WO2014076199A2 - Verfahren zur reinigung eines (blut)plasmaproteins - Google Patents

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WO2014076199A2
WO2014076199A2 PCT/EP2013/073864 EP2013073864W WO2014076199A2 WO 2014076199 A2 WO2014076199 A2 WO 2014076199A2 EP 2013073864 W EP2013073864 W EP 2013073864W WO 2014076199 A2 WO2014076199 A2 WO 2014076199A2
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    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/06—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies from serum
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
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    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5002—Partitioning blood components

Definitions

  • the present invention relates to a one-step process for purifying a (blood) plasma protein from a mixture containing this (blood) plasma protein, comprising applying the (blood) plasma protein to a sorbent comprising a solid support material whose surface is covered with benzopyrene residues and 3-
  • Azopyrolresten is functionalized, and the elution of the (blood) plasma protein from the sorbent, the method may be useful for the separation of
  • Blood components in particular factor XI and / or blood factor XIa, are used.
  • the (blood) plasma proteins comprise immunoglobulin G.
  • Factor XI also referred to as rosal factor or plasma thromboplasmin enteral agent
  • rosal factor or plasma thromboplasmin enteral agent is an enzyme involved in blood coagulation in the form of a blood clot
  • Serine proteinase This enzyme is produced by the liver and is located in the
  • Factor XI Blood plasma in its inactive form as a homodimer, in which two units are connected by a disulphite bridge.
  • the monomer has a molecular weight of 800 kDa.
  • Factor XI is activated by the activated Hagemane factor (Factor XIIa) or by thrombin and then designated Factor XIa. It is part of the intrinsic pathway of blood clotting that takes action when the Hageman factor and other components are negatively charged Collagen under the endothelium of the vessel wall meets.
  • the factor XIa activates the Christmas factor (factor IX) in the coagulation cascade to factor IXa,
  • 2005/0949070 describes a sequential chromatographic method comprising a cation exchange chromatography, a hydrophobic
  • EP 2 102 335 A2 describes a hydrophobic charge-induction chromatography material for the purification of factor XI, which inter alia. having a pyridine ring.
  • Factor IX is first added to the chromatography material at neutral pH (with the pyridine ring being uncharged) bound. After increasing the pH to about 4, resulting in the protonation of the
  • a first aspect of the present invention therefore relates to a one-step process for purifying a (blood) plasma protein from a mixture containing this (blood) plasma protein, comprising applying the
  • the term "one-step” refers only to the steps to treat the (blood) plasma protein per se, ie the process may still involve further steps or steps that interfere with the Pre- or post-treatment of the sorbent deal.
  • the one-step method according to the present invention does not involve more than one treatment step for the (blood) plasma protein.
  • the benzopyrrole residues of the solid support material are 3-indolopropionamide residues.
  • the 3-azapyrrole radicals are in the form of 4-imidazolacrylamide radicals.
  • the sorbent substantially does not bind or absorb the (blood) plasma protein to be purified. This means that after application or application of the (blood) plasma protein to the sorbent, the (blood) plasma protein that is to be purified moves essentially through the sorbent with the flow agent front, and can be recovered from the column with it.
  • the (blood) plasma protein after addition of the five-fold amount, preferably three times, and particularly preferably twice the amount of superplasticizer, based on the sorbent volume, essentially completely, ie at least 80%, preferably at least 90% and most preferably at least 93% of the sorbent can be recovered.
  • elution rate may be dependent upon several factors, such that the sorbent should be flushed with the buffer until the (blood) plasma protein to be purified is substantially completely washed off the sorbent.
  • the sorbent substantially absorbs the contaminants of the blood plasma protein.
  • Impurities bound to the sorbent are preferably IgA, IgM, as well as Factor XI and Factor XIa.
  • plasma proteins blood are especially those
  • the (blood) plasma protein is preferably an immunoglobulin, more preferably immunoglobulin G, and most preferably human immunoglobulin G.
  • prepurified (blood) plasma protein particularly preferably prepurified immunoglobulin G
  • the (blood) plasma protein or immunoglobulin G preferably at least 80% by weight, more preferably at least 85% by weight, even more preferably at least 90% by weight, and most preferably from 92 to 98% by weight of the (blood) plasma protein mixture, each based on the dry weight of the Mixture, makes up.
  • a particularly preferred (blood) plasma protein mixture in the context of the present invention is a
  • the sorbent used in the process is a solid support material whose surface is functionalized with at least two receptor molecules.
  • the support material consists of a porous base material which, for the incorporation and crosslinking of a polyamine compound, is first coated with at least one layer of this amine compound and subsequently functionalized by attachment
  • the porous base material is suitably a porous polystyrene.
