CN101544776B - 高密度糖基化聚丙烯亲和膜的制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种高密度糖基化聚丙烯亲和膜的制备方法,是以聚丙烯微孔膜为基体,以二苯甲酮为光引发剂,在紫外光辐照下接枝丙烯酸或甲基丙烯酸,通过控制引发剂浓度、接枝时间、单体浓度得到不同接枝率的聚丙烯微孔膜;再通过含炔基的胺或醇与膜表面的羧基反应,得到表面含有炔基的聚丙烯微孔膜;然后利用点击化学反应,将叠氮糖与膜表面的炔基偶联,得到了表面具有高密度糖基的聚丙烯亲和膜。本发明利用点击化学反应将糖基固定在膜表面,大大提高了膜表面的糖基化密度,且操作简单、反应条件温和、产率高、制备的产物稳定。本发明的高密度糖基的化聚丙烯亲和膜更易于实现糖与蛋白识别的集簇效应,提高了蛋白质的分离、浓缩或靶向清除的效果。
Description
技术领域
本发明涉及聚丙烯亲和膜的制备方法及应用,尤其涉及一种利用点击化学反应,将叠氮糖基固定在接枝改性的聚丙烯微孔膜上制备高密度糖基化聚丙烯亲和膜的方法,以及该聚丙烯亲和膜在蛋白质分离或纯化等领域的应用。
背景技术
聚丙烯膜具有表面能低、结晶度高、无毒、化学稳定性好等优点,已成为现代工业中大规模生产应用的高分子材料。此外,聚丙烯原料经济,加工性能优异,可以通过拉伸、热致相分离等方法方便地成孔,因此被广泛应用于制备各种用途的分离膜。但是由于其表面的惰性、亲水性较差,在用作膜分离材料时,容易发生膜污染现象,特别是用于生物医用领域以及其它与生物分子接触的环境时,聚丙烯膜会与生物分子发生作用,导致蛋白质、血小板等在膜表面大量的吸附,造成膜的污染,严重影响膜的性能。表面改性可优化膜分离材料的表面性能并且不会破坏它的本体性能,提高膜分离材料的使用效率,延长膜的使用寿命;而糖基具有良好的亲水性和抗非特异性吸附能力,可以改善聚丙烯膜的表面性能,并拓展其应用领域。此外,将糖基化修饰层对特定蛋白质的特异性识别作用与具有良好机械性能的聚丙烯膜的分离功能相结合,得到一种新颖的具有生物识别作用的分离膜材料,将在蛋白质选择性分离、浓缩、手性拆分、病毒的特异性捕捉等方面具有广阔的应用前景。
糖与蛋白质都是重要的生物信息分子,在生物体内,很多重要的生理过程都是通过糖与蛋白质的相互作用而实现的。利用糖的生物相容性以及对蛋白识别作用,将糖基引入高分子材料中,在食品检测、医药、蛋白质分离等领域也取得了一定进展。
公开号为CN1460524的中国发明专利中制备了一种α~烯丙基葡糖苷表面修饰的人工晶状体,这种白内障囊外摘除术的人工晶状体光学部和袢的外表面均带有α~烯丙基葡糖苷单体的分子层,具有良好的生物相容性,且制法科学、医用移植安全可靠。
公开号为CN1401665的中国发明专利申请中利用壳聚糖具有高度的生物相容性、生物降解性以及抗凝血活性等优良特性,将其作为底物构建了一种人工血管的生物医用材料。
公开号为CN1773636的中国发明专利中用羧基多糖对四氧化三铁纳米颗粒进行表面改性,由于羧基多糖的无毒、生物相容性好特点,易与药物、细胞、蛋白质或基因进行连接,适用于作为磁靶向药物载体、磁性液体细胞内热疗、核磁共振对比显像剂、磁分离等生物医学领域。
公开号为CN1935342的中国发明专利中利用紫外接枝2-甲基丙烯酸羟乙酯(HEMA),然后利用HEMA羟基将糖基固定在聚丙烯膜上,通过糖基对凝集素的识别作用,从而达到良好的吸附分离效果。
糖与蛋白的识别是多个糖基与蛋白质共同作用的结果,即所谓的“集簇效应”,因此提高糖基密度,可以对蛋白质的选择性分离、手性拆分起到良好的效果,而目前现有技术制备的膜其表面接枝糖基密度较低,有待进一步深入研究。
