DE19618851C1 - Verfahren zur Eignungsprüfung von Faktor VIII-haltigen Proteinfraktionen - Google Patents

Description

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Eignungsprüfung von Faktor VIII-haltigen Proteinfraktionen, deren Weiterverarbeitungsverfahren einen Pasteurisierungsschritt beinhaltet.

Faktor VIII-Präparate werden überwiegend hergestellt aus Kryo­ präzipitat. Die Präparate der Anmelderin werden, wie in DE 43 37 573 C1 beschrieben, hergestellt durch eine Reinigung des wiederaufgelösten Kryopräzipitats mit Aluminiumhydroxid, einer Virusinaktivierung durch Lösungsmittel/Detergenzien und an­ schließende Anionenaustausch-Chromatographie. Aufgrund von verschärften Sicherheitsvorschriften für die Virusinaktivierung wurde zusätzlich ein Pasteurisierungsschritt durchgeführt, bei dem die Präparate nach der ersten Virusinaktivierung 10 Stunden bei 63°C + 1°C in Gegenwart eines Stabilisators, wie z. B. in EP 0 035 204 A2 beschrieben, erhitzt werden.

Bis zu 20% der mit Faktor VIII behandelten Patienten bilden ein Faktor VIII-Inhibitor - einen gegen Faktor VIII gerichteten Antikörper - der die Behandlung der Patienten mit Faktor VIII erschwert oder verhindert. Es existieren Verfahren, um die Stärke der Antikörperbildung gegen Faktor VIII bei bisher unbehandelten Patienten zu vermindern (WO 96/05860) oder die körpereigene Produktion des Faktor VIII-Antikörpers zu drosseln (EP 0 426 913 B1).

Während die nur nach dem Lösungsmittel/Detergenzien-Verfahren virusinaktivierten Präparate seit Jahren problemlos appliziert worden sind, traten bei den Präparaten, die zusätzlich dem Pasteurisierungsschritt unterworfen worden waren, unerwartete und nicht vorhersehbare Inhibitorbildungen in mit Faktor VIII vorbehandelten Patienten auf. Diese Inhibitorbildungen traten nach ca. sechs Wochen oder später auf. Eingehende Untersuchungen führten zu dem Ergebnis, daß diese Inhibitorbildungen gehäuft aufgetreten waren bei Patienten, die mit einer bestimmten Charge bzw. mit Chargen bestimmter Herkunft des Kryopräzipitats behan­ delt worden sind.

Weitere intensive Untersuchungen haben zu dem Ergebnis geführt, daß nur diese Chargen geringe Mengen aber durchaus nachweisbare und identifizierbare Mengen von Faktor VIII-Bruchstücken auf­ wiesen, die im Bereich von 20 bis 50 kD liegen. Diese Bruch­ stücke waren in keiner anderen Charge und auch nicht in Produk­ ten von Wettbewerbern zu finden.

Bei der Auffindung dieser Zusammenhänge stellte sich weiterhin heraus, daß das frühe Auftreten der Inhibitorbildung nach ca. sechs Wochen nur bei den Patienten beobachtet worden war, die ausschließlich mit den Präparaten aus bestimmten Chargen behan­ delt worden waren, während Patienten mit einem späteren Auftre­ ten dieser Inhibitorbildung mit Präparationen verschiedener Chargen behandelt worden waren. Es konnte somit mit sehr großer Sicherheit die Schlußfolgerung gezogen werden, daß diese Verun­ reinigungen in den zum Einsatz gekommenen Faktor VIII-haltigen Proteinfraktionen, nämlich Kryopräzipitat einer bestimmten Herkunftsquelle, die Inhibitorbildungen hervorruft. Dabei wurde weiterhin festgestellt, daß diese Inhibitorbildung nicht auf­ getreten ist bei den Patienten, die bereits seit Jahren mit Präparaten der gleichen Herkunft behandelt worden sind, bei denen jedoch der Pasteurisierungsschritt noch nicht durchgeführt wurde. Es ist somit jetzt davon auszugehen, daß diese Bruch­ stücke des Faktor VIII beim Pasteurisierungsschritt Veränderun­ gen erleiden, die dann die Inhibitorbildung verursachen.

Die Erfindung hat sich somit zur Aufgabe gemacht, eine Eig­ nungsprüfung von Faktor VIII-haltigen Proteinfraktionen zu entwickeln, deren Weiterverarbeitungsverfahren einen Pasteuri­ sierungsschritt beinhaltet. Die Aufgabe wird überraschend einfach dadurch gelöst, daß sämtliches Ausgangsmaterial unter­ sucht wird auf Bruchstücke im Bereich von 20 bis 50 kD. Liegen derartige Bruchstücke nicht vor, kann dieses Ausgangsmaterial zur Herstellung eines zweifach virusinaktivierten Produktes eingesetzt werden. Sind hingegen derartige Bruchstücke vorhan­ den, sind zusätzliche Maßnahmen notwendig, um dieses Ausgangsma­ terial zu brauchbaren und nebenwirkungsfreien Präparationen zu verarbeiten.

