C Hi ""

gab, daß das Produkt 91 Qovi_a-^C/_O Cephalosporin C-IIu :riurn

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enthielt. Die Ausbeute an Cephalosporin C-Aktivität aus
dem Kulturfiltrat betrug 51,654. Die Umkristallisation aus 0,2 ml V/asser ergab 120 rag reines Produkt. Dieses Produkt stimmte in den physikalischen und chemischen Eigenschaften mit der authentischen Probe völlig überein.

Beispiel 5

Unter den in Beispiel 4 genannten Bedingungen wurden
150 ml des Kulturfiltrats, das auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise erhalten worden war, durch eine Aktivkohlesäule geleitet, die dann mit 250 ml Wasser gewaschen wurde. Die Säule wurde dann mit einem Lösungsmittelgemisch (p„ 11,9) von 200 ml einer 5O^igen wässrigen Dioxanlösung und 20 ml einer wässrigen 0,IN-Natriumhydroxydlösung bei einer Raumströmungsgeschwindigkeit von 0,5
V/V/Std. eluiert. Das Eluat wurde in Fraktionen von je
10 ml aufgefangen. Die Analysenwerte dieser Fraktionen
wurden nach den in Beispiel 1 beschriebenen Methoden verfolgt. Die optische Dichte bei 260 mu zeigte beginnend
mit der Fraktion 5 einen steilen Anstieg, erreichte bei
der Fraktion 7 einen Spitzenwert und fiel dann, bis sie
bei der Fraktion 10 nahezu 0 erreicht hatte. Die optische Dichte bei 420 rau stieg beginnend mit der Fraktion 7 allmählich und erreichte bei der Fraktion 10 einen Spitzenwert, worauf sie fiel, bis sie bei der Fraktion 15 fast 0 erreicht hatte.

Die blaßgelben Fraktionen 5 bis 9, die überwiegend Cephalosporin C enthielten, wurden vereinigt, mit 1N-Natriumhydroxyd auf p_H 6,5 eingestellt und bei einer Außentemperatur von nicht mehr als 30⁰C eingeengt. Die hierbei gebildeten Kristalle des Natriumsalzes von Cephalosporin C
wurden abfiltriert und getrocknet, wobei 80 rag im wesentlichen farblose Kristalle als erste Ausbeute erhalten
wurden. Durch wiederholte Kristallisation aus der Mutterlauge wurden insgesamt 168 mg erhalten. Ein Biotest gegen eine authentische Probe (E₁^₁ = 19o) des Natriumsalzes von

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Cephalosporin C ergab, daß dieses Produkt eine Reinheit von 90 GeWo-# hatte. Die Ausbeute an Cephalosporin C-Aktivität aus dem Kulturfiltrat betrug 50,5$. Durch Umkristallisation aus 0,5 ml eines Gemisches von Wasser und Äthanol (Volumenverhältnis 1:1) wurden 110 mg reines Produkt erhalten. Dieses Produkt stimmte im Dünnschichtchromatogramm, in der optischen Drehung und in den Ultraviolett- und Infrarotspektren mit einer authentischen Probe des Natriumsalzes von Cephalosporin C völlig überein,

Beispiel 6

Unter den in Beispiel 4 beschriebenen Bedingungen wurden 150 ml des Kulturfiltrats, das auf die in Beispiel 1 beschriebene V/eise erhalten worden war, durch eine Aktivkohlesäule geleitet, die dann mit 250 ml V/asser gewaschen wurde. Die Säule wurde dann mit einem Lösungsmittelgemisch (p„ 12,1) von 200 ml einer 50$igen wässrigen Acetonlösung und 20 ml einer wässrigen 0,IN-Natriumhydroxydlöaung bei einer Rauraströmungsgeschwindigkeit von 0,5 V/V/Std. eluiert. Das Eluat wurde in Fraktionen von je 10 ml aufgefangen. Die Analysenwerte dieser Fraktionen wurden durch die in Beispiel 1 beschriebene Dünnschichtchromatographie verfolgt.

