TW496959B - Process for examining suitability of protein fractions containing plasma thromboblasting factor VIII - Google Patents
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Description
經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明(1·) 本發明侧於_细作品質檢查含凝血因子丽蛋白 = 刀之方法’其進_步加工步驟包含有—巴斯德氏殺菌步 ^以及些被I忍為不合適裝料之利用。 规血因子VIII絕大部份由冷;東沉澱物製得。巾請人之 1乃'^下1備·將再溶解之冷;東沉殿物以氫氧化銘純化 以冷去垢㉝將病毒齡化,’並繼之以陰離子交換色 4法處理由於對於病毒減活化作用之安全步驟需要加強 乃附加-巴斯德氏殺菌㈣,即製品在第—個病毒滅活 後’在-穩足劑之存在下,於机±代加熱ι〇小時 Ο ,夕雖然該只有受溶劑/去垢劑方法作病毒滅活化之製品 *夕年來在醫學應用上㊄無問題,但經過附加巴斯德氏殺 =步驟之製品’則在被凝血因子vm作前治療之病人中, 有不可珊之__成。鱗抑條約在六星期或以後 見有關之研先發現’此等抑制劑形成之出現,乃經常 在—些以-個指定裝料治療,或以有指定來源冷滚沉澱物 之裝料治療過之病人中發生。 其他《深入研究顯示,此等裝料有微量但完全可證實 及繁定之因子VI11斷裂片段,其大小在20至50 kD之範圍 間者此等彳U在其他裝料,*且亦不在其他競爭者之 製品中存在。 在發現此關係之後,證實該在約六個星期左右出現之 抑制物形成,係發生於-些以指定裝料治療過之病人中, 而在較後時間方出現抑制物者,乃以不同之裝料治療。因 — III — — — — — — I^ illlln^illn-- (請先閲讀背面之注意事項再填窝本頁) 衣紙張尺度適財國國家標準(CNS)A4規格(】1G X 2S7公釐)" 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 ___________ B7_____ 五、發明說明(2·) ' ===’此等在該含有因子VI11蛋白餾份中 , 似知疋來源,用作醫藥用途冷凍沉澱物中之雜質 物^起抑Γ物之形成者。在此更可繼續證明’此等抑制 病=中,不^"在—些多年來只用一種相同來源製品治療之 出見而此等製品亦為經過巴斯德氏殺菌步驟處理 乂。因此目前可以假設,此等因子VIII片段乃在巴斯择氏 设囷步驟中經歷過變化,而造成抑制物之形成。^ 因此,本發明之任務為,發展一個用作品質檢查含凝 血因子VIII蛋白餘份之方法,其進一步加工步驟包含有一 巴斯“氏殺菌步驟。此任務之完成乃驚人地簡單,因為所 有,過之起始材料中,只有20至50 kD之片段。如沒有 此等片段出現,則此起始材料可採用為一個雙重病毒滅活 化產p口之製備。但若有此等片段出現,則須採取附加措施 ’以將此起始材料加工成為可使用及無副作用之製品。 一個進一步加工之可能為,例如在採用此起始材料時 ’根據德國專利申請案1% 〇9 〇5〇·4之方法採用。在此乃在 色層法步驟後,以一種陰離子交換材料,對親水性材料作 大小排除色層法(size exclusion chromatography )。因此 本發明之内容為,使用一些在一般使用上被人認為不合適 之裝料。 用作品質檢查含凝血因子VIII蛋白餾份之方法,其進 一步加工步驟包含有一巴斯德氏殺菌步驟,例如可以電泳 或明膠參透色層法完成。如果此材料實際上不含範圍在20 至50 kD之片段時,則可不必再檢查。相反地此材料不含 -----------裝--------訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填窝本頁) 本紙用中國國家標準(ci x 2976公爱) 496959 496959 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 ------------ -B7______ — 五、發明說明(3·) 在此範圍中之片段時,則可附加地考究此是否含有因子Vni 之片段。例如此可以合適抗體之幫助來完成。此等抗體可 以在市%上購彳于,例如是由Seraiab公司以f vni_Hc為代 號(重鏈)之種株530。 在此研究範圍内,申請人發現此等因子VIII之片段, 可能在此用作因子νΠΙ之起始材料,跟凝血酶或其他蛋白 酶反應而產生。其他產生此等片段之蛋白酶,乃例如有活 化因子IXf活化因子X。因子vm之分子量約為3〇〇叻 。一般市%上及無特殊反應之製品,更含有其他之蛋白質 ,例如凡維利布蘭特因子(von Willebmnd Faktor)。此等 只含有微量之,顧在⑽奶以下之產品。在此等起始材 料及引起抑制物形成之裝料最終產品中,卻有此等因子聰 之;1乎20至5〇k〇片段,甚至更小者。如果在起始材料中 ,其有意地被加人凝血酶或其他蛋白蹲者,則此等片段相 反地更以增多之份量出現。