Eine Möglichkeit zur Weiterverarbeitung besteht, beispielsweise in der Verwendung dieses Ausgangsmaterials für das Verfahren gemäß deutscher Patentanmeldung 196 09 050.4. Dabei erfolgt nach einem chromatographischen Schritt an einem Anionenaustauscher­ material eine Größenausschlußchromatographie (size exclusion chromatography) an hydrophilen Materialien.

Das Verfahren zur Eignungsprüfung von Faktor VIII-haltigen Proteinfraktionen, deren Weiterverarbeitungsverfahren einen Pasteurisierungsschritt beinhaltet, kann beispielsweise erfolgen mittels Elektrophorese oder Gelpermeations-Chromatographie. Enthält dieses Material praktisch keine Bruchstücke im Bereich von 20 bis 50 kD, können weitere Untersuchungen entfallen. Enthält das Material hingegen Bruchstücke in diesem Bereich, kann zusätzlich untersucht werden, ob es sich um Bruchstücke von Faktor VIII handelt. Dies kann beispielsweise erfolgen mit Hilfe von geeigneten Antikörpern. Derartige Antikörper sind im Handel erhältlich, beispielsweise von der Firma Seralab unter der Bezeichnung F VIII-HC (heavy chain) vom Klone 530 p.

Im Rahmen der Untersuchungen der Anmelderin wurde festgestellt, daß diese Bruchstücke des Faktor VIII dann entstehen, wenn das Ausgangsmaterial für Faktor VIII mit Thrombin oder anderen Proteasen reagieren konnte. Anderen Proteasen, die derartige Bruchstücke erzeugen, sind beispielsweise aktivierter Paktor IX oder aktivierter Faktor X. Faktor VIII besitzt ein Molekular­ gewicht von ca. 300 kD. Die handelsüblichen und gut verträgli­ chen Präparationen enthalten darüber hinaus andere Proteine wie den von Willebrand Faktor. Sie enthalten aber nur Spuren von Produkten im Bereich unter 100 kD. In den Ausgangsmaterialien und Endprodukten der Chargen, die zu den Inhibitorbildungen geführt haben, fanden sich hingegen derartige Bruchstücke des Faktor VIII im Bereich zwischen 20 und 50 kD und teilweise sogar noch darunter. Derartige Bruchstücke finden sich hingegen im vermehrten Maße in Ausgangsmaterialien, die bewußt Thrombin oder anderen Proteasen ausgesetzt worden sind. Die kritischen Bruch­ stücke, insbesondere des Faktor VIII finden sich somit in Faktor VIII-haltigen Proteinfraktionen, die bei der Herstellung und Lagerung des Kryopräzipitats unzulässigen Bedingungen ausgesetzt waren.

Erfindungsgemäß ist es somit jetzt möglich, alle Faktor VIII- haltigen Proteinfraktionen einer einfachen Eignungsprüfung zu unterwerfen. Enthält das Ausgangsmaterial keine oder nur geringe Mengen von Bruchstücken im Bereich von 20 bis 50 kD, kann das Material bedenkenlos zur Herstellung von Faktor VIII-Präparaten verwendet werden, die einem Pasteurisierungsschritt unterworfen werden sollen. Die bisher üblichen Methoden der Elektrophorese oder Gelpermeations-Chromatographie sind in der Lage, Mengen derartiger Bruchstücke nachzuweisen, die über 1% bezogen auf den Gehalt von Faktor VIII liegen. Mittels geeigneter Antikörper ist es weiterhin möglich, Bruchstücke des Faktor VIII zu iden­ tifizieren, die in Mengen von etwa 0,1% bezogen auf den Faktor VIII vorliegen. Die Chargen an Kryopräzipitat, die zu der oben genannten Inhibitorbildung geführt haben, enthielten deutlich höhere Mengen derartiger Bruchstücke. Die Anwesenheit derartiger Bruchstücke ist somit bereits durch Elektrophorese und Gelper­ meations-Chromatographie nachweisbar.

Claims (4)

1. Verfahren zur Eignungsprüfung von Faktor VIII-haltigen Proteinfraktionen, deren Weiterverarbeitungsverfahren einen Pasteurisierungsschritt beinhaltet, dadurch gekennzeichnet, daß das Ausgangsmaterial untersucht wird auf Bruchstücke im Bereich von 20 bis 50 kD.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß untersucht wird auf Bruchstücke des Faktor VIII.

3. Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Bruchstücke des Faktor VIII identifiziert werden mit Hilfe von geeigneten Antikörpern.

4. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Untersuchung erfolgt mit Hilfe von Elektrophorese oder Gelpermeations-Chromatographie.