近年来,点击化学反应以其独特的优点而被广泛应用于各个领域,其特点是反应模块化,主要体现在Huisgen 1,3-偶极环加成反应上,即叠氮化合物与炔基化合物反应生成含有三唑杂环的化合物,其具有反应条件温和,反应有立体选择性,反应过程对氧气和水不敏感,效率高,基本可以达到定量化反应,产物单一、易分离并且在生理条件下稳定等优点,在合成化学,生物制药,材料科学等领域被广泛应用。
将点击化学反应应用于材料表面改性(Macromolecules,2007,40,7513-7520),大大提高了材料表面的反应效率,在材料中引入更多的功能性基团,更好的实现了材料改性的目的,可应用于生物传感器、治疗载体、细胞培养、蛋白质的选择性吸附分离等方面。
发明内容
本发明提供了一种高密度糖基化聚丙烯亲和膜的制备方法,利用1,3-偶极环加成反应进行糖基的膜表面固定化,由于1,3-偶极环加成反应定量化的反应产率大大提高了糖基在膜表面的密度,制得高密度糖基化聚丙烯亲和膜,以克服现有技术中膜表面接枝糖基密度较低的缺点。
一种高密度糖基化聚丙烯亲和膜的制备方法,包括如下步骤:
(1)在光引发剂作用下,通过紫外辐照将丙烯酸或甲基丙烯酸单体接枝到聚丙烯微孔膜表面,得到接枝改性的聚丙烯微孔膜;
(2)在催化剂作用下,将含炔基的胺或含炔基的醇与步骤(1)中得到的接枝改性的聚丙烯微孔膜表面的羧基反应,得到表面固定炔基的聚丙烯微孔膜;
(3)利用1,3-偶极环加成反应将叠氮糖与步骤(2)中得到的表面固定炔基的聚丙烯微孔膜表面的炔基偶联,得到高密度糖基化聚丙烯亲和膜。
所述高密度糖基化聚丙烯亲和膜的制备方法,可具体包括如下步骤:
(1)将聚丙烯微孔膜在光引发剂溶液中浸泡后取出自然晾干,再浸入丙烯酸单体的水溶液或甲基丙烯酸单体的水溶液中,通过紫外光辐照接枝聚合10~60分钟后取出,经洗涤、烘干得到表面接枝改性的聚丙烯微孔膜,单体接枝率为1~98克/平方米膜;
所述的光引发剂溶液中光引发剂的浓度为0.001~0.010摩尔/升,其原因在于引发剂浓度决定表面接枝密度,但过高的引发剂浓度也会阻碍单体向膜孔内扩散,影响膜孔内糖基接枝量;
由于单体浓度决定单体在聚丙烯微孔膜表面的接枝密度,但单体浓度过高会造成接枝过程中溶液自聚,降低接枝率,从而影响表面糖基密度,单体浓度过低亦会降低接枝率,从而影响表面糖基密度。为了得到较高密度糖基化聚丙烯亲和膜,所述的丙烯酸单体的水溶液中单体的体积百分浓度优选为2%~55%,甲基丙烯酸单体的水溶液中单体的体积百分浓度优选为2%~55%;
(2)将步骤(1)中得到的接枝改性的聚丙烯微孔膜浸入pH值为5.0~6.5的缓冲溶液中,加入含炔基的胺或含炔基的醇,以及催化剂,在氮气保护下,室温振荡反应12~36小时后取出,经洗涤、烘干得到表面固定炔基的聚丙烯微孔膜,炔基固定率为0.26~32克/平方米膜;
其中,含炔基的胺或含炔基的醇的加入量为:含炔基的胺或含炔基的醇与聚丙烯微孔膜表面羧基的摩尔比为2~10;其原因在于步骤(2)中的反应为固体表面与溶液的非均相反应,使其中一种反应物含炔基的胺或含炔基的醇大大过量,有利于非均相反应的充分进行;
(3)将步骤(2)中得到的表面固定炔基的聚丙烯微孔膜浸入叠氮糖溶液中,在氮气保护下加入1,3-偶极环加成反应催化剂,室温下振荡反应24~48小时后取出,经洗涤、烘干得到高密度化聚丙烯亲和膜,糖基固定率为0.98~197克/平方米膜;