  • PoiyaminENS has proved the use of polyvinylamine as particularly useful.
  • the carrier material is made by adding a
  • Crosslinking agent such as a diepoxide crosslinked.
  • the preparation of the carrier material may be effected by coating the porous base material with a layer of a polyamine compound, but it is also possible to coat the base material with two or more layers.
  • (Blood) plasma protein is applied as a solution in a buffer on the sorbent.
  • the buffer are preferably buffers having a pKa in the range of 4.0 to 6.5 into consideration.
  • the buffer is a buffer selected from carbonic acid / silicate buffers, acetic acid buffers,
  • the buffer is a glycine buffer.
  • the buffer used expediently has a concentration in the range from 50 to 500 mmol, preferably in the range from 200 to 400 mmol, and particularly preferably in the range from 250 to 350 mmol. With regard to the loading amount, the present invention is not subject to any relevant restrictions.
  • the sorbent can be applied to the sorbent both with very small amounts, such as, for example, 10 g / l of sorbent volume, but also with very high loading quantities of up to 750 g / l of sorbent volume.
  • the (blood) plasma protein is applied to the sorbent in an amount of more than 100 g / l sorbent volume. It is particularly preferred if the blood plasma protein is applied to the sorbent in an amount in the range from 120 to 250 mg / ml sorbent volume.
  • the sorbent it is furthermore expedient to equilibrate the sorbent prior to the application of the (blood) plasma protein.
  • a further liquid is suitably used.
  • This fluid should also have a pH in the range of 4 to 6.5 so that the pH is adjusted to the pH that the (blood) plasma protein solution already has before applying the (blood) plasma protein .
  • the liquid for equilibration is a buffer having a concentration in the range of 0.5 to 2 mol / l, preferably in the range of 0.8 to 1.2 mol / l.
  • the sorbent Before equilibration, the sorbent can also be washed with a basic solution, preferably with a pH of at least 10, preferably about 14, to remove any remaining impurities from the sorbent.
  • a basic solution preferably with a pH of at least 10, preferably about 14, to remove any remaining impurities from the sorbent.
  • sodium hydroxide or potassium hydroxide may preferably be used.
  • the sorbent is furthermore possible if, after isolation of the (blood) plasma protein to be purified, the sorbent is subjected to subsequent washing steps. Finally, after completion of the washing, it is possible to regenerate the sorbent with a strongly basic solution and to clean it of the (blood) plasma protein residues remaining on the sorbent.
  • the pH of the strongly basic solution is advantageously at least 10, more preferably a pH of about 14 is used. Any commercially available base can be used as the base, but for reasons of cost it is advisable to use sodium hydroxide or potassium hydroxide.
  • the sorbent may be washed with acetic acid, preferably at a concentration of from 200 mmol / l to 600 mmol / l, prior to treatment with the basic solution.
  • a further aspect of the present invention relates to the use of a method as described above for the separation of one or more selected from immunoglobulin A, immunoglobulin M, factor XI and factor XIa, from (blood) plasma proteins, preferably from immunoglobulin G.
  • this method it is also possible to remove impurities, for example IgA and IgM, from (blood) plasma proteins, the (blood) plasma proteins preferably being immunoglobulin G, and in particular human immunoglobulin G.
  • a sorbent comprising a solid support material whose surface is functionalized with benzopyrrole residues and 3-azapyrrole residues and having a structure as described above for separating one or more selected from immunoglobulin A, immunoglobulin M, factor XI and factor XIa, from (blood) plasma proteins, preferably from
  • Immunoglobulin G and more preferably from human immunoglobulin G.
  • the process described above provides a simple and inexpensive process for purifying such blood plasma proteins.
  • the process described is also suitable for use with reagents such as Triton X-100, tri-N-butylphosphine or polysorbate (trade name "TWEEN"), for example those described in U.S. Pat a previous solvent-detergent process were not completely separated, to remove from the product.
  • albumin residues and transferin residues can be removed from the product.
  • the present invention also relates to the use of a sorbent comprising a solid support material whose surface is functionalized with benzopyrene radicals and 3-azapyrrole radicals and having a structure as described above for the removal of Triton X-100, Tri-N- butylphosphine, polysorbate (trade name "TWEEN”), albumin residues and
  • (Blood) plasma protein is preferably immunoglobulin G is.
  • the following example is intended to illustrate the invention described and not to limit its scope in any way.
  • Example 1 The sorbent is first equilibrated with an acetate buffer (pH 4 to 6) and then treated with 250 mM glycine buffer of pH 5.5.
  • the starting product used is a 5% IgG solution with IgA (1000 mg / l) and IgM (500 mg / l), Factor XI (50 U / ml) and Factor XIa (50 pM / l) impurities.
