CN108579698B - 一种内毒素特异吸附膜的制备及其在辅助生殖领域的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于辅助生殖领域，具体涉及一种用于内毒素特异吸附膜。本发明的内毒素特异吸附膜具体为：以PVDF中空纤维膜作为载体，多粘菌素B作为吸附剂，其中多粘菌素B以偶联的方式固定于所述载体，PVDF中空纤维膜上偶联HEC，并接枝己二胺间隔臂，所述多粘菌素B与己二胺间隔臂偶联。其可用于去除辅助生殖领域涉及到的各种缓冲液、培养液、操作液等中的内毒素，将内毒素含量有效降低至理想范围，而又不影响有效成分含量。本发明还提供了上述膜用于精子显微操作液去除内毒素时的操作方法。本发明的内毒素特异吸附膜用于辅助生殖领域的培养液去除内毒素，有助于辅助生殖提高胚胎发育率，胚胎形态更好。

Description

一种内毒素特异吸附膜的制备及其在辅助生殖领域的应用

技术领域

本发明属于辅助生殖领域，具体涉及一种偶联多粘菌素B的内毒素特异吸附膜的制备及其在辅助生殖领域的使用方法。

背景技术

内毒素是产生于革兰氏阴性细菌细胞外壁层的脂多糖类物质(LPS)，亦即细菌尸体的碎片。内毒素一般以聚体形式存在，其磷酸基团与二价金属离子螯合可进一步稳定内毒素分子间的聚合，促成更大的内毒素复合体，这类复合体的分子量可由几千至数千万不等。内毒素具有体积小、热稳定性强、化学稳定性强等特性，使其在被去除方面有一定难度。内毒素对细胞培养危害是现在公认的，同样内毒素对辅助生殖里细胞培养也是有害的。

内毒素对细胞的影响根据细胞株种类的不同会有所差异,其影响性主要包括一下几方面：1.改变细胞外形,如造成肝细胞外形改变并引发其吸收六碳糖的能力降低。2.活化细胞,产生讯息传递物质,并影响其下游生物途径反应.如内毒素会活化巨噬细胞使其分泌肿瘤坏死因子(TumorNecrosis Factor,TNF)、干扰素(Interferon,IFN),及白细胞介素1(IL-1)等细胞因子,这些细胞因子作用于宿主下丘脑的体温调节中枢,促使体温升高发热。3.抑制酵素活性,如血管收缩素转化酶(Angiotensin Converting Enzyme)。4.促进或抑制细胞分裂,其效果差异可能与内毒素来源与浓度有关。5.抑制人工受精(In VitroFertilization)的卵子受精率。6.其他方面：如影响细胞附着力、降低肝细胞对胰岛素(Insulin)结合力、降低细胞钾离子流失等。

内毒素主要通过以下几种方式在细胞水平发挥毒性作用：LPS受体及基因控制、激活腺苷酸环化酶、损伤溶酶体膜、破坏线粒体等。

为减小内毒素对细胞的毒性作用，需要去除培养液、水中的内毒素。目前，去除内毒素的方法主要有以下六种：

a)超滤膜和荷电微孔滤膜法

由于内毒素具有较大的相对分子质量，因此可选用超滤膜去除水中的内毒素。超滤膜的孔径及材质的选择，需视被处理药物的相对分子质量、特性、及药品中热原的含量而定。如要截留大部分热原，需采用截留相对分子质量为5000或10000的超滤膜，此时操作过程中的压力较高，另外对部分含有较大相对分子质量成份的医药制剂也不合适。因为在除去热原的同时会阻留或吸附药液中的有效成份，使产品收率大受影响。由于内毒素分子在中性条件下本身带负电荷，因而选择带有正电荷的材质如聚砜、聚丙烯腈、聚酰胺等微孔滤膜可增强对内毒素分子的去除效果，另外，也有人将硅藻土涂渍在纤维素膜上，然后在其上吸附上荷正电聚电解质，用于去除内毒素。但这些荷电微孔滤膜对内毒素的去除效果受pH的影响较大。

b)石棉及活性炭吸附法

活性炭用于去除内毒素是由于内毒素的相对分子质量较大，这种方法适合于组分较为简单的小分子的溶液中或水中内毒素的去除。比较适合纯水溶液中内毒素的去除。但由于活性炭的选择性较差，易吸附有效成份，且纯化后溶液中的残余活性炭不易去除，因此目前已很少使用。

c)化学降解法

化学降解法是指用强酸、强碱或氧化剂等使内毒素降解以达到去除内毒素的目的，主要用于玻璃、塑料和其它高分子材料器皿上内毒素的去除。这种方法有可能造成目标产物的流失、降解或失活，因此对于具有生物活性物质溶液中的内毒素去除显然是不利的。

d)相分离法

采用Triton X-114从大量重组体蛋白制品中去除内毒素，利用这种相分离法，对内毒素的去除率达99％以上，对蛋白质的回收率大于90％，且不影响有效成份的活性。