其中,叠氮糖的加入量为:叠氮糖与聚丙烯微孔膜表面炔基的摩尔比为2~10。其原因在于步骤(3)中的反应为固体表面与溶液的非均相反应,使其中一种反应物叠氮糖大大过量,有利于反应充分进行。
由于通过改变聚丙烯微孔膜的孔径、孔隙率以及厚度可以广泛调节聚丙烯微孔膜表面的糖基化密度,为了得到糖基密度较高的聚丙烯亲和膜,所述的聚丙烯微孔膜优选平均孔径为0.1~2微米,孔隙率为40~85%,膜厚为150~200微米的聚丙烯微孔膜。
所述的光引发剂溶液可选用本领域常规的光引发剂溶液,优选二苯甲酮的正庚烷溶液,其中,光引发剂为二苯甲酮(BP),由于正庚烷可以轻微溶胀聚丙烯微孔膜,使得接枝更容易发生在聚丙烯微孔膜的膜孔内,提高接枝单体固定在聚丙烯微孔膜上的稳定性。
采用含炔基的胺或含炔基的醇,是为了通过其中含有的氨基或羟基与接枝改性的聚丙烯微孔膜表面的羧基反应,将炔基固定到聚丙烯微孔膜表面。
由于小分子直链炔基胺或炔基醇更容易扩散到膜孔内,使反应更容易发生在膜孔内,所述的含炔基的胺优选丙炔胺,含炔基的醇优选丙炔醇。
所述的缓冲溶液为磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲溶液(即PBS缓冲溶液)。
步骤(2)中,所述的催化剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS),其中EDC与NHS的摩尔比为0.5~2,EDC与聚丙烯微孔膜表面羧基的摩尔比为2~10。
在1,3-偶极环加成反应催化剂的作用下,叠氮糖能够与聚丙烯微孔膜表面的炔基发生1,3-偶极环加成反应,使叠氮基团与炔基偶联,从而引入糖基并将其固定在聚丙烯微孔膜的表面。
所述的叠氮糖可选用任何叠氮单糖、叠氮二糖、叠氮三糖等中的一种,考虑叠氮单糖、叠氮二糖的空间体积较小,更容易扩散到膜孔内,因此本发明叠氮糖优选1-叠氮基葡萄糖、2-叠氮乙基葡萄糖、3-叠氮丙基葡萄糖、2-叠氮乙基甘露糖、2-叠氮乙基半乳糖或2-叠氮乙基乳糖。
步骤(3)中,叠氮糖溶液中的溶剂为水与叔丁醇的混合溶液,其中叔丁醇与水的体积比可为1~4。
步骤(3)中,1,3-偶极环加成反应催化剂为五水硫酸铜和抗坏血酸钠,五水硫酸铜与聚丙烯微孔膜表面炔基的摩尔比为0.02~0.1,抗坏血酸钠与聚丙烯微孔膜表面炔基的摩尔比为0.1~1。
本发明的高密度糖基化聚丙烯亲和膜可应用在蛋白质的分离、浓缩、靶向清除、鉴定或病毒的特异性捕捉中,还可以应用于微生物的分离、浓缩,以及细胞培养、医疗器械等领域。
本发明中接枝率、炔基固定率或糖基固定率均采用如下称重法计算:接枝率、炔基固定率或糖基固定率用Y表示:
Y=(W1-W0)/S;
Y的单位为:克/平方米,其中,W0为接枝反应、炔基固定反应或糖基固定反应前聚丙烯微孔膜的重量,W1为接枝反应、炔基固定反应或糖基固定反应后聚丙烯微孔膜的重量,S为接枝反应、炔基固定反应或糖基固定反应前膜的面积。
本发明的优点在于:
(1)通过调节紫外辐照接枝聚合条件,可方便的调节单体在聚丙烯微孔膜上的接枝率,从而控制聚丙烯膜上的糖基固定率。
(2)利用高效的1,3-偶极环加成反应,可得到高密度的糖基化聚丙烯亲和膜,易于实现膜表面糖基的集簇效应,显著增强了糖基对蛋白质的选择性吸附效果;同时,这种高密度糖基化的聚丙烯亲和膜可适用于高浓度蛋白质溶液中蛋白质的分离和浓缩,使用范围广。
(3)各个反应的反应条件均很温和,操作简单,原料易得,经济可行。
(4)1,3-偶极环加成反应具有高度的专一性且反应温和,无需对糖上的羟基进行保护。
