UA43855C2 - Спосіб одержання вірусоінактивованої фракції, що містить фактор yiii, та фракція, що містить фактор yiii - Google Patents

Abstract

Пропонується спосіб одержання вірусоінактивованої фракції фактора VIII за допомогою хроматографічних методів. Використовують кріопреципітат або плазму крові, які вибірково обробляють гідроокисом алюмінію. Вірусоінактивацію здійснюють за допомогою оброблення зазначеної фракції ди- або триалкілфосфатом, або неіонною поверхнево-активною речовиною з додатковою селективною пастеризацією. Як хроматографічний метод використовують іонообмінну або афінну хроматографію.

Description

Изобретение касается способа получения фракции, содержащей вирусоинактивированньй фактор УТЛ, посредством хроматографических методов, а таюке фракции, содержащей фактор МІ, получаемой по способу согласно изобретению.

Фактор МІ является жизненно важньім веществом, которьй играет значительную роль в свертьіваний крови. Так, нарушения в свертьмшваниий крови поддаются терапевтическому действию путем приема фактора МІ. Позтому существует большая потребность в препарациях фактора МІ, годньїх к употреблению. Бьіло достаточно попьток, чтобьі вьіделить фактор МІ в существенно обогащенной форме из естественньїх источников. Так, уже известнь хроматографические методь! для промьівки фактора МІ из криопреципитата. Последний является фракцией, которая может бьіть получена путем обработки плазмь! холодом. Публикакция ЕР 367 840 В1 касается хроматографического метода для вьіделения фактора МІ из плазмьї крови без предшествующей риппрсокипитации. При зтом фракция, содержащая фактор МІ, вьіделяется посредством хроматографического разделения на гидрофильном хроматографическом материале, которьій модифицирован ионообменньми группами. Публикакция ЕР 0 238 701 касаєтся способа получения вьісокочистого инфекционного антигемофильного фактора, причем криопреципитатом яшгяются предварительно обработаннье фракции, которье посредством осаждения зтанола освобождаются от фибриногена, глобулина, альбуминов и других создающихпомехи составньїх частей. В европейской патентной заявке 88 108 458,6 описьівается осуществление после вирусоинактивации криопреципитатной фракции хроматографического разделения с помощью ионообменньїх веществ. В публикации ЕР 0 173 242 А описан способ хроматографического получения препараций фактора МІ на анионообменньх материалах, которне базируются исключительно науглеводах.

При зтом углеводная матрица модифицирована дизтиламинозтиловьми (ОЕАЕ) группами. В качестве подходящих описьваются прежде всего ОЕБАЕ-сефарозе, а также ЮОЕАЕ-целлюлоза. В (48-А-1,178,958 описьіваєтся промьвка фактора МИ с помощью ЕСТЕОЇА-целлюлозньїх колонок. Модифицированная целлюлоза содержит базовье заместители, которне вводились посредством реакции зпихлоргидрина и тризтаноламина. Названньй уровень техники используетили разделение хроматографическим способом в форме Ваїсп-метода или хроматографию на колонке.

Зтими способами достигают действительно хороших хрезультатов, однако по-прежнему желательньм остается повьішение вьіїхода биологически ценного фактора МІ! как по зкономическим, так и зтическим причинам.

В основу настоящего изобретения поставлена задача разработки способа, которьй позволит на основе существующего уровня техники усовершенствовать процесс получения фактора Мі в отношений вьхода и биологической активности.

Поставленная образом задача решается посредством способа, при котором на основе криопреципитата или плазмь! крови, в данном случає на основе обработки гидроокисью алюминия, после растворения криопреципитата осуществляєтся операция разделения путем мембранной хроматографии.

Способ согласно изобретению может также осуществляться с использованием торгового криопреципитата или плазмьї крови. Предпочтительно для предварительного концентрирования фактора МИ размороженньй криопреципитат для последующей предварительной промьївки пробьї обрабатьваеєтся гидроокисью алюминия.

Предпочтительно перед собственно хроматографической промьіївкой на материалах, которне размещень в или на мембранах, проводитя вирусоинактивация. При зтом вирусоинактивация осуществляєтся по методу, которьй описьваєтся в ЕР 131 740 А1, путем обработки биосовместимьми органическими растворителями (детергентами),

Тип Х - 100/ТМВР, предпочтительно Тмеєп /ТМВР (три-гі-бутилфосфат). Хороших результатов достигают также при использований хлората натрия/ТМВР. Предпочтительно используемье количества - до 15вес. 95 детергента.