此等起作用之片段,尤其是因 子viii者,乃在含有因子vm之蛋白館份中出現,而立乃 在製備及儲存該冷滚況殿物時,在不允許之情況下產生者 〇 因此’根據本發明有可能,將所有含因子谓之 館份進仃-侧單之品質檢查。如果此起始材料不本 含少量棚在20至5GkD歧時,航冊可以袖 地用於製造因子谓製品,而其會進行—觀斯德氏; 步驟。縫今常用之電泳或明膠滲透色層法,乃有能 此等片段之份量證f,只要其相應於因子聰之重秦 ------ -------裝--------訂--------- <請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 496959 A7 B7 五、發明說明(4·) 1%便可。使用合適之抗體時,則更可能將相應於因予VIII 之重量,超過0.1%因子VIII之片段檢查出。造成以上抑制 物形成之裝料之冷凍沉澱物,含有明顯較高之此等片段。 此等片段之存在因此乃馬上被電泳及明膠滲透色層法證實 〇 含有根據德國專利申請案196· 09 050.4斷裂片段材料 之使用與進一步加工,可例如透過製備一個高純度、不含 病毒抗血友因子(AHF或因子VIII)之方法完成。此乃使 用一種多步驟之色層方法,其中由已預先純化,含AHF之 餘份或血清起始,在病毒滅活化後一個步驟中,以在最少 一種陰離子交換物質純化完成,而在一個在陰離子交換物 貝上作色層性步驟後,進行一個大小排除色層法而完成。 由可濃縮之含AHF之餾份起始,例如由冷凍製品或亦 由f青而來者,進行一病毒之滅活化。同樣進行者亦有離 子人換物員之清洗。接著乃有一更進一步之純化步驟,而 且作為附著於親水性物品之大小排除色層法 。此步驟之優 點為’由此獲得之餘份,具有一高度專一活性之抗血友因 子(Q子VIII)。驚人之發現為透過此步驟,可將在先前 根據技術現況清潔步驟中,所形成無活性之物質清除,而 不至於影響其產量。 幻排除色層法首先以ρΐι__公司之Sup_e_6 从Ϊ、、^/或他她公司之所謂 Tentake1,FractogebBioSec :進仃1者提及之材料乃尤其對於較高流速之分離較 為奋適。經由縮短分離時間,此等敏感蛋白質之 變性傾向 fei·剌中嶋標準-- -X _ ------------裝--------訂—*----- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) A7 A7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -----~— B7 _ 五、發明說明(5·) ' 一 以減低’而且此等材料具有—高分離能力。可以更有 ,者’為將上述之物質合併使用,即首先以版伽㈣祕沈 仃分離,繼之將製得之餾份以Superose.-6純化。在此乃 優先地規定為,先將材料充塞進館塔中,然後逐一開啟。 衫法料亦有另外,伽,即錢销存在之純 化時’可以達到—個因子聰與儿維利布蘭特因子(讀 )之分離作用。 、本方法不但對於製備,而且對於分析範圍亦適合。此 乃首先將已經進行過大小排除色層法之材料再生,再生作 用最好以一驗性溶液完成。 大小排除色層法乃主要以一種具有滲透壓為3〇〇至 1000 mOsmol/丨,尤其是400至8〇〇 m〇sm〇1/i之洗提劑進行 。此滲透壓乃優先地通過生理上沒問題之鹽類,如氯化鈉 及生理上可被接受之緩衝劑系統,如擰檬酸緩衝劑或鹽酸 組胺酸凋整。此作為大小排除色層法之溶劑系統,酸鹼值 在7至8之間。 以此方式製得之物質,可以馬上使用於病人,而且比 傳統之材料更優越,因為在此獲得之材料有一高度專一之 活性,並因而不被無活性之蛋白餾份所污染。 此根據本方法製得之因子,由於其較高、在技術現況 下無法達到之活性而顯得新穎。 此外,在一般市場上購買之因子VIII製品,根據質量 測試或色原法所測得,含有1〇〇〇國際單位(正)之因子vm 。在此等市場上製品中,含有根據以抗vWF抗體進行免疫 !lli — 一! β·!· (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格(210 X 29g公釐) 496959 Α7 Β7 五、發明說明(6·) 測試之,大約300至600國際單位之vWF。此等製品之蛋 白質含量為5至25 mg蛋白質,其中20至7〇%為活性成份 ,其由一因子VIII/vWF複合物所組成者。其他之蛋白質含 量則在30至80%之間,根據每個裝料中不能清除之活性成 份而異。 圖一係將須純化之樣品溶解於作為注射用之雙重蒸餘水 中之相應色譜圖。 圖一係由因子VIII/vWF組成之複合物,在高濃度氯化j弓 之存在下分解之色層圖。 圖三係因子VIII/vWF複合物跟活性蛋白質混合,以 Fractogel BioSEC (Tentakel)載體之一大小排除色層 法之分離結果示意圖。 圖四係以一種Superose 6之物質進行分離之較佳分離結 果7F意圖。 圖五係一種因子VIII/vWF複合物跟非活性蛋白質混合物 分離之結果示意圖。 圖六係因子VIII/vWF複合物在高濃度鈣離子存在下之半 製品性分離結果示意圖。 