(5)得到的聚丙烯亲和膜表面固定了大量的糖基,使得膜具有良好的亲和性与生物相容性,大大提高了膜的抗污染能力,在生物医用材料方面具有良好的应用前景。
(6)本发明方法是利用化学键将糖基固定在膜表面(即糖基通过三唑类五元环连接在膜表面),在使用过程中性能稳定,糖基不会脱落,在蛋白质的选择性分离、浓缩或靶向清除过程中,可通过吸附、洗脱的方式循环使用,大大降低了生产成本。
附图说明
图1为葡萄糖糖基化聚丙烯亲和膜的分子结构示意图;
图2为甘露糖糖基化聚丙烯亲和膜的分子结构示意图。
具体实施方式
实施例1
称取适量的BP溶解在正庚烷中,配成BP浓度为0.005摩尔/升的光引发剂溶液,将直径为3.95厘米的聚丙烯微孔膜(其平均孔径为0.2微米,孔隙率为80%,膜厚为160微米)浸入到光引发剂溶液中,浸泡1小时后取出自然晾干,然后将聚丙烯平板微孔膜浸入单体体积浓度为2%的丙烯酸单体溶液中,紫外光辐照10分钟后取出,用丙酮和大量水清洗后,放入40℃烘箱,真空干燥24小时,得到接枝率为1.00克/平方米膜的丙烯酸接枝改性的聚丙烯微孔膜。
将上述丙烯酸接枝改性的聚丙烯微孔膜置入pH为5.0的PBS缓冲溶液中,加入NHS、EDC和丙炔胺,其中聚丙烯微孔膜表面的羧基、EDC、NHS以及丙炔胺的摩尔比为1∶2∶1∶2,氮气保护下,室温振荡反应12小时后停止反应,用丙酮和水洗涤后,放入40℃烘箱,真空干燥24小时,得到表面固定炔丙基的聚丙烯微孔膜,炔基固定率为0.26克/平方米膜。
将上述表面固定炔丙基的聚丙烯微孔膜浸入1-叠氮基葡萄糖的水/叔丁醇(其中,水、叔丁醇的体积比1∶1)溶液中,加入抗坏血酸钠和五水硫酸铜,其中聚丙烯微孔膜表面炔基、1-叠氮基葡萄糖、五水硫酸铜和抗坏血酸钠的摩尔比为1∶2∶0.02∶0.1,在氮气保护下,室温振荡反应24小时后停止反应,用水洗涤后,放入40℃烘箱,真空干燥24小时,得到高密度糖基化聚丙烯亲和膜,糖基固定率为0.98克/平方米膜。
实施例2
称取适量的BP溶解在正庚烷中,配成BP浓度为0.001摩尔/升的光引发剂溶液,将直径为3.95厘米的聚丙烯微孔膜(其平均孔径为0.5微米,孔隙率为45%,膜厚为150微米)浸入到光引发剂溶液中,浸泡1小时后取出自然晾干,然后将聚丙烯微孔膜浸入单体体积浓度为5%的丙烯酸单体溶液中,紫外光辐照20分钟后取出,用丙酮和大量水清洗后,放入40℃烘箱,真空干燥24小时,得到接枝率为2.38克/平方米膜的丙烯酸接枝改性的聚丙烯微孔膜。
将上述丙烯酸接枝改性的聚丙烯微孔置入pH为5.5的PBS缓冲溶液中,加入NHS、EDC和丙炔胺,其中聚丙烯微孔膜表面羧基、EDC、NHS以及丙炔胺的摩尔比为1∶2∶2∶5,氮气保护下,室温振荡反应24小时后停止反应,用丙酮和水洗涤后,放入40℃烘箱,真空干燥24小时,得到表面固定炔丙基的聚丙烯微孔膜,炔基固定率为0.88克/平方米膜。
将上述表面固定炔丙基的聚丙烯微孔膜浸入1-叠氮基葡萄糖的水/叔丁醇(其中,水、叔丁醇的体积比1∶2)溶液中,加入五水硫酸铜和抗坏血酸钠,其中聚丙烯微孔膜表面炔基、1-叠氮基葡萄糖、五水硫酸铜和抗坏血酸钠的摩尔比为1∶4∶0.05∶0.25,在氮气保护下室温振荡反应36小时后停止反应,用水洗涤后,放入40℃烘箱,真空干燥24小时,得到表面糖基化的聚丙烯微孔膜,糖基固定率为4.39克/平方米膜。
实施例3
称取适量的BP溶解在正庚烷中,配成BP浓度为0.010摩尔/升的光引发剂溶液,将直径为3.95厘米的聚丙烯微孔膜(其平均孔径为1微米,孔隙率为80%,膜厚为200微米)浸入到光引发剂溶液中,浸泡1小时后取出自然晾干,然后将聚丙烯微孔膜浸入单体体积浓度为10%的丙烯酸单体溶液中,紫外光辐照30分钟后取出,用丙酮和大量水清洗后,放入40℃烘箱,真空干燥24小时,得到接枝率为10.59克/平方米膜的丙烯酸接枝改性的聚丙烯微孔膜。