Вирусоинактивацию можно также осуществить после разделения путем мембранной хроматографии.

Операция разделения хроматографическим способом для промьівки фактора ХІІ в пробе может осуществляться на основньїх материалах, модифицированньх ионообменньми группами, прежде всего, анионитами, или на материалах, модифицированньїх иммунносродственньіми лигандами. При зтом решающим является то, что названнье материальь размещень в мембранах. Предпочтительно мембрань! состоят из основного материала; такого как модифицированная целлюлоза или искусственное волокно. Прежде всего подходят мембраньі, а также компактнье диски из пористьїх полиглицидилметакрилатов и/или из других пористьїх гидрофильньхх полимеров с подобной структурой, как и из гирофилизированного полистирола.

В первом случає пригодная для разделения мембрана состоит или из тонких уложенньїх стопой друг на друга пленок из целлюлозьії или искусственньїх волокон или во втором случає из компактньїх дисков из силикагеля или полимеров-носителей. Основнье материальі мембран или дисков снабжень! соответствующими анионообменньми группами или иммунносродственньмми лигандами. В качестве ионообменньїх групп рассматриваются, прежде всего, анионообменньюе группь!, такие как четверичнье аминьії или дизтиламинозтиловье группьі. В качестве катионитов рассматриваются, как правило, слабо- и сильнокислье катионитьі, такие как материальі, которне можифицировань группами сульфокислота или фосфорной кислоть!.

Ионообменньє группь! могут бьїть не связань! или связаньї посредством так назьваемого промежуточного слоя или наполнителя с волокнами основного материала. Материаль, снабженнье наполнителем, назьваются также какматериальй "щупальца". В ОЕ 42 04 694 перечисленьї соответствующие наполнителии лигандь».В качестве наполнителя может также служить, например, глюкозаминньй радикал. Также с мембранами из пористого полиглицидилметакрилата или другихупомянутьїх материалов могут бьіть связань! анионообменньсе группьі, как ОЕАЕ или четверичнье аминь». При зтом связь анионообменньїх групп осуществляеєется илинепосредственно с материалом, образующим мембрану, или равньім образом через наполнитель, например, глюкозаминньй радикал.

В другом варианте способа согласно изобретению применяєется мембранная хроматография по иммунному сродству с иммобилизованньіми веществами, которье имеют вьісокое сродство к фактору МІ! Прежде всего для зтого рассматриваются моноклональньсе и/или поликлональнье антитела или фрагменть антител, связььівающие фактор МІП, (мембранная хроматография по иммунному сродству). Антитела имеют предпочтительно органическое или минеральное происхождение.

Вещества со сродством к фактору МІ иммобилизуются на носителях посредством химически активньх групп.

Предпочтительно активная группа связьівается не непосредственно с материалом-носителем, ас концом наполнителя.

Иммобилизация вещества для фактора МІ осуществляєтся путем связьивания с активньмми группами, как тозил, трезил, гидрацид и другие. Соответствующие способь! известнь! из Т.М. Рпйре "Атіпйу спготаїодгарну" в публикации "Спготаюдгарнпу" (Е.Нейтапп, єа.), Бін ей. ЕіІвемієї, Атвіегдат 1992.

Антитела могут также предварительно адсорбироваться на мембранах лигандами протеина А или протеина а.

Путем последующего ковалентного сшивания можно воспрепятствовать злюированию антител (обескровление колонок). Для сшивания антител на мембранах протеина А или протеина с может бьіть применен способ, подобньй тому, как при пустьїх носителях. Преимущество иммобилизации на протеине А или протеине (С состоит в том, что антитела иммобилизуются исключительно на постоянном сегменте молекусь (Б). В зтом случає антигенно- сьязьівающая часть (ГЕ) остаєтся свободной и не встречаєт препятствия в своем взаймодействий с фактором МП.

В другом предпочтительном варианте осуществления для отделения фактора ХІІ используются материальї, которье могут обеспечить гидрофобное взаиймодействие. В качестве гидрофобньхх материалов используются нецикличнье и/или цикличнье алкиловье цепи, например, алкиловье цепи С1 до С18, а также ароматические вещества. В качестве гидрофобньх подготавливающих взаймодействие материалов рассматриваются также предпочтительно материаль со ступенчатой гидрофобностью. Гидрофобность можно сделать ступенчатой путем введения полярньїх, как полярно-протонньїх или полярно-а- протонньїх групп, как гидрокси-, амино-, циано-группь!.