  • the feed solution is added to the sorbent in an amount corresponding to a loading of about 250 g / l.
  • the sorbent is then rinsed with 250 mM glycine buffer at pH 5.5 until the IgG is completely washed off the sorbent.
  • the product IgG is obtained in a yield of> 99%, the product obtained having impurities of IgA of ⁇ 10 mg / l and of IgM of ⁇ 5 mg / l.
  • the amount of factor XIa can be reduced below 2 pM, while factor XI was no longer detectable in the product obtained (0 U / ml).
  • IgM and IgA can be with a purity of> 95% and a yield> 95% with an acid buffer (300 mM acetate buffer pH 3.5) are then isolated from the column.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein einstufiges Verfahren zur Reinigung eines (Blut)Plasmaproteins aus einer Mischung, die dieses (Blut)Plasmaprotein enthält, umfassend das Aufbringen des (Blut)Plasmaproteins auf ein Sorbenz, umfassend ein festes Trägermaterial, dessen Oberfläche mit Benzopyrrol-Resten und 3-Azepyrrolresten funktionalisiert ist, und das Eluieren des (Blut)Plasmaproteins von dem Sorbenz. Das Verfahren eignet sich insbesondere zur Abtrennung von Blutbestandteilen, wie IgA, IgM sowie Faktor XI und Faktor XIa, die an das Sorbenz gebunden werden, während das zu reinigende (Blut)Plasmaprotein nicht oder nur geringfügig an das Sorbenz bindet. Damit ist es möglich, das Produkt in einem einfachen Flow through-Schritt zu reinigen, wobei hohe Ausbeuten und Reinheiten bei hohen Beladungskapazitäten erzielt werden.

Description

Verfahren zur Reinigung eines (Blut)plasmaproteins
Beschreibung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein einstufiges Verfahren zur Reinigung eines (Blut)plasmaproteins aus einer Mischung, die dieses (Blut)plasmaprotein enthält, umfassend das Aufbringen des (Blut)plasmaproteins auf ein Sorbenz, umfassend ein festes Trägermaterial, dessen Oberfläche mit Benzopyrolresten und 3-
Azopyrolresten funktionaiisiert ist, und das Eluieren des (Blut)plasmaproteins von dem Sorbenz, Das Verfahren kann zweckmäßig zur Abtrennung von
Blutbestandteilen, wie insbesondere Faktor XI und/oder Blutfaktor XIa, verwendet werden. Die (Blut)plasmaproteine umfassen dabei insbesondere Immunoglobulin G.
Hintergrund der Erfindung
Der Faktor XI (auch als Rosentalfaktor oder Plasma Thromboplasmin Äntecedent bezeichnet) ist ein an der Blutgerinnung beteiligtes Enzym in Form einer
Serinproteinase. Dieses Enzym wird von der Leber produziert und liegt im
Blutplasma in seiner inaktiven Form als Homodimer vor, in dem zwei Einheiten über eine Disulphitbrücke miteinander verbunden sind. Das Monomer besitzt eine Molekülmasse von 800 kDa. Der Faktor XI wird durch den aktivierten Hageman- Faktor (Faktor Xlla) oder durch Thrombin aktiviert und dann als Faktor XIa bezeichnet. Es gehört zum intrinsischen Pfad der Blutgerinnung, die in Aktion tritt, wenn der Hageman-Faktor und andere Bestandteile auf negativ geladenes Collagen unter dem Endothel der Gefäßwand trifft. Der Faktor XIa aktiviert in der Gerinnungskaskade den Christmas-Faktor (Faktor IX) zu Faktor IXa,
Ein erhöhtes Faktor XI-Niveau im Blut wird heute mit der Verursachung von Thrombosen in Verbindung gebracht. In der jüngeren Vergangenheit wurde daher bei Blutplasmaproteinpräparaten starker Wert darauf gelegt, dass die enthaltenen Präparate möglichst frei von Faktor XI oder Faktor XIa sind, damit sich bei Gabe entsprechender Blutpräparate an Patienten bei diesen das Thromboserisiko nicht erhöht.