将上述丙烯酸接枝改性的聚丙烯微孔置入pH为6.0的PBS缓冲溶液中,加入NHS、EDC和丙炔胺,其中聚丙烯微孔膜表面羧基、EDC、NHS以及丙炔醇的摩尔比为1∶2∶4∶10,氮气保护下,室温振荡反应36小时后停止反应,用丙酮和水洗涤后,放入40℃烘箱,真空干燥24小时,得到表面固定炔丙基的聚丙烯微孔膜,炔基固定率为4.42克/平方米膜。
将上述表面固定炔丙基的聚丙烯微孔膜浸入2-叠氮乙基葡萄糖的水/叔丁醇(其中,水、叔丁醇的体积比1∶3)溶液中,加入五水硫酸铜和抗坏血酸钠,其中聚丙烯微孔膜表面炔基、2-叠氮乙基葡萄糖、五水硫酸铜和抗坏血酸钠的摩尔比为1∶6∶0.05∶0.5,在氮气保护下,室温振荡反应48小时后停止反应,用水洗涤后,放入40℃烘箱,真空干燥24小时,得到表面糖基化的聚丙烯微孔膜,,糖基固定率为20.42克/平方米膜。
实施例4
称取适量的BP溶解在正庚烷中,配成BP浓度为0.010摩尔/升的光引发剂溶液,将直径为3.95厘米的聚丙烯微孔膜(其平均孔径为2微米,孔隙率为65%,膜厚为180微米)浸入到光引发剂溶液中,浸泡1小时后取出自然晾干,然后将聚丙烯微孔膜浸入单体体积浓度为20%的甲基丙烯酸单体溶液中,紫外光辐照30分钟后取出,用丙酮和大量水清洗后,放入40℃烘箱,真空干燥24小时,得到接枝率为25.43克/平方米膜的甲基丙烯酸接枝改性的聚丙烯微孔膜。
将上述甲基丙烯酸接枝改性的聚丙烯微孔置入pH为6.5的PBS缓冲溶液中,加入NHS、EDC和丙炔醇,其中聚丙烯微孔膜表面羧基、EDC、NHS以及丙炔醇的摩尔比为1∶5∶5∶10,氮气保护下,室温振荡反应36小时后停止反应,用丙酮和水洗涤后,放入40℃烘箱,真空干燥24小时,得到表面固定炔丙基的聚丙烯微孔膜,炔基固定率为9.80克/平方米膜。
将上述表面固定炔丙基的聚丙烯微孔膜浸入2-叠氮乙基葡萄糖的水/叔丁醇(其中,水、叔丁醇的体积比1∶3)溶液中,加入五水硫酸铜和抗坏血酸钠,其中聚丙烯微孔膜表面炔基、2-叠氮乙基葡萄糖、五水硫酸铜和抗坏血酸钠的摩尔比为1∶8∶0.1∶1,在氮气保护下室温振荡反应36小时后停止反应,用水洗涤后,放入40℃烘箱,真空干燥24小时,得到表面糖基化的聚丙烯微孔膜,糖基固定率为52.69克/平方米膜。
实施例5
称取适量的BP溶解在正庚烷中,配成BP浓度为0.010摩尔/升的光引发剂溶液,将直径为3.95厘米的聚丙烯微孔膜(其平均孔径为0.2微米,孔隙率为80%,膜厚为160微米)浸入到光引发剂溶液中,浸泡1小时后取出自然晾干,然后将聚丙烯微孔膜浸入单体体积浓度为55%的甲基丙烯酸单体溶液中,紫外光辐照60分钟后取出,用丙酮和大量水清洗后,放入40℃烘箱,真空干燥24小时,得到接枝率为98.00克/平方米膜的甲基丙烯酸接枝改性的聚丙烯微孔膜。
将上述甲基丙烯酸接枝改性的聚丙烯微孔置入pH为5.5的PBS缓冲溶液中,加入NHS、EDC和丙炔醇,其中聚丙烯微孔膜表面羧基、EDC、NHS以及丙炔醇的摩尔比为1∶2∶4∶10,氮气保护下,室温振荡反应36小时后停止反应,用丙酮和水洗涤后,放入40℃烘箱,真空干燥24小时,得到表面固定炔丙基的聚丙烯微孔膜,炔基固定率为31.85克/平方米膜。