但此方法中用到的Triton X-114成分对胚胎有致死性，而且比内毒素效果更强，所以辅助生殖领域不宜采用此方案。

e)离子交换色谱法

离子交换色谱法是根据内毒素带有部分负电荷的性质，用阴离子交换色谱来去除内毒素，但这种方法不适合于溶液中存在其它带负电荷物质的情况。如二乙基胺乙基(DEAE)。

f)亲和色谱法

亲和色谱法是利用物质的生物学特性来达到物质的分离，是去除内毒素的一种较为理想的方法。只要采用适当的配基，将它固载于亲和色谱的基质上合成出亲和介质，就可使它成为一种去除内毒素的高效能、高选择性方法。相对于上述方法来说，亲和色谱法具有其显著的优越性，去除率高、选择性好。

目前去除内毒素的方法较多，但仍然存在去除率不够高的问题，以及没有适用于辅助生殖领域的内毒素去除方法。内毒素对IVF-ET(体外受精-胚胎移植)影响是巨大的，能有效降低降低IVF-ET系列产品中内毒素含量而又不降低产品中有效成分含量是现在存在的技术问题，解决此问题有助于辅助生殖提高胚胎发育率，甚至提高妊娠率，现在有关报道去除内毒素方法很多。医药，器械等行业都有相关专利与文献报道如何去除内毒素，但是辅助生殖领域未检索到相关报道。

因此开发一种可应用于辅助生殖系列产品的内毒素特异吸附膜，膜上偶联多粘菌素B，其能有效将培养液中内毒素含量降低至理想范围，而又不影响有效成分含量，提高胚胎形成率，胚胎形态完美。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种内毒素特异吸附膜，其能有效将溶液中内毒素含量降低至理想范围，而又不影响有效成分含量。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

一种内毒素特异吸附膜，其以PVDF中空纤维膜作为载体，该载体固定化结合吸附剂多粘菌素B，其中多粘菌素B以偶联的方式固定于所述载体，具体为：所述PVDF中空纤维膜上偶联HEC(羟乙基纤维素)，并接枝己二胺间隔臂，所述多粘菌素B与己二胺间隔臂偶联。

PVDF膜即聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride),本发明使用的PVDF中空纤维膜具有装填密度高、比表面积大、无需支撑体、可反向清洗等优点。

研发对比将丝氨酸，精氨酸等各种氨基酸和一些带阳离子基团的物质修饰到PVDF膜上效果都不理想，只能极少吸附内毒素，且样品中内毒素含量降低量不超过10％，最终我们选择了多粘菌素B作为内毒素去除基团，但是一般都是用琼脂糖凝胶作为载体，这不适用于培养液过滤，且会截留培养液中蛋白成分。所以我们选择PVDF膜作为载体，并修饰上多粘菌素B，制成一种内毒素特异吸附膜。

本发明将带阳离子基团的吸附剂-多粘菌素B(PMB)偶联固定于聚偏氟乙烯(PVDF)中空纤维膜合成特异吸附膜，其能有效将培养液中内毒素含量降低至理想范围，而又不影响有效成分含量，当用于辅助生殖系列产品中，能够提高胚胎形成率。

本发明的目的之二在于提供一种目的一的内毒素特异吸附膜的制备方法，其将多粘菌素B偶联于PVDF中空纤维膜中。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

在强碱/强氧化剂(KOH/KMnO₄)条件下将PVDF膜氧化、脱氟，然后在酸性的环境下用NaHSO₃还原PVDF膜，使PVDF膜表面生成亲水性多元醇。在以碱性体系处理的PVDF中空纤维膜为基质，将亲水性物质经乙基纤维素(HEC)偶联到PVDF膜上，环氧氯丙烷活化后，接枝上己二胺间隔臂，多粘菌素B在戊二醛活化下会与乙二胺间隔臂偶联。

内毒素特异吸附膜的制备方法，具体包括以下步骤：

1)去除PVDF中空纤维膜表面的杂质；

2)亲水改性：在KOH和KMnO₄条件下将PVDF中空纤维膜氧化、脱氟,然后在酸性的环境下用NaHSO₃还原PVDF膜,使PVDF膜表面生成亲水性多元醇，得到亲水的PVDF中空纤维膜；