Die Abtrennung bzw. Aufreinigung von Faktor XI oder XIa wurde beispielsweise bereits in der US 5,252,217 beschrieben, wobei der Faktor
säulenchromatographisch mit Hilfe von "Sulphat-Sepharose-Gelen" isoliert wurde. Problematisch an diesem Verfahren ist allerdings, dass diese Gele nur mit einer relativ geringen Beladung (d.h., einem geringen Verhältnis von zu reinigender Substanz zu Chromatographie Material) betrieben werden können. Damit sind diese Verfahren zur Abtrennung von Faktor XI und/oder XIa aus großen Mengen an (Blut)plasmaproteinen relativ zeitaufwändig und kostspielig. In der WO 2005/049070 sind Verfahren zur Abtrennung von Faktor XI
beschrieben, die auf Affinitätschromatographie beruhen. Dabei werden mit Faktor XI-Antikörpern modifizierte Säulenmaterialien oder mit Heparin, L-Arginin oder Benzamidin-modifizierte Materialien vorgeschlagen. Weitere Verfahren zur
Abtrennung von Faktor IX basieren auf Ionenaustauschchromatographie,
Größenausschlusschromatographie, elektrophoretischen Verfahren oder
unterschiedlicher Löslichkeit der Faktoren in den Präparaten. Die WO
2005/0949070 beschreibt zudem ein sequentielles Chromatographieverfahren, umfassend eine Kationaustauschchromatographie, eine hydrophobe
Wechselwirkungschromatographie und eine abschließenden Behandlung mit Hydroxylapatit, wobei sehr reiner Faktor XI erhalten werden soll .
In der EP 2 102 335 A2 ist schließlich für die Aufreinigung von Faktor XI ein hydrophobes Ladungsinduktionschromatographiematerial beschrieben, das u.a . einen Pyridinring aufweist. Dabei wird Faktor IX zunächst bei neutralem pH (wobei der Pyridinring ungeladen vorliegt) an das Chromatographiematerial gebunden. Nach Erhöhung des pHs auf etwa 4, was zur Protonierung des
Pyridinrings führt, wird der Antikörper anschließend wieder freigesetzt.
Die beschriebenen Verfahren zielen jedoch allesamt auf die Reinigung von Faktor XI ab, und beschäftigen sich nicht mit der Abtrennung des Faktors aus
(Blut)plasmaproteingemischen, bei denen eine möglichst reine
(Blut)plasmaproteinfraktion erhalten werden soll, Demzufolge ist unklar ob diese Verfahren mit Ausgangsprodukten durchgeführt werden können, bei denen der Faktor XI nur in gegenüber den übrigen Proteinen geringen Anteilen vorhanden ist.
Ein weiteres in (Blut)Plasmaproteinpräparaten unerwünschtes Nebenprodukt ist das Immunoglobulin A, welches Allergien in Patienten verursachen kann, Es besteht daher ein Bedarf für ein einfaches Verfahren zur Reinigung eines
(Blut)plasmaproteins aus einer Mischung, die dieses (Blut)plasmaprotein enthält, wobei dieses Verfahren insbesondere zur schnellen und einfachen Abtrennung von Immunoglobulin A und M, sowie Faktor XI bzw. und/oder Faktor XIa aus dem (Blut)plasma-proteingemisch geeignet sein sollte. Die vorliegende Erfindung löst dieses Problem.
Beschreibung
Ein erster Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft demzufolge ein einstufiges Verfahren zur Reinigung eines (Blut)Plasmaproteins aus einer Mischung, die dieses (Blut)Plasmaprotein enthält, umfassend das Aufbringen des
(Blut)Plasmaproteins auf ein Sorbenz, umfassend ein festes Trägermaterial, dessen Oberfläche mit Benzolpyrolresten und 3-Azapyrrolresten funktionalisiert ist und das Eluieren des (Blut)Plasmaproteins von dem Sorbenz.
Wenn im Vorstehenden von einem einstufigen Verfahren die Rede ist, bezieht sich die Bezeichnung "einstufig" nur auf die Schritte zur Behandlung des (Blut)Plasma- proteins an sich, d.h., das Verfahren kann dennoch weitere Schritte oder Stufen umfassen, die sich mit der Vor- oder Nachbehandlung des Sorbenzes befassen. Das einstufige Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst jedoch nicht mehr als einen Behandlungsschritt für das (Blut)Plasmaprotein. In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei den Benzopyrrolresten des festen Trägermaterials um 3-Indolpropionamidreste. Alternativ oder zusätzlich dazu ist es bevorzugt, wenn die 3-Azapyrrolreste in Form 4- Imidazolacrylamidresten vorliegen.