将上述表面固定炔丙基的聚丙烯微孔膜浸入3-叠氮丙基葡萄糖的水/叔丁醇(其中,水、叔丁醇的体积比1∶4)溶液中,加入五水硫酸铜和抗坏血酸钠,其中聚丙烯微孔膜表面炔基、3-叠氮丙基葡萄糖、五水硫酸铜和抗坏血酸钠的摩尔比为1∶10∶0.1∶1,在氮气保护下,室温振荡反应48小时后停止反应,用水洗涤后,放入40℃烘箱,真空干燥24小时,得到表面糖基化的聚丙烯微孔膜,糖基固定率为196.80克/平方米膜。
实施例6
称取适量的BP溶解在正庚烷中,配成BP浓度为0.005摩尔/升的光引发剂溶液,将直径为3.95厘米的聚丙烯微孔膜(其平均孔径为1微米,孔隙率为65%,膜厚为180微米)浸入到光引发剂溶液中,浸泡1小时后取出自然晾干,然后将聚丙烯微孔膜浸入单体体积浓度为30%的甲基丙烯酸单体溶液中,紫外光辐照20分钟后取出,用丙酮和大量水清洗后,放入40℃烘箱,真空干燥24小时,得到接枝率为15.38克/平方米膜的甲基丙烯酸接枝改性的聚丙烯微孔膜。
将上述甲基丙烯酸接枝改性的聚丙烯微孔置入pH为6.0的PBS缓冲溶液中,加入NHS、EDC和丙炔胺,其中聚丙烯微孔膜表面羧基、EDC、NHS以及丙炔胺的摩尔比为1∶10∶10∶10,氮气保护下,室温振荡反应24小时后停止反应,用丙酮和水洗涤后,放入40℃烘箱,真空干燥24小时,得到表面固定炔丙基的聚丙烯微孔膜,炔基固定率为5.78克/平方米膜。
将上述表面固定炔丙基的聚丙烯微孔膜浸入2-叠氮乙基甘露糖的水/叔丁醇(其中,水、叔丁醇的体积比1∶4)溶液中,加入五水硫酸铜和抗坏血酸钠,其中聚丙烯微孔膜表面炔基、2-叠氮乙基甘露糖、五水硫酸铜和抗坏血酸钠的摩尔比为1∶4∶0.1∶1,在氮气保护下,室温振荡反应48小时后停止反应,用水洗涤后,放入40℃烘箱,真空干燥24小时,得到表面糖基化的聚丙烯微孔膜,糖基固定率为37.55克/平方米膜。
实施例7
称取适量的BP溶解在正庚烷中,配成BP浓度为0.001摩尔/升的光引发剂溶液,将直径为3.95厘米的聚丙烯微孔膜(其平均孔径为2微米,孔隙率为80%,膜厚为200微米)浸入到光引发剂溶液中,浸泡1小时后取出自然晾干,然后将聚丙烯微孔膜浸入单体体积浓度为10%的甲基丙烯酸单体溶液中,紫外光辐照20分钟后取出,用丙酮和大量水清洗后,放入40℃烘箱,真空干燥24小时,得到接枝率为8.36克/平方米膜的甲基丙烯酸接枝改性的聚丙烯微孔膜。
将上述甲基丙烯酸接枝改性的聚丙烯微孔置入pH为5.0的PBS缓冲溶液中,加入NHS、EDC和丙炔胺,其中聚丙烯微孔膜表面羧基、EDC、NHS以及丙炔胺的摩尔比为1∶2∶4∶10,氮气保护下,室温振荡反应12小时后停止反应,用丙酮和水洗涤后,放入40℃烘箱,真空干燥24小时,得到表面固定炔丙基的聚丙烯微孔膜,炔基固定率为3.18克/平方米膜。
将上述表面固定炔丙基的聚丙烯微孔膜浸入2-叠氮乙基半乳糖的水/叔丁醇(其中,水、叔丁醇的体积比1∶2)溶液中,加入五水硫酸铜和抗坏血酸钠,其中聚丙烯微孔膜表面炔基、2-叠氮乙基半乳糖、五水硫酸铜和抗坏血酸钠的摩尔比为1∶2∶0.02∶0.1,在氮气保护下室温振荡反应24小时后停止反应,用水洗涤后,放入40℃烘箱,真空干燥24小时,得到表面糖基化的聚丙烯微孔膜,糖基固定率为15.97克/平方米膜。
应用例1
葡萄糖糖基化聚丙烯亲和膜对伴刀豆球蛋白(ConA)的吸附分离
配制伴刀豆球蛋白/花生凝集素(Con A/PNA)溶液,其中溶剂为pH=7.36的PBS缓冲溶液,溶液中Con A的浓度为1克/升,PNA的浓度为1克/升,CaCl2的浓度为0.1毫摩尔/升,MnCl2的浓度为0.1毫摩尔/升,NaCl的浓度为0.1摩尔/升。