Die blaßgelben Fraktionen 5 bis 9, die überwiegend Cephalosporin C enthielten, wurden vereinigt, mit 1N-Natriuinhydroxyd auf p„ 6,5 eingestellt und bei einer äußeren Temperatur von nicht mehr als 30 C eingeengt. Die hierbei gebildeten Kristalle des Natriumsalzes von Cephalosporin C wurden abfiltriert und getrocknet, wobei 75mg im wesentlichen farblose Kristalle als erste Ausbeute erhalten wurden. Durch wiederholte Kristallisation aus der Mutterlauge wurden insgesamt 162 mg erhalten. Ein Biotest gegen eine authentische Probe (£₁ ^/__ = 190) des Natriumsalzes von Cephalosporin C ergab, daß dieses Produkt eine Reinheit von 92 Gew„-$ hatte. Die Ausbeute an Cephalosporin C-Aktivität au3 dem Kulturfiltrat betrug 49$. Durch Urakri-

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stallisation aus 0,5 ml eines Gemisches von Wasser und Äthanol (Volumenverhältnis 1:1) v/urden 105 mg reines Produkt erhaltene Dieses Produkt stimmte im Dünnschichtchromatogramm, in der optischen Drehung und in den Ultraviolett- und Infrarotspektren mit einer authentischen Probe von Cephalosporin C völlig überein.

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Claims (9)

1. Patentansprüche

   Verfahren zur Abtrennung von Cephalosporin C aus rohen wässrigen Lösungen, die Cephalosporin C enthalten, dadurch gekennzeichnet, daß man die das Cephalosporin C enthaltende rohe wässrige Lösung mit Aktivkohle zusammenführt und hierdurch das Cephalosporin C an der Aktivkohle adsorbiert und die Aktivkohle der fraktionierten Elution mit einem alkalischen Gemisch von Wasser mit einem organischen Lösungsmittel unterwirft und hierbei die Traktionen, die Cephalosporin C enthalten, auffängt.
2. 2) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß alkalische Gemische von Wasser und einem organischen Lösungsmittel verwendet werden, die einen p„-Wert von etwa 7,5 bis 13,0, vorzugsweise von etwa 9,5 bis 12,0 haben.
3. 3) Verfahren nach Ansprüchen 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß alkalische Gemische von Wasser mit einem organischen Lösungsmittel im Volumenverhältnis von etwa 15!1 bis 1:3 verwendet werden.
4. 4) Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß als organische Lösungsmittel niedere Alkohole, niedere Ketone, niedere Alkylester von niederen Fettsäuren oder cyclische Äther verwendet werden.
5. 5) Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man als rohe wässrige Lösungen, von denen Cephalosporin C abgetrennt wird, Kulturmedien eines Cephalosporin C bildenden Mikroorganismus oder deren flüssige verarbeitete Materialien verwendet«
6. 6) Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man die rohen wässrigen Lösungen mit der Aktivkohle zusammenführt, indem man die rohe wässrige

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   Lösung durch eine mit Aktivkohle gefüllte Säule leitet und die Elution vornimmt, indem man das alkalische
   Gemisch durch die Aktivkohle3äule, die das Cephalosporin C adsborbiert hat, leitet«
7. 7) Verfahren nach Ansprüchen 1 "bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß man die rohe wässrige Lösung mit einer Raumströmungsgeschwindigkeit von etwa 0,1 bis 2,0 V/V/Std. durch die Aktivkohlesäule leitet·
8. 8) Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß man das alkalische Gemisch mit einer Raumströmungsgeschwindigkeit von etwa 0,1 bis 2,0 V/V/Std« durch die Aktivkohlesäule leitet«
9. 9) Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß man Aktivkohlen verwendet, die eine solche
   Korngröße haben, daß sie ein Sieb einer Maschenweite
   von etwa 0,3 bis 2,0 mm passieren, und eine Oberfläche von etwa 300 bis 2000 m /g aufweisen.

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