Im Rahmen des vorstehend beschriebenen Verfahrens ist es weiterhin bevorzugt, wenn das Sorbenz das zu reinigende (Blut)Plasmaprotein im Wesentlichen nicht bindet oder absorbiert. Das heißt, dass sich nach dem Auftragen oder Aufbringen des (Blut)Plasmaproteins auf das Sorbens das zu reinigende (Blut)plasmaprotein im Wesentlichen mit der Fließmittelfront durch das Sorbenz bewegt, und mit dieser von der Säule zurückgewonnen werden kann. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist es demzufolge bevorzugt, wenn das (Blut)Plasmaprotein nach Zugabe der fünffachen Menge, vorzugsweise der dreifachen Menge, und besonders bevorzugt der zweifachen Menge an Fließmittel, bezogen auf das Sorbenzvolumen, auf das Sorbenz im Wesentlichen vollständig, d.h., zu mindestens 80 %, vorzugsweise mindestens 90 % und besonders bevorzugt mindestens 93 % von dem Sorbenz zurückgewonnen werden kann. Die
Elutionsgeschwindigkeit kann jedoch von unterschiedlichen Faktoren abhängen, sodass das Sorbenz so lange mit dem Puffer gespült werden sollte, bis das zu reinigende (Blut)Plasmaprotein im Wesentlichen vollständig vom Sorbenz heruntergewaschen wurde.
In der vorstehenden Ausführungsform absorbiert das Sorbenz demzufolge im Wesentlichen die Verunreinigungen des Blutplasmaproteins. Bei den
Verunreinigungen, die an das Sorbenz gebunden werden, handelt es sich vorzugsweise um IgA, IgM, sowie Faktor XI und Faktor XIa. Wie sich aus dem Vorstehenden ergibt, sind als (Blut)Plasmaproteine insbesondere solche
(Blut)Plasmaproteine im Rahmen der Erfindung zu reinigen, die selbst nicht an das Sorbenz binden. Bei dem (Blut)plasmaprotein handelt es sich vorzugsweise um ein Immunoglobulin, besonders bevorzugt um Immunoglobulin G, und am meisten bevorzugt um menschliches Immunoglobulin G.
Im Rahmen des Reinigungsverfahrens wird weiterhin vorzugsweise vorgereinigtes (Blut)plasmaprotein, besonders bevorzugt vorgereinigtes Immunoglobulin G, eingesetzt, in dem das (Blut)plasmaprotein bzw. das Immunoglobulin G vorzugsweise mindestens 80 Gew.-%, besonders bevorzugt mindestens 85 Gew.- %, noch mehr bevorzugt mindestens 90 Gew.-%, und am meisten bevorzugt 92 bis 98 Gew.-% des (Blut)Plasmaproteingemisches, jeweils bezogen auf das Trockengewicht des Gemischs, ausmacht. Eine im Rahmen der vorliegenden Erfindung besonders bevorzugte (Blut)Plasmaproteinmischung ist eine
vorgereinigte Immunoglobulin G-Lösung mit einem Immunoglobulin G Gehalt (bezogen auf das Trockengewicht der (Blut)Plasmaproteinmischung) von 92 bis 98 Gew.-%. Bei dem im Verfahren verwendeten Sorbenz handelt es sich um ein festes Trägermaterial, dessen Oberfläche mit mindestens zwei Rezeptormolekülen funktionalisiert ist. Besonders bevorzugt besteht das Trägermaterial aus einem porösen Grundmaterial, das zur Einlagerung und Vernetzung einer Polyaminver- bindung zunächst mit mindestens einer Lage dieser Aminverbindung überzogen wird und anschließend unter Anknüpfung von funktionalisierten
Rezeptormolekülen unter Ausbildung kovalenter Bindungen zwischen den
Rezeptormolekülen und dem Polyamin funktionalisiert wird. Bei dem porösen Grundmaterial handelt es sich zweckmäßig um ein poröses Polystrol. Als
Poiyaminverbindung hat sich die Verwendung von Polyvinylamin als besonders zweckmäßig erwiesen. Das Trägermaterial wird durch Zugabe eines
Vernetzungsmittels, beispielsweise einem Diepoxid, vernetzt. Die Herstellung des Trägermaterials kann durch Beschichtung des porösen Grundmaterials mit einer Schicht einer Poiyaminverbindung erfolgen, es ist jedoch auch möglich, das Grundmaterial mit zwei oder mehreren Schichten zu überziehen . Vor dem
Aufbringen der jeweils weiteren Schicht erfolgt zweckmäßig eine Vernetzung der aufgebrachten Poiyaminverbindung, beispielsweise mit einem Vernetzungsmittel, wie vorstehend beschrieben.
Die Herstellung von Trägermaterialien die mit Polyvinylamin überzogen sind, ist bereits im Stand der Technik, zum Beispiel in EP 1 141 038 und EP 1 232 018 beschrieben worden. Anschließend wird das so erhaltene mit Polyamin beschichtete Sorbenz mit zwei organischen Resten funktionalisiert. Dabei hat sich insbesondere die Verwendung von Säure-funktionalisierten Rezeptormolekülen oder Derivaten davon, bei denen nach Umsetzung mit dem Polyvinylamin Amid-Verknüpfungen ausgebildet werden, als besonders zweckmäßig erwiesen.