取实施例2制备的葡萄糖糖基化聚丙烯亲和膜(糖基固定率为4.39克/平方米膜),在无水乙醇中预浸润,再以浓度为0.01摩尔/升,pH=7.36的PBS缓冲溶液清洗,放入20毫升上述配制的Con A/PNA溶液中,密封,在25℃下恒温1小时后,取出葡萄糖糖基化的聚丙烯亲和膜,并以1摩尔/升的葡萄糖磷酸盐缓冲溶液冲洗,将吸附在聚丙烯亲和膜上的伴刀豆球蛋白洗脱,从而实现伴刀豆球蛋白从蛋白质混合溶液的分离。
应用例2
配制伴刀豆球蛋白/花生凝集素(Con A/PNA)溶液,其中溶剂为pH=7.36的PBS缓冲溶液,溶液中Con A的浓度为5克/升,PNA的浓度为5克/升,CaCl2的浓度为0.1毫摩尔/升,MnCl2的浓度为0.1毫摩尔/升,NaCl的浓度为0.1摩尔/升。
取实施例3制备的葡萄糖糖基化聚丙烯亲和膜(糖基固定率为20.42克/平方米膜),在无水乙醇中预浸润,再以浓度为0.01摩尔/升,pH=7.36的PBS缓冲溶液清洗,放入20毫升上述配制的Con A/PNA溶液中,密封,在25℃下恒温1小时后,取出葡萄糖糖基化的聚丙烯亲和膜,并以1摩尔/升的葡萄糖磷酸盐缓冲溶液冲洗,将吸附在聚丙烯亲和膜上的伴刀豆球蛋白洗脱,从而实现伴刀豆球蛋白从蛋白质混合溶液的分离。
应用例3
配制伴刀豆球蛋白/花生凝集素(Con A/PNA)溶液,其中溶剂为pH=7.36的PBS缓冲溶液,溶液中Con A的浓度为5克/升,PNA的浓度为5克/升,CaCl2的浓度为0.1毫摩尔/升,MnCl2的浓度为0.1毫摩尔/升,NaCl的浓度为0.1摩尔/升。
取实施例4制备的葡萄糖糖基化聚丙烯亲和膜(糖基固定率为52.69克/平方米膜),在无水乙醇中预浸润,再以浓度为0.01摩尔/升,pH=7.36的PBS缓冲溶液清洗,放入50毫升上述配制的Con A/PNA溶液中,密封,在25℃下恒温1小时后,取出葡萄糖糖基化的聚丙烯亲和膜,并以1摩尔/升的葡萄糖磷酸盐缓冲溶液冲洗,将吸附在聚丙烯亲和膜上的伴刀豆球蛋白洗脱,从而实现伴刀豆球蛋白从蛋白质混合溶液的分离。
应用例4
配制伴刀豆球蛋白/花生凝集素(Con A/PNA)溶液,其中溶剂为pH=7.36的PBS缓冲溶液,溶液中ConA的浓度为10克/升,PNA的浓度为10克/升,CaCl2的浓度为0.1毫摩尔/升,MnCl2的浓度为0.1毫摩尔/升,NaCl的浓度为0.1摩尔/升。
取实施例5制备的葡萄糖糖基化聚丙烯亲和膜(糖基固定率为196.80克/平方米膜),在无水乙醇中预浸润,再以浓度为0.01摩尔/升,pH=7.36的PBS缓冲溶液清洗,放入50毫升上述配制的ConA/PNA溶液中,密封,在25℃下恒温1小时后,取出葡萄糖糖基化的聚丙烯亲和膜,并以1摩尔/升的葡萄糖磷酸盐缓冲溶液冲洗,将吸附在聚丙烯亲和膜上的伴刀豆球蛋白洗脱,从而实现伴刀豆球蛋白从蛋白质的混合溶液的分离。
应用例5
甘露糖糖基化聚丙烯亲和膜对伴刀豆球蛋白(Con A)的吸附分离
配制伴刀豆球蛋白/花生凝集素(Con A/PNA)溶液,其中溶剂为pH=7.36的PBS缓冲溶液,溶液中Con A的浓度为5克/升,PNA的浓度为5克/升,CaCl2的浓度为0.1毫摩尔/升,MnCl2的浓度为0.1毫摩尔/升,NaCl的浓度为0.1摩尔/升。
取实施例6制备的甘露糖糖基化聚丙烯亲和膜(糖基固定率为37.55克/平方米膜),在无水乙醇中预浸润,再以浓度为0.01摩尔/升,pH=7.36的PBS缓冲溶液清洗,放入20毫升上述配制的Con A/PNA溶液中,密封,在25℃下恒温1小时后,取出甘露糖糖基化的聚丙烯亲和膜,并以1摩尔/升的葡萄糖磷酸盐缓冲溶液冲洗,将吸附在聚丙烯亲和膜上的伴刀豆球蛋白洗脱,从而实现伴刀豆球蛋白从蛋白质的混合溶液的分离。