Предпочтительно зто согласовьвают, принимая во внимание соответствующие условия разделения.

Внрусоинактивацию можно также осуществить путем тепловой обработки. При зтом предпочтительно после первой мембранной хроматографии злюированная проба, содержащая фактор Мі, подвергаєтся операции пастеризации. Соответствующий способ предлагается в Р 43 18 435.9. При зтом фракции, которье обогащень фактором МІ, в присутствиий стабилизаторов приводятся в состояние контакта с ди- или триалкилфосфатами и в данном случаеє со смачивающими агентами и одновременно или последовательно подвергаются обработке при вьісокой температуре в диапазоне от 55 до 670" продолжительностью от 5 до 30 часов.Может бьть вьІгодньім применить комбинацию обоих способов вирусоинактивации - обработкой детергентом и теплом.

Для удаления химикатов, используемьх при операции пастеризации, можно также присоединить вторую мембранную хроматографию. Предпочтительно отделение добавленньїх стабилизаторов осуществляєтся с помощью соединений ОЕАЕ или четверичньїх соединений аммония, которние размещеньі над наполнителем на поверхности хроматографического материала-носителя, от модифицированной мембраньі. Равньм образом соответствующие лигандьї можно разместить без наполнителя на поверхности материала-носителя. Стабилизаторьї не замедляются зтим анионитньм о материалом при вьбранньхх условиях, в то время как фактор МИ адсорбируется на хроматографическом материале.

После зтого фактор МИ злюируется посредством.системьі ВОДНЬЇХ растворителей, солевье концентрации которьїх ступенчато повьішаются.

Фракция, содержащая полученньій таким путем фактор МІІї, разливаєтся в концентрированном виде посредством традиционньх способов и в данном случає лиофилизируется.

Предпочтительно фактор МІ в первой ступени разделения путем мембранной хроматографии наносится из раствора невьсокой ионной сильі. Предпочтительно водная система имеет ионную силу, которая соответствуєт от 0 до 150тМ раствора хлорида натрия. При таких величинах ионной сильі фактор МИ еще адсорбируеєтся на хроматографическом материале, в то время как более слабо связьвающие примеси посредством промьвания водньіми системами с такими же величинами ионной силь! могут вьімьіваться.

Промьївку адсорбированного материала можно вьіполнить по другому варианту осуществления способа согласно изобретению посредством водной системь! с ионной силой, которая соответствует от 200 до 400тМ раствора хлорида натрия. Десорпция фактора МІ и злюирование зтой фракции осуществляется в зтом случає посредством водной системь! с ионной силой, которая соответствует от 500 до 1500тМ раствора хлорида натрия. При зтом водородньй показатель рН вьдерживаєтся в диапазоне от 4 до 9. Если проводится катионная хроматография, то она осуществлется предпочтительно при водородном показателе менее 6, тогда как анионитную хроматографию лучше проводить при болеє вьісоком водородном показателе, превиишающем значение 6.

Если промьіївка фактора МІІї осуществляется посредством мембранной хроматографии по иммунному сродству, то в отличие от вьиішеназванного метода, в котором используются анионитнье материальі, злюирование проводится хаотропньми реактивами или вьісококонцентрированньми солевьми растворами. Злюированиеє осуществляется предпочтительно при таких концентрациях хаотропньїх реагентов или солей, которье достаточньі, чтобь! ослабить связь между веществом с вьісоким сродством к фактору МІ и самим фактором МИ. При зтом концентрация вьшеназванньїх веществ в соответствующих системах злюирования зависит от силь! сродства фактора МІ и соответствующего связующего компонента. Предпочтительно используются антитела с не слишком вьсоким сродством в качестве иммунносродственньїх лигандов. Вследствиє зтого можно осуществить злюирование водньіми растворами невьсокой денатурирующей сильі. Предпочтительно используются воднье растворь с концентрацией от 1 до 6М мочевинь), прежде всего от 2 до 4М мочевиньі), или соответственно вьісококонцентрированнье солевье растворь! для злюирования фактора МІ из иммунносродственной мембрань!.

При хроматографии гидрофобного взаимодействия проба наносится в водном растворе очень вьісокой ионной сильї, как например, вьісококонцентрированньійй сульфат аммония (с концентрацией до 4М) или хлорид натрия (с концентрацией до 5М). Злюирование осущестляется прежде всего ступенчато или непрерьівно посредством солевьмх растворов низкой ионной силь. В качестве растворов с низкой ионной силой для злюирования проб при мембранной хроматографии гидрофобного взаймодействия можно также оприменять водньй ораствор с органическими растворителями, прежде всего разбавленньй спиртовой раствор.