Es ist möglich, die im Sorbenz vorhandenen Amingruppen vollständig mit organischen Resten zu funktionalisieren . In der Praxis der vorliegenden Erfindung ist es aber erwünscht, dass nur etwa 25 bis 98 %der freien Amingruppen des Polyamins mit Rezeptormolekülen umgesetzt werden.
Für die Verknüpfung der Rezeptormoleküle mit dem festen Trägermaterial kommen alle bekannten Verfahren zur Verknüpfung von Aminen mit anderen funktionellen Gruppen in Betracht, insbesondere Verfahren zur Bildung von Amidverbindungen, Sulfonamidbindungen oder die Umsetzung der Amine mit Aldehyden unter reduktiven Bedingungen. Wird eine Säurefunktionalität zur Verknüpfung mit den Aminresten des Trägermaterials verwendet, wird nach der Umsetzung in der Regel eine Amidfunktionalität erhalten mit der das Rezeptormolekül an das Trägermaterial gebunden ist. Zur Bildung solcher
Amidverknüpfungen kommen alle im Stand der Technik beschriebenen
Reaktionsarten in Betracht, die dem Fachmann geläufig sind.
Auch die Bindung von Rezeptormolekülen an Trägermaterialien wie sie vorstehend beschrieben sind, wurde bereits im Stand der Technik, insbesondere in
WO 2004/085046, beschrieben.
Für das Verfahren hat es sich als zweckmäßig herausgestellt, wenn das
(Blut)Plasmaprotein als Lösung in einem Puffer auf das Sorbenz aufgebracht wird. Für den Puffer kommen vorzugsweise Puffer mit einem pKa-Wert im Bereich von 4,0 bis 6,5 in Betracht. Vorzugsweise handelt es sich bei dem Puffer um einen Puffer, ausgewählt aus Kohlensäure/Silikatpuffern, Essigsäurepuffern,
Citratpuffern, Phosphatpuffern, Glycinpuffern und/oder 2-(N- Morpholino)ethansulfonsäure (MES) Puffern. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem Puffer um einen Glycinpuffer. Der verwendete Puffer weist zweckmäßig eine Konzentration im Bereich von 50 bis 500 mmol, bevorzugt im Bereich von 200 bis 400 mmol, und besonders bevorzugt im Bereich von 250 bis 350 mmol auf. Hinsichtlich der Beladungsmenge unterliegt die vorliegende Erfindung keinen relevanten Beschränkungen. So kann das Sorbenz sowohl mit sehr geringen Mengen, wie beispielsweise 10 g/l Sorbenzvolumen, aber auch mit sehr hohen Beladungsmengen von bis zu 750 g/l Sorbenzvolumen, auf das Sorbenz aufgetragen werden. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist es jedoch bevorzugt, wenn das (Blut)Plasmaprotein in einer Menge von mehr als 100 g/l Sorbenzvolumen auf das Sorbenz aufgetragen wird. Besonders bevorzugt ist es, wenn das Blutplasmaprotein in einer Menge im Bereich von 120 bis 250 mg/ml Sorbenzvolumen auf das Sorbenz aufgetragen wird. Diese Mengen stellen einen guten Kompromiss zwischen festgestellter Reinigungsleistung und Zeitaufwand für die Trennung der zu reinigenden (Blut)Plasmaproteine dar.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist es weiterhin zweckmäßig, das Sorbenz vor dem Aufbringen des (Blut)Plasmaproteins zu equilibrieren. Dazu wird zweckmäßig eine weitere Flüssigkeit verwendet. Diese Flüssigkeit sollte ebenfalls einen pH- Wert im Bereich von 4 bis 6,5 aufweisen, so dass der pH-Wert bereits vor dem Auftragen des (Blut)Plasmaproteins auf den pH-Wert eingestellt ist, den die (Blut)Plasmaprotein-Lösung aufweist. Weiterhin ist es bevorzugt, wenn die Flüssigkeit zum equilibrieren ein Puffer ist, der eine Konzentration im Bereich von 0,5 bis 2 Mol/1, vorzugsweise im Bereich von 0,8 bis 1,2 Mol/1, aufweist.