3)羟乙基纤维素偶联：以碱性体系处理步骤2)的亲水的PVDF中空纤维膜,将羟乙基纤维素偶联到PVDF膜上，得到偶联羟乙基纤维素的PVDF中空纤维膜；

4)活化：环氧氯丙烷活化步骤3)的偶联羟乙基纤维素的PVDF中空纤维膜；

5)己二胺接枝：活化后，接枝己二胺间隔臂；

6)多粘菌素B偶联：戊二醛的浓度为5％条件下，多粘菌素B与己二胺间隔臂偶联，得内毒素特异吸附膜。

作为优选的方案，上述制备方法可优化为：

1)去除PVDF中空纤维膜表面的杂质；

2)亲水改性：将KMnO₄和KOH的水溶液在80℃泵入PVDF中空纤维膜组件反应30min,然后用H₂SO₄和NaHSO₃的水溶液还原，使PVDF膜表面生成亲水性多元醇，得到亲水的PVDF中空纤维膜；

3)羟乙基纤维素偶联：步骤2)的膜用NaOH和羟乙基纤维素的水溶液90℃处理10min,羟乙基纤维素偶联到膜上；后烘干，用Na₂CO₃溶液冲洗,洗去膜表面未反应的羟乙基纤维素；

4)活化：步骤3)处理后的膜用环氧氯丙烷与1mol/lNaOH按照1:4的体积比混合后的溶液在60℃条件下活化,用去离子水冲洗；

5)己二胺接枝：步骤4)的膜于60℃下与己二胺溶液作用后,滴加氢氧化钠溶液，搅拌反应后过滤，洗涤至中性，用乙醇提取后真空干燥，用0.1mol/l NaCl溶液抽滤、洗涤5～6次，冲洗；

6)多粘菌素B偶联：加入偶联缓冲液，向缓冲液中加入适量的NaCNBH₃，搅拌加入戊二醛水溶液，使反应体系中戊二醛的浓度为5％，室温下搅拌反应；多粘菌素B浓度为5mg/ml的偶联缓冲液中，加入适量的NaCNBH₃，在室温下与膜反应4小时以上,冲洗，自然风干得内毒素特异吸附膜；

其中偶联缓冲液：0.1mol/lNa₃PO₄，0.15mol/lNaCl的水溶液，其pH为7.0。

作为优选的方案，步骤1)的具体过程为：将PVDF中空纤维膜用体积含量为30％的乙醇水溶液润洗30min后,用去离子水浸泡1h。

作为优选的方案，步骤2)中，所述KMnO₄和KOH的水溶液浓度为：KMnO4的质量-体积百分浓度为4％、KOH 3mol/l；所述H₂SO₄和NaHSO₃的水溶液浓度为：H₂SO₄的体积含量为5％、NaHSO₃的质量-体积百分浓度为5％。

作为优选的方案，步骤3)中，所述NaOH和HEC的水溶液浓度为：NaOH1mol/l、HEC的质量-体积百分浓度为1.5％；所述Na₂CO₃溶液浓度为：0.5mol/l。

作为优选的方案，步骤5)中，所述己二胺溶液为：质量-体积百分浓度为5％的己二胺水溶液。

作为优选的方案，步骤5)中，所述洗涤至中性过程为：依次用水、5％盐酸、水、5％氢氧化钠、水洗涤至中性；所述冲洗过程为：用水和偶联缓冲液冲洗膜。

作为优选的方案，步骤6)中所述冲洗过程为：用偶联缓冲液、水、1mol/l NaCl溶液和水冲洗PVDF中空纤维膜。

本发明的目的之三在于提供一种目的一的内毒素特异吸附膜在用于去除溶液中内毒素的应用。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

本发明的内毒素特异吸附膜可应用于溶液的内毒素去除。

作为优选的方案，上述溶液为辅助生殖领域的培养液、缓冲液、冷冻液、解冻液、离心液及操作液。

进一步，作为优选的方案，上述溶液为精子显微操作液。

本发明的目的之四在于提供一种本发明的内毒素特异吸附膜用于去除精子显微操作液中内毒素的方法，其能降低内毒素，又不影响有效成分含量，有助于提高胚胎形成率，得到形态更好的胚胎。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

因为精子显微操作液中的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)分子量较大，很难通过膜过滤除内毒素，所以在配置过程单独用碱液有效降低内毒素含量，而精子显微操作液的基础液不能用pH值过大的碱液除内毒素，所以用特异吸附膜除内毒素，两者结合既能降低内毒素，又不影响有效成分含量。