圖七係去垢劑或離子被大小排除色層法分離之效果示意 圖。 分析方法係根據下列方式完成: 將需純化之樣品,溶解於4毫升作為注射用之雙重蒸 ^紙張尺度適用^國國家標準(CNS)A4規格(210 χ 釐) i請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) I n ϋ —m 一 δ- I I n n n I ϋ I · 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 496959 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明(7·) 餘水中,每毫升並含有25〇 1£之因子麵。作為大小排除 色層法之分離柱,乃使用特選分析等級之¥_6,並放 置至-具有3〇Ox l〇mm内徑之鱗中。作為流動相者乃採 用2〇〇 mM氯化鋼,以5〇福酸鹼值為7 4 ,渗透壓為魏 至5〇0 mOsmol/Ι之TrisjjCl |周節緩衝。此館塔乃首先以三 倍柱體積(雙蒸餘水洗淨,並在有需要時再生。如果需要 再生,則將再生劑跟相應之酸或驗中和,以三倍柱體積之 250mMTris.HCl洗淨,並調節至pH8 〇。然後將餾塔以三 倍館塔體積之流動相達到平衡。流動相之流動速度約為每 分鐘〇·5 ml。使用之肌C裝置乃由一微_驅動之抽水器 ’及-個UV分譜儀。有時對_成份之檢查,乃在波長 為280 nm下完成ό被分離之餾份乃繼之以一餾份收集器收 集,分析其蛋白質,以及因子VIII與VWF之活性,然後並 以聚丙缔醯胺明膠電泳(SDS_PAGE)展示。此使用之樣品 伤量0·5 ml相應於110至115國際單位之因子。此分 離作用於室溫、壓力為5至15巴下進行。因子yin之回收 ,率為85至95%,而vWF者為70至9〇%。相應之色譜圖 參見圖一。 在氯化_存在下,因子VIII與凡維利布蘭特因子之分離方 法係如下完成: 由因子VIII/vWF組成之複合物,在高濃度氯化鈣之存 在下分解。在製得由vWF分離出來之因子yin時,可以將 已純化之因子VIII/vWF複合物,在一 250 mM之氯化鈣中 冬紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格(210 X 297公釐) -11
(請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝 tr---------Φ. 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 496959 A7 ................- — B7 五、發明說明(8·) 離解。由此產生之分離作用,可因分子大小透過大小排除 色層法完成。此含有因子VIII/vWF複合物之樣品,係由非 活性之蛋白質中純化,並以250 mM氯化鈣滲析。此濃度為 250 IE因子VIII/毫升及150 IE vWF/毫升。在此使用之蛋白 質份量為500微升。使用之餾塔為一以Super〇se 6 (分析等 級)充滿、内徑為300χ10_者。在此情況下,作為流動 相者為一種由250 mM氯化鈣,酸鹼值為7·4之25 mM Tris.HCl溶液’流動速度為每分鐘〇·5毫升。使用之裝置乃 一如上述。因子VIII之回收率為70至80%,而vWF者為 85至95%。色層圖表示於圖二。 半製成品及製品之分離係以下列方式完成·· 上述之分離方式亦可作為半製成品及製品之尺度。在 此作為材料者,可以考慮Fract〇gel Bi〇SEC及Superose 6 ( 製品性餾塔)。以此材料得到之結果參見圖三至圖五。 圖三所示者為因子VIII/vWF複合物跟活性蛋白質混合 ,以Fractogel BioSEC (Tentakel)載體之一大小排除色層 法。分離之條件如下: 餾塔大小:600x26 mm (底床高度:570 mm) 流動相:200 mM NaC卜 50 mM Tris.HC卜 pH 7·4 滲透壓:450 至 500 mOsmol/1 裝置:低壓栗(Pharmacia)及具有一固定波長為280 nm, 及一裝載製品容器之光量計。將餾份收集,並一如 在實例1及實例2中者量度。流動速度為在壓力是 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格(210 X 297公釐) -12- I丨—丨丨丨丨——4^裝!丨丨丨丨訂i丨丨丨----- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 496959 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 ______ B7 ___— _ 五、發明說明(9·) 少於2巴,在室溫下每分鐘1·5毫升。樣品體積為8 毫升,裡面有2000國際單位之因子VIII及1280國 際單位之vWF。產量為90至95%之因子VIII及80 至 90%之 vWF。 