Vor dem Equilibrieren kann das Sorbenz ebenfalls noch mit einer basische Lösung, vorzugsweise mit einem pH-Wert von mindesten 10, bevorzugt etwa 14, gewaschen werden, um eventuell noch vorhandene Verunreinigungen vom Sorbenz zu entfernen. Als Base können vorzugsweise Natriumhydroxid oder Kaliumhydroxid verwendet werden. Damit sich beim Equilibrieren möglichst schnell ein pH -Wert im Bereich von etwa 4 bis 6,5 einstellt, kann es zudem zweckmäßig sein, nach dem Waschen mit der basischen Lösung das Sorbenz mit einer schwach sauren Lösung zu behandeln, wobei zweckmäßig Essigsäure, vorzugsweise mit einer Konzentration im Bereich von 200 bis 1000 mMol/l, zum Einsatz kommt. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist es weiterhin möglich, wenn nach dem Isolieren des zu reinigenden (Blut)Plasmaproteins das Sorbenz nachgeschalteten Waschschritten unterzogen wird. Schließlich ist es möglich, das Sorbenz nach Abschluss des Waschens mit einer stark basischen Lösung zu regenerieren und von den auf dem Sorbenz verbleibenden (Blut)Plasmaproteinresten zu reinigen. Dabei beträgt der pH-Wert der stark basischen Lösung vorteilhaft mindestens 10, besonders bevorzugt wird ein pH -Wert von etwa 14 verwendet. Als Base kann jede kommerziell erhältliche Base verwendet werden, aus Kostengründen empfiehlt es sich aber, Natriumhydroxid oder Kaliumhydroxid zu verwenden. Zusätzlich dazu kann das Sorbenz vor der Behandlung mit der basischen Lösung noch mit Essigsäure, vorzugsweise einer Konzentration von 200 mMol/l bis 600 mMol/l, gewaschen werden.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung eines wie vorstehend beschriebenen Verfahrens zur Abtrennung von einem oder mehreren, ausgewählt aus Immunoglobulin A, Immunoglobulin M, Faktor XI und Faktor XIa, aus (Blut)Plasmaproteinen, bevorzugt aus Immunoglobulin G. Darüber hinaus können mit Hilfe dieses Verfahrens auch Verunreinigungen, wie beispielsweise IgA und IgM, aus (Blut)plasmaproteinen entfernt werden, wobei es sich bei den (Blut)plasmaproteinen vorzugsweise um Immunoglobulin G, und insbesondere menschliches Immunoglobulin G handelt.
Schließlich betrifft ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung die
Verwendung eines Sorbenzes, umfassend ein festes Trägermaterial, dessen Oberfläche mit Benzopyrrolresten und 3-Azapyrrolresten funktionalisiert ist, und einen Aufbau aufweist, der wie vorstehend beschrieben ist, zur Abtrennung von einem oder mehreren, ausgewählt aus Immunoglobulin A, Immunoglobulin M, Faktor XI und Faktor XIa, aus (Blut)Plasmaproteinen, bevorzugt aus
Immunoglobulin G, und besonders bevorzugt aus menschlichem Immunoglobulin G.
Das vorstehend beschriebene Verfahren zeichnet sich dadurch aus, dass
(Blut)plasmaproteine, wie insbesondere IgG, durch einen einfachen Flow through- Schritt aufgereinigt werden können. Zudem erlaubt es das vorstehend
beschriebene Verfahren, IgG-Produkte mit sehr hohen Verhältnissen von zu reinigendem Produkt/Sorbenzvolumen zu reinigen, wobei das Produkt dennoch in sehr hoher Ausbeute von > 95% zurückgewonnen werden kann. Damit stellt das vorstehend beschriebene Verfahren ein einfaches und kostengünstiges Verfahren zur Reinigung solcher Blutplasmaproteine dar. Das beschriebene Verfahren ist ebenfalls dazu geeignet, um Reagenzien wie Triton X-100, Tri-N-butylphosphin oder Polysorbat (Handelsname "TWEEN"), beispielsweise die in einem vorausgegangenen solvent-detergent Verfahren nicht vollständig abgetrennt wurden, aus dem Produkt zu entfernen. Weiterhin können mit dem Verfahren Albuminreste und Transferinreste aus dem Produkt entfernt werden. Es ist ebenfalls möglich, IgA und IgM getrennt von dem Sorbenz zu eluieren und diese somit in ebenfalls gereinigter Form zu erhalten. Demzufolge betrifft die vorliegende Erfindung ebenfalls die Verwendung eines Sorbenzes, umfassend ein festes Trägermaterial, dessen Oberfläche mit Benzopyrolresten und 3-Azapyrrolresten funktionalisiert ist, und einen Aufbau aufweist, der wie vorstehend beschrieben ist, zur Abtrennung von Triton X-100, Tri-N- butylphosphin, Polysorbat (Handelsname "TWEEN"), Albuminresten und
Transferinresten aus einem (Blut)Plasmaprotein, wobei es sich bei dem
(Blut)plasmaprotein vorzugsweise um Immunoglobulin G handelt. Das folgende Beispiel soll zur Illustration der beschriebenen Erfindung dienen und deren Umfang nicht in irgendeiner Weise beschränken.
