CN1033279A - 尿激酶的回收方法 - Google Patents

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妹尾再起
中原晴行
滨欠隆吉
大庭进
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
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Abstract

本发明涉及尿激酶的回收方法，包括使原尿与碱 处理过的聚丙烯腈超滤膜接触，通过超滤作用进行浓 缩，使尿中的尿激酶吸附在膜上之后再除去浓缩液 (未吸附液)，然后使吸附在膜上的尿激酶透过薄膜而 溶出。该方法可高效率、高纯度、低成本地提取出尿 激酶。

Description

本发明涉及尿激酶的回收方法。
尿激酶是一种存在于人尿以及肾细胞的组织培养液中的酶，其功能在于它能够将人血浆中含有的纤维蛋白溶酶原活化，生成具有溶解血纤维蛋白能力的纤维蛋白溶酶。因此，从人尿中收集、提取出的尿激酶，被广泛地用于各种血栓病或者心肌梗塞等疾病的临床治疗上。不仅如此，最近，人们对尿激酶又有了新的认识，这就是将尿激酶与抗癌药物并用，可以提高抗癌药物的疗效。而且，由于尿激酶是从人尿或肾细胞的组织培养液中提取出来的，所以，它不具有抗原性，也没有抗原体反应所引起的副作用，因此被广泛采用。
但是，由于人尿中只含有微量的尿激酶，所以，高效率地分离、浓缩和提纯尿激酶是一件困难的事。
比如，以前经常用的硅酸盐和硅藻土等矿物质与尿接触，使尿激酶吸附，然后再加以提取的方法，以及通过离子交换色谱分离法回收尿激酶的方法，均操作繁琐，并且一次处理的尿量也很有限，如需要大量回收的话，成本就会变得很高。
使用普通的超滤膜进行浓缩和回收时，由于一部分尿激酶被膜所吸收，所以回收率不佳（40～50%），达不到完全回收的目的。
下面，再列举几个更为具体的问题。
（1）膜具有吸收蛋白质的特性，所以，会使回收量大幅度降低。提高收量，就必须进行一些预处理，如将pH值调至10～11，或者添加抗吸附剂等等。
（2）在浓缩过程中，会发生蛋白质混浊现象，这将会影响下一步的实验。因此必须增加离心或过滤的步骤，以便将混浊物滤掉。
（3）在使用含混浊物较多的尿做原料时，必须用氢氧化钠等进行预处理，以便事先将混浊物除去。
（4）如想从尿中同时提取数种蛋白质，在这一步骤中，分离分子量相近的蛋白质分子（尿激酶、集落形成激发因子或者激肽释放酶）就显得十分困难，只有在下一步骤中，使用色谱分离法，才有可能进行分离。但是，这种方法仍然会引起下述不良结果，这就是：在液态下，如将蛋白质长时间放置，有可能使其丧失活性。
因此在研究如何从尿中高效率地回收尿激酶的处理方法的时候，发明人发现通过采用经过碱处理的聚丙烯腈超滤薄膜，可以一次性地完成从原尿中浓缩和纯化尿激酶的程序。
本发明的原料-尿（原尿）中，含有约1～10IU/ml的尿激酶。
作为载体的超滤膜是用聚丙烯腈系列制成的，其分子量范围以1～5万为好。下面，将列举本发明中可以使用的具体商品的名称。
Daiselu化学工业公司：DUY-H（标准分子量为1万）、DUY-M（同上2万）、DUY-M（同上4万）、PLS-HA1090（同上1万）、PLS-MA（同上2万）、PLS-LA1090（同上4万）。
Millipore公司：PTGC（同上1万）、PTTK（同上3万）。
Amicon公司：H1P10（同上1万）、H1P30（同上3万）、H1P50（同上5万）、H1×50（同上5万）、H5P10（同上1万）、H5P30（同上3万）、H5P50（同上5万）、H10P10（同上1万）、H10×50（同上5万）。
Romicon公司：PM10（同上1万）、XM50（同上5万）。
特别需要指出的是：以选用由丙烯腈和乙烯吡咯烷酮的聚合物制成的聚丙烯腈超滤膜为好。
该物质的化学结构如下所示：
Figure 881030767_IMG1
（式中，X是丙烯腈的组成比，Y是乙烯吡咯烷酮的组成比，X+Y＝1，0.7≤X≤0.9，0.1≤Y≤0.3）