操作方法具体包括一下步骤：

1)将精子显微操作基础液用目的一的内毒素特异吸附膜过滤，重复2～5次，得去除内毒素的精子显微操作基础液；

2)用0.75mol/l NaOH水溶液浸泡聚乙烯吡咯烷酮(PVP)30min，然后调节pH至中性，得去除内毒素的PVP；

3)将步骤1)，2)的去除内毒素的精子显微操作基础液和PVP按照比例混匀，得去除内毒素的精子显微操作液。

本发明的目的之五在于提供一种目的四的方法获得的去除内毒素的精子显微操作液。

本发明的有益效果在于：本发明提供的内毒素特异吸附膜：

1)多粘菌素B偶联固定于PVDF中空纤维膜，多粘菌素B有明显的抗内毒素作用，作为吸附剂吸附内毒素。

2)可应用于辅助生殖领域的系列产品，去除辅助生殖领域涉及到的各种缓冲液、培养液、操作液中的内毒素，能将精子显微操作液中内毒素降低至0.02EU/ml，有助于提高胚胎形成率。

3)本发明还提供了内毒素特异吸附膜的制备方法。

4)以精子显微操作液为例，提供了内毒素特异吸附膜的使用方法。与化学降解法结合，既将内毒素含量有效降低至理想范围，而又不影响有效成分含量。

具体实施方式

以下将对本发明的优选实施例进行详细描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，所举实施例是为了更好地对本发明的内容进行说明，但并不是本发明的内容仅限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。

使用试剂的说明：

本发明使用的试剂除下面提及外均购自上海麦克林生化科技有限公司公司；

多粘菌素B购自：华美生物工程公司北京分公司；

PVDF中空纤维膜购自：BIOFIL，其它性质：无DNase，RNase，无热源。

实施例1内毒素特异吸附膜的制备

1)去杂质

将PVDF中空纤维膜(聚偏二氟乙烯膜)用30％乙醇润洗30min后,用去离子水浸泡1h,以洗去膜表面的杂质。

2)亲水改性

将4％(w/v)的KMnO₄和3mol/l的KOH混合液在80℃下用恒流蠕动泵入PVDF中空纤维膜组件反应30min,然后用5％(v/v)H₂SO₄和5％(w/v)NaHSO₃混合液还原。

3)偶联HEC

还原处理后的膜用1mol/l NaOH和1.5％(w/v)的HEC混合液在90℃处理10min,以增加膜表面的亲水性。并置于90℃恒温热风干燥箱内烘干,干燥后用0.5mol/l的Na₂CO₃溶液在90℃条件下冲洗10min,洗去PVDF膜表面未反应的HEC。

4)活化

亲水化改性的膜用25ml环氧氯丙烷(ECH)/100ml 1mol/LNaOH混合液在60℃条件下活化,并用去离子水冲洗。

5)接枝HDA

然后于60℃下与5％(w/v)的己二胺(HDA)作用2h后,滴加5％氢氧化钠溶液，于30-60℃搅拌反应8小时后过滤，依次用水，5％盐酸、纯水、5％氢氧化钠、纯水洗涤至中性，用乙醇提取8小时，真空干燥，用0.1mol/l NaCl溶液抽滤、洗涤5-6次，用水和偶联缓冲液冲洗后加入80ml偶联缓冲液并混匀，

6)偶联多粘菌素B

加入适量的NaCNBH₃，再在搅拌状态下加入20ml 25％的戊二醛，室温下搅拌反应至少4小时。如果加入100ml偶联缓冲液不够，可增加缓冲液的用量，但要保证整个反应体系中戊二醛的最终浓度要为5％。加入PMB(多粘菌素B)浓度为5mg/ml的配体偶联缓冲液，加入适量的NaCNBH₃(氰基硼氢化钠),在室温下反应至少4小时,用偶联缓冲液，水，1M NaCl和水冲洗滤膜。自然风干得内毒素特异吸附膜。

其中偶联缓冲液：0.1mol/l Na₃PO₄，0.15mol/l NaCl的水溶液，其pH为7.0。

实施例2精子显微操作液配置

1)将精子显微操作基础液用上诉内毒素特异吸附膜过滤，反复三次。

2)用0.75mol/LNaOH溶液浸泡聚乙烯吡咯烷酮(PVP)30min，然后调节PH至中性。

3)将1)，2)步骤按照比例混匀，得低内毒素精子显微操作液。

实施例3效果检测

1.内毒素检测方法

鲎试剂法，按照《中华人民共和国药典》2015年版“细菌内毒素检测法(凝胶限度实验)”进行。

对本发明的内毒素特异吸附膜的吸附能力进行检测。

对实施例2的低内毒素精子显微操作液，在使用本发明的内毒素特异吸附膜前后分别进行检测。

2.检验结果

本发明合成的内毒素特异吸附膜最大吸附内毒素能力45ug/cm²。

实施例2的精子显微操作液检测结果，见表1：

表1精子显微操作液的检测结果

检测结果：采用本发明处理前，样品内毒素含量大于0.15EU/ml,采用本发明处理样品后，样品中内毒素含量小于0.02EU/ml。

因此，本发明的内毒素特异吸附膜能够将内毒素含量有效降低至理想范围，应用于辅助生殖领域时，有助于提高胚胎形成率。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (9)