Beispiel 1 Das Sorbenz wird zunächst mit einem Azetatpuffer (pH 4 bis 6) equilibriert und anschließend mit 250 mM Glycinpuffer eines pH-Werts von 5,5 behandelt. Als Ausgangsprodukt wird eine 5%-ige IgG-Lösung mit Verunreinigungen von IgA (1000 mg/l) und IgM (500 mg/l), Faktor XI (50 U/ml) und Faktor XIa (50 pM/l) verwendet. Die Feed-Lösung wird in einer Menge, entsprechend einer Beladung von ca. 250 g/l, auf das Sorbenz gegeben. Das Sorbenz wird anschließend so lange mit 250 mM Glycinpuffer mit pH 5,5 gespült, bis das IgG vollständig vom Sorbenz heruntergewaschen ist. Das Produkt IgG wird in einer Ausbeute von > 99% erhalten, wobei das erhaltene Produkt Verunreinigungen an IgA von < 10 mg/l und an IgM von < 5 mg/l aufweist. Die Menge an Faktor XIa kann auf unter 2 pM reduziert werden, während Faktor XI im erhaltenen Produkt nicht mehr nachweisbar war (0 U/ml). IgM und IgA kann mit einer Reinheit von >95% und einer Ausbeute > 95% mit einen sauren Puffer (300 mM Acetat Puffer mit pH 3.5) anschließend von der Säule isoliert werden.
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Claims

Ansprüche
1. Einstufiges Verfahren zur Reinigung eines (Blut)plasmaproteins aus einer Mischung, die dieses (Blut)plasmaprotein enthält, umfassend das Aufbringen des (Blut)plasmaproteins auf ein Sorbenz umfassend ein festes Trägermaterial, dessen Oberfläche mit Benzopyrrol-Resten und 3-Azapyrrol-Resten funktionalisiert ist und das Eluieren des (Blut)plasmaprotein von dem Sorbenz,
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Benzopyrrol- Reste in Form von 3-Indolpropionamid-Resten und die 3-Azapyrrolreste in Form von 4-Imidazolacrylamido-Resten vorliegen.
3. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Sorbenz das zu reinigende (Blut)plasmaprotein im Wesentlichen nicht absorbiert.
4. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das (Blut)plasmaprotein für das Aufbringen auf das Sorbenz in einem Puffer, vorzugsweise in Glycinpuffer mit einem pH im Bereich von 4 bis 6,5, gelöst wird.
5. Verfahren gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das das Sorbenz so lange mit dem Puffer gespült wird, bis das zu reinigende (Blut)plasmaprotein im Wesentlichen vollständig von Sorbenz eluiert ist.
6. Verfahren gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das (Blut)plasmaprotein in einer Menge von mehr als 25 g/l
Sorbenzvolumen, bevorzugt im Bereich von 120 bis 250 g/l Sorbenzvolumen, auf das Sorbenz aufgetragen wird.
7. Verfahren gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das es sich bei dem (Blut)plasmaprotein um Immunoglobulin G,
vorzugsweise um menschliches Immunoglobulin G, handelt.
8. Verfahren gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Sorbenz vor dem Aufbringen des (Blut)plasmaproteins auf das Sorbenz mit einer weiteren Flüssigkeit equilibriert wird .
9. Verfahren gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die zum
Equilibrieren verwendete Flüssigkeit eine Lösung mit einem pH im Bereich von 4 bis 6,5 ist.
10. Verfahren gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Lösung ein Acetat-Puffer mit einer Konzentration im Bereich von 0,5 bis 2 M, vorzugsweise
0,8 bis 1,2 M ist.
11. Verfahren gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch
gekennzeichnet, dass das Sorbenz durch Spülen mit einer Lösung, die einen pH von mindestens 9, vorzugsweise im Bereich von etwa 14, aufweist, regeneriert wird.
12. Verfahren gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch
gekennzeichnet, dass als festes Trägermaterial ein Material verwendet wird, das auf einem porösen Grundmaterial, vorzugsweise aus Polystyrol, beruht, welches mit einem Polymer, vorzugsweise einem Polyaminpolymer, in mindestens einer Lage überzogen, vernetzt und anschließend funktionalisiert wurde.
13. Verwendung eines Verfahrens gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11 zur Abtrennung von einem oder mehreren, ausgewählt aus IgA, IgM, Faktor XI und Faktor XIa.
14. Verwendung eines Sorbenz umfassend ein festes Trägermaterial, dessen Oberfläche mit Benzopyrrol-Resten und 3-Azapyrrol-Resten funktionalisiert ist, zur Abtrennung von einem oder mehreren, ausgewählt aus IgA, IgM, Faktor XI und Faktor XIa aus (Blut)plasmaproteinen, bevorzugt aus Immunoglobulin G.
* * *
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