将超滤薄膜用碱处理。碱性物质以0.1～1N的氢化氧物（pH为10～13左右）为好，其中又以氢氧化钠最佳。
调制方法是：将超滤薄膜在碱性溶液中循环10～60分钟后，静置10～20小时;用冷重蒸水将薄膜洗静后，再在原尿中进行循环。这一过程以重复数次为宜。
使用这样处理过的超滤薄膜，进行原尿的处理。
将原尿的pH值调至6～8，再与超滤薄膜相接触，通过该薄膜进行浓缩。条件是：褶型气仓中的操作压以1～5kg/cm2为好。在此条件下，原尿中的尿激酶将吸附在薄膜上。
在pH值6～8、离子强度较低（比如0.01～0.1M左右）的条件下，如果将浓缩液压出，这时可以回收尿激酶以外的尿蛋白（比如集落形成激发因子、激肽释放酶等）。
将浓缩液（未吸附液）除去，在pH值为6～8、离子强度较低（比如0.005～0.05M左右）的条件下将该膜洗静后，再在pH值为6-11、离子强度在0.05～0.3M左右（最好是在0.2～0.3M）的条件下，用与上述浓缩时同样的操作压，将吸附在薄膜上的尿激酶压出，或者通过压力差使之向薄膜的另一侧流出（即通过薄膜）。
这样提纯出来的尿激酶溶出液再按照通常的方法进行脱盐、浓缩和高度纯化等项处理，即可得到可作为医药品使用的尿激酶。
使用本发明的方法，有以下优点：
（1）不需要进行旨在使尿激酶吸附的尿处理。
（2）只需压出超滤薄膜浓缩液，即可简单地将尿激酶与其它尿蛋白分离。
（3）尿激酶的浓缩与提纯可以同时进行。
（4）由于超滤薄膜浓缩液的量较少，所以，可以用于提纯和取得其它蛋白质等多种目的。
（5）可以除去混浊物、内毒素以及细菌。
（6）可以提高尿激酶的回收量和活性，并缩短制造时间。
所以，只需要简单的操作，就可以从尿激酶含量极少、而不纯物含量较高的尿中，高效率、高纯度、低成本地提取出尿激酶。
为了更详细地对本发明加以说明，下面将列举实验例和实施例。但本发明并不受这些例子的限定。
实验例
使用本发明的方法和过去的方法，对回收的尿激酶区带中所含的活菌数及内毒素进行了比较（表1）。
表1
被检查数    平均活菌数    内毒素
过去的方法    8    32个/ml（4～123）    全部为+
本发明法    5    1个/ml（0～3）    全部为-
按照实施例，使用了本发明的方法。
在实施例中，使用过去的方法时，没有将吸附在薄膜上的尿激酶压出这一操作步骤（即没有使其通过薄膜），只将尿激酶溶出液浓缩。
使用琼脂培养基（Nissui公司制或荣研公司制），测定了活菌数;按照JIS标准方法，用鲎试验测定内毒素。
实施例1
将原尿的pH值调至6.0，根据参考例，使用调制过的褶型聚丙烯腈超滤薄膜（分子量为2万、Daiselu公司制）进行浓缩后，在0.01M的磷酸缓冲液（pH7.0）中将其压出，除去浓缩液。再用0.01M的磷酸缓冲液（pH7.0）将薄膜洗净后，用0.05～0.35M的氨，利用压力差使尿激酶从薄膜的另一侧溶出。实验值如表2所示。
表2
液量    IU/ml    活性    回收率    活性
（l） （IU）×103（%） （IU/A280）
原尿    100    8.16    816    100    0.17
超滤薄
膜溶出液    4.8    142.2    681.6    84    436
参考例
在褶型聚丙烯腈超滤薄膜中，将0.1～1N的氢氧化钠循环30分钟后，静置10小时，用冷重蒸水将其洗净，再对原尿进行循环。照此反复5次。

Claims (1)

  1. 尿激酶的回收方法，其特征在于，使原尿与碱处理过的聚丙烯腈超滤膜接触，通过超滤作用进行浓缩，使尿中的尿激酶吸附在膜上之后再除去浓缩液(未吸附液)，然后使吸附在膜上的尿激酶透过薄膜而溶出。
CN88103076A 1987-11-27 1988-05-23 尿激酶的回收方法 Pending CN1033279A (zh)

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