1.一种内毒素特异吸附膜，其特征在于，所述内毒素特异吸附膜以PVDF中空纤维膜作为载体，多粘菌素B作为吸附剂，其中多粘菌素B以偶联的方式固定于所述载体，具体为：所述PVDF中空纤维膜上偶联羟乙基纤维素，并接枝己二胺间隔臂，所述多粘菌素B与己二胺间隔臂偶联。

2.权利要求1所述内毒素特异吸附膜的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)去除PVDF中空纤维膜表面的杂质；

2)亲水改性：在KOH和KMnO₄条件下将PVDF中空纤维膜氧化、脱氟,然后在酸性的环境下用NaHSO₃还原PVDF膜,使PVDF膜表面生成亲水性多元醇，得到亲水的PVDF中空纤维膜；

3)羟乙基纤维素偶联：以碱性体系处理步骤2)的亲水的PVDF中空纤维膜,将羟乙基纤维素偶联到PVDF膜上，得到偶联羟乙基纤维素的PVDF中空纤维膜；

4)活化：环氧氯丙烷活化步骤3)的偶联羟乙基纤维素的PVDF中空纤维膜；

5)己二胺接枝：活化后，接枝己二胺间隔臂；

6)多粘菌素B偶联：戊二醛的浓度为5％条件下，多粘菌素B与己二胺间隔臂偶联，得内毒素特异吸附膜。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)去除PVDF中空纤维膜表面的杂质；

2)亲水改性：将KMnO₄和KOH的水溶液在80℃泵入PVDF中空纤维膜组件反应30min,然后用H₂SO₄和NaHSO₃的水溶液还原，使PVDF膜表面生成亲水性多元醇，得到亲水的PVDF中空纤维膜；

3)羟乙基纤维素偶联：步骤2)的膜用NaOH和羟乙基纤维素的水溶液90℃处理10min,羟乙基纤维素偶联到膜上；后烘干，用Na₂CO₃溶液冲洗,洗去膜表面未反应的羟乙基纤维素；

4)活化：步骤3)处理后的膜用环氧氯丙烷与1mol/LNaOH按照1:4的体积比混合后的溶液在60℃条件下活化,用去离子水冲洗；

5)己二胺接枝：步骤4)的膜于60℃下与己二胺溶液作用后,滴加氢氧化钠溶液，搅拌反应后过滤，洗涤至中性，用乙醇提取后真空干燥，用0.1mol/LNaCl溶液抽滤、洗涤5～6次，冲洗；

6)多粘菌素B偶联：加入偶联缓冲液，向缓冲液中加入适量的NaCNBH3，搅拌加入戊二醛水溶液，使反应体系中戊二醛的浓度为5％，室温下搅拌反应；加入多粘菌素B浓度为5mg/ml的偶联缓冲液中，加入适量的NaCNBH3，在室温下与膜反应4小时以上,冲洗，自然风干得内毒素特异吸附膜；所述偶联缓冲液：0.1mol/lNa3PO4，0.15mol/lNaCl的水溶液，其pH为7.0。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤1)的具体过程为：将PVDF中空纤维膜用体积含量为30％的乙醇水溶液润洗30min后,用去离子水浸泡1h。

5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤3)中，所述NaOH和羟乙基纤维素的水溶液浓度为：NaOH1mol/l、羟乙基纤维素的质量-体积百分浓度为1.5％。

6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤5)中，所述己二胺溶液为：质量-体积百分浓度为5％的己二胺水溶液。

7.权利要求1所述内毒素特异吸附膜在用于去除溶液中内毒素的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述溶液为精子显微操作液。

9.权利要求8所述应用的操作方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)将精子显微操作基础液用权利要求1所述内毒素特异吸附膜过滤，重复2～5次，得去除内毒素的精子显微操作基础液；

2)用0.75mol/lNaOH水溶液浸泡聚乙烯吡咯烷酮(PVP)30min，然后调节pH至中性，得去除内毒素的PVP；

3)将步骤1)，2)的去除内毒素的精子显微操作基础液和PVP按照比例混匀，得去除内毒素的精子显微操作液。