Способ согласно изобретению обеспечиваєт чрезвьчайно бьіструю инесложную промьівку фактора МІ! и наряду с вьісокой чистотой отличаєтся ивьісоким вьіходом продукта. Кроме того, удельная активность полученного такимпутем фактора МУ весьма вьісока, что обьяснимо невьсоким денатурированиемактивного фактора при использований способа согласно изобретению. Такимобразом, предметом изобретения является также фракция фактора "МІП, котораяможет бьіть получена посредством способа согласно изобретению.

Claims (14)

1. Способ получения вирусоинактивированной фракции, содержащей фактор МІ, посредством хроматографических методов с использованием криопреципитата после его растворения или плазмь! крови, вьїіборочно обработанньїх гидроокисью алюминия, отличающийся тем, что вирусоинактивацию осуществляют посредством обработки указанной фракции ди- или триалкилфосфатом или нейонньім поверхностно-активньм веществом с последующей по меньшей мере одной операцией разделения с помощью мембранной хроматографии.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что операцию разделения осуществляют с помощью ионообменного материала, вьібранного из группьі, состоящей из ионообменного материала, находящегося внутри мембраньї, и ионообменного материала, находящегося снаружи мембрань.

3. Способ по любому из пп.1 - 2, отличающийся тем, что дополнительную вирусоинактивацию осуществляют пастеризацией с последующей при необходимости дополнительной операцией разделения с использованием мембранной хроматографии.

4. Способ по любому из пп. 17, 3, отличающийся тем, что мембранную хроматографию осуществляют на материале, имеющем вьісокое сродство к фактору УП.

5. Способ по любому из пп. 1, 3, 4, отгличающийся тем, что материал, имеющий вьісокое сродство к фактору МП, модифицируют лигандами с вьісоким и/или низким молекулярнь/м весом.

6. Способ по п. 5, отличающийся тем, что материал мембраньії модифицируют антителами к фактору УП.

7. Способ по любому из пп. 4 - б, отличающийся тем, что модифицированньй материал с вьісоким сродством к фактору МІ имеет иммобилизованньсєе лигандь с вьісоким сродством к фактору МІ.

8. Способ по любому из пп.1, 3, отличающийся тем, что в качестве хроматографического материала используют материал, вьібранньй из группьї, состоящей из хроматографического материала, обеспечивающего гидрофобное взаймодействие с фактором МІ, подлежащим вьделению, и хроматографического материала, имеющего соответствующие лигандьі, способствующие гидрофобному взаймодействию.

9. Способ по любому из пп. 1, З - 7, отличающийся тем, что пробу, подлежащую разделению, наносят на мембрану, содержащую ионообменньій материал в водной системе с ионной силой, соответствующей от 0 до 150 ммоль раствора хлорида натрия, при необходимости промьшвают в водной системе с ионной силой, соответствующей от 200 до 400 ммоль раствора хлорида натрия и затем злюируют в водной системе с ионной силой, соответствующей от 500 до 1500 ммоль раствора хлорида натрия, поддерживая величину рН в пределах от4 до 9.

10. Способ по любому из пп. 1, З - 7, отличающийся тем, что пробу, подлежащую разделению, наносят из раствора, которьій обеспечиваєт связь фактора МІ с антителами, при необходимости сродственную мембрану промьшвают, а затем осуществляют злюийированиє с помощью хаотропньїх реагентов с концентрацией, соответствующей, например, от 1 до 6 М мочевинь, или соответствующего вьісококонцентрированного солевого раствора.

11. Способ по любому из пп. 1, 3, 8, отличающийся тем, что пробу, подлежащую разделению, наносят из раствора, имеющего ионную силу, например, от 500 до 1500 ммоль, на мембрану, имеющую на своей поверхности гидрофобньсе лигандь, и злюируют системами растворителей с более низкими значениями ионной силь.

12. Способ по любому из пп. 1 - 11, отличающийся тем, что злюированную фракцию, содержащую фактор МП, концентрируют, разливают и/или лиофилизируют.

13. Способ по любому из пп. 1 - 12, отличающийся тем, что вирусоинактивацию осуществляют посредством обработки детергентом с содержанием до 15 мас. 95.

14. Фракция, содержащая фактор МІ, отличающаяся тем, что она получена согласно способу по любому из пп. 1-13.