在Superose6 (製品等級)載體上乏大小排除色層法係如下 進行: 此分離乃以一種名為Superose6之物質(製品等級)進 行。此館塔大小為600 X 26 mm (底床高度550 mm),而 流動速度為每分鐘1·5毫升,壓力為2至4巴。樣品體積相 應於上述。產量為80至95%之因子VIII及80至95%之 vWF。一如圖四所見者,此分離結果比根據圖三者為佳, 因為以外來蛋白質出現之雜質已大量地減少。 一種因子VIII/vWF複合物跟非活性蛋白質混合物之大小排 除色層法: 一種因子VIII/vWF複合物跟非活性蛋白質混合物之大 小排除色層法,乃在一餾塔縱列中進行,即在各為一半製 品性之 Fractogel BioSEC,及一 Superose 6 (製品等級)餾 塔中順序開啟。此餘塔乃一如上述者。流動速度為每分鐘 1·5毫升,在壓力是少於2巴下進行。樣品體積為15毫升 ,裡面有4500國際單位之因子γΠΙ& 2600國際單位之^^^ 。一如在圖五所見者,該因子VIII/vWF複合物跟非活性蛋 白質混合物之分離非常良好。使用縱列餾塔之優點為, 私紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格(210 X 297公餐) -13- I I I I — — — — — — ---I I I I I ^ « — — — — — — 1« (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 496959 A7 B7 五、發明說明(10·)
Superose 6館塔之阻塞會強烈減少。 因子viii/vWF複合物在高濃度鈣離子存在下之半製品性分 離係如下: 此乃在一餾塔縱列中進行,即在各為一半製品性之 FractogelBioSEC,及一 Superose6_(製品等級)中操作。因 子VIII/vWF複合物之半製品性分離,乃在250 mM躬離子 存在下完成。在此乃處理12毫升,其中有3000國際單位 之因子VIII及1800國際單位之VWF。流動相為一由250 mM 氯化鈣及25 mM Tris.HCl在酸鹼值為7.4之溶液。產量為 90至95%之vWF及75至90%之因子VIII。結果如在圖六 中所示。 以大小排除色層法或轉換緩衝劑分離去垢劑之程如下·· 在圖七可見,去垢劑或離子被大小排除色層法分離之 效果非常良好。因此,以大小排除色層法製得之因子 VIII/vWF複合物餾份,在調整至生理環境或在截取及冷康 乾燥後,直接用於醫藥上。 以上描述之用作純化因子VIII及分離vWF方法,亦可 以進一步用於因子IX (FIX)。有高濃度雜質之FIX可以 分離、純化成為較純之相對活性上昇3至6倍之FIX,而其 產量超過90%。此由FIX分離出之無活性之材料,含有大 部分約為380 kDa之蛋白質。純化之FIX約為60 kDa,而 相對活性為340 IU/mg蛋白質。在一實例中,作為起始材料 本紙張尺i適用中闕家標準(CNS)A4規格(21Q x 297公爱) --- -14- 丨丨丨丨!!丨裝·-------訂-丨丨_丨丨丨丨- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 496959 A7 ----------B7____ 五、發明說明(11·) 者有330 mg之蛋白質(32400IU FIX)。製得之產品為29500 IU (理論上之9丨%),明顯為一體化<FIX。使用之缓衝 劑由2〇mM擰檬酸(pH?·4)、2〇〇福氯化鈉、2mM氯 化鈣組成。流動速度為每小時5 cm,壓力為丨_ 2巴(〇.丨_ Μ MPa) 〇 —丨丨丨丨丨丨丨丨—丨丨—丨丨丨訂·丨丨!ί- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 用 適 度 張 紙_一本 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 10 (2 格 規 A4 S) N (C 準 標 家 laf 國
Claims (1)
- 496959 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 進行一大小排除色層法 -----------裝--------訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格(210 X 297公釐)-17
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Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
GD4A | Issue of patent certificate for granted invention patent | ||
MM4A | Annulment or lapse of patent due to non-payment of fees |