应用例1、2、3、4和5中对伴刀豆球蛋白/花生凝集素混合溶液的分离效果如表1所示。
表1
Claims (5)
1.一种高密度糖基化聚丙烯亲和膜的制备方法,包括如下步骤:
(1)将聚丙烯微孔膜在光引发剂溶液中浸泡后取出晾干,再浸入丙烯酸单体的水溶液或甲基丙烯酸单体的水溶液中,通过紫外光辐照接枝聚合10~60分钟后取出,经洗涤、烘干得到表面接枝改性的聚丙烯微孔膜,单体接枝率为1~98克/平方米膜;
所述的光引发剂溶液中光引发剂的浓度为0.001~0.010摩尔/升,丙烯酸单体的水溶液中单体的体积百分浓度为2~55%,甲基丙烯酸单体的水溶液中单体的体积百分浓度为2~55%;
所述的光引发剂溶液为二苯甲酮的正庚烷溶液,其中,光引发剂为二苯甲酮;
(2)将步骤(1)中得到的接枝改性的聚丙烯微孔膜浸入pH值为5.0~6.5的磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲溶液中,加入含炔基的胺或含炔基的醇,以及催化剂,在氮气保护下,室温振荡反应12~36小时后取出,经洗涤、烘干得到表面固定炔基的聚丙烯微孔膜,炔基固定率为0.26~32克/平方米膜;
其中,含炔基的胺或含炔基的醇与聚丙烯微孔膜表面羧基的摩尔比为2~10;
所述的催化剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺;
其中1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐与N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为0.5~2,1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐与聚丙烯微孔膜表面羧基的摩尔比为2~10;
(3)将步骤(2)中得到的表面固定炔基的聚丙烯微孔膜浸入叠氮糖溶液中,在氮气保护下加入1,3-偶极环加成反应催化剂,室温下振荡反应24~48小时后取出,经洗涤、烘干得到高密度糖基化聚丙烯亲和膜,糖基固定率为0.98~197克/平方米膜;
其中,叠氮糖与聚丙烯微孔膜表面炔基的摩尔比为2~10;
所述的叠氮糖为1-叠氮基葡萄糖、2-叠氮乙基葡萄糖、3-叠氮丙基葡萄糖、2-叠氮乙基甘露糖、2-叠氮乙基半乳糖或2-叠氮乙基乳糖;
所述的1,3-偶极环加成反应催化剂为五水硫酸铜和抗坏血酸钠,五水硫酸铜与聚丙烯微孔膜表面炔基的摩尔比为0.02~0.1,抗坏血酸钠与聚丙烯微孔膜表面炔基的摩尔比为0.1~1。
2.如权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述的聚丙烯微孔膜的平均孔径为0.1~2微米,孔隙率为40~85%,膜厚为150~200微米。
3.如权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述的含炔基的胺为丙炔胺,含炔基的醇为丙炔醇。
4.如权利要求1所述的制备方法,其特征在于:步骤(3)中,所述叠氮糖溶液中的溶剂为水与叔丁醇的混合溶液,其中叔丁醇与水的体积比为1~4。
5.如权利要求1~4任一项所述的制备方法制得的高密度糖基化聚丙烯亲和膜在蛋白质分离中的应用。
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