CN1181200C - 在聚合物膜上固定化酶的方法 - Google Patents

Abstract

本发明是一种在聚合物膜上固定化酶的方法。现有技术中在膜上固定化酶是十分困难的。即使有文献报道，也存在技术复杂、成本偏高等不足。本发明提供了一种在性质不同的聚合物膜上固定酶或其他具有分离和催化活性物质的方法。其关键是采用浸泡的方法，使一种含有阳离子或胺基的亲水性聚合物吸附在含有阴离子活性中心的聚合物膜上，然后用酶制剂或其他含有分离或催化活性的试剂进行处理，使制成固定化酶膜。通过适度的交联可以提高固定化酶膜的稳定性。本发明方法可以同样用于聚合物膜上固定具有分离和催化活性的物质，制成具有分离和合成功能的活性膜。

Description

在聚合物膜上固定化酶的方法

技术领域：

本发明是关于一种在不同的聚合物膜上固定酶或其他具有分离和催化活性成分的方法。

背景技术：

在固体、特别是在固体粒子上固定化酶的方法已有大量报道(I.CHIBATA，固定化酶，第二章，p.9-107，Wiley and Sons，1978)。但是，要将酶有效地固定在薄膜上是很困难的，因为要求这些成膜材料必须能够发生活化反应，或具有很好的反应活性，或对酶有很好的吸附性能。

据文献报道，用于固定化酶的膜材料主要选用聚酰胺、纤维素或胶原质的衍生物。即使是采用物理吸附的方法来固定化酶也主要选用这些材料。但是，这些已报道的方法都存在技术复杂、成本偏高、膜的选择范围小等诸多不利。

发明内容：

本发明的目的是要建立一种在不同的聚合物膜上——不论是市售膜或实验室制备的膜——固定化酶的方法。

本发明的关键是使用一种中介的聚合物，使基膜和酶连接在一起。这种中介聚合物通常是一种含有多阳离子或多胺基的亲水性聚合物(后者可以通过降低pH，使胺基很容易地转化为阳离子)。中介聚合物的亲水性对保持酶或其他具有催化和分离功能基团的活性是十分有利的。

按照本发明，酶在膜上的固定化包括两个步骤：

第一步，通过离子反应，使多阳离子或多胺基聚合物通过浸泡吸附在含有阴离子基团的聚合物膜上。被吸附的聚合物有时需要经过交联处理。因为，交联能使聚合物以不可逆的方式连接在膜上。不经交联处理的中介聚合物有可能在介质的离子强度增加时或在pH值下降时从膜上脱落。在这种情况下，就需要对膜进行再生，使膜在正常的条件下，可以长时间保存而不会丧失活性。

第二步，经过上述方法处理的膜在pH高于酶的等电点的酶溶液中浸泡吸附，使酶固定在中介聚合物膜上。漂洗干净后，还须浸入含有亲水性多官能团试剂的水溶液中进行交联。其作用或是使酶分子相互连接在一起，或是使酶分子同聚合物基质连接在一起，从而提高酶在聚合物上结合的牢固性。可以用作交联剂的多官能团试剂有戊二醛、酒石酸或双偶氮苯并-2，2’-二磺酸等。

本发明中的中介聚合物通过浸泡吸附在聚合物膜上，浸泡的中介聚合物浓度一般为0.1％～1％，浸泡温度为室温，浸泡时间一般为10分钟～60分钟。

经过上述处理的膜用含酶的溶液吸附时，酶溶液的浓度是0.5mg/mL～5mg/mL，浸泡温度为室温，浸泡时间为10分钟～60分钟。

常用的中介聚合物有聚乙烯亚胺、聚乙烯胺、二乙胺基乙基萄聚糖、壳聚糖，聚酰胺、聚丙烯酰胺、聚乙烯基咪唑等。

本发明所用的中介聚合物在吸附酶的同时，如能用交联剂交联，可使中介聚合物和酶稳定地吸附在聚合物膜上并较长时间保存，固定化程度更好。交联剂是一些亲水性的多官能团化合物，如戊二醛、酒石酸、烷基二异氰酸酯、环氧卤代物、二卤代物等。

经过预处理的聚合物膜在含酶的溶液中浸泡吸附的条件是溶液的pH值略高于酶制剂的等电点。这是因为在酶的化学结构中常含有活性阴离子基团，因此介质的pH不能低于酶的等电点。一般酶溶液的pH值应比酶的等电点高1-2。

中介聚合物需含有胺基(I级、II级或III级胺)、阳离子基(IV级铵基、磺酸基，磷酸基)或其他非离子型亲水基如羟基、醚基、酰胺基等。下述市售聚合物也适用于作为中介聚合物。如含有IV级铵的聚乙烯基亚胺、聚乙烯基胺、聚丙烯酰胺，聚N-二甲基胺乙基丙烯酰胺、聚乙烯基-4-吡啶，聚乙烯基咪唑，二乙胺基乙基萄聚糖，壳聚糖等。总之，所有在主链或侧链上含有上述基团，或可能通过进一步反应形成上述基团的亲水性聚合物、共聚物、缩聚物或缩合共聚物都能应用。为了使交联反应能够进行，中介聚合物须带有能同交联剂发生反应的基团。

中介聚合物的交联剂以戊二醛较好，因为它溶于水，有较好的生物相容性，而且来源广泛、价格低廉、使用方便、用量不多。

本发明也适用于含阴离子的膜。这类膜可以直接选用市售的阴离子膜：如含有磺酸基的丙烯腈类共聚膜、磺化聚砜膜、含过量负电荷的复合聚电解质膜；也可以通过蒸发或凝胶的方法用含阴离子基的聚合物溶液通过浇铸成膜。这些膜在使用前可以进行适当的改性，常用的改性方法有化学改性、电化学改性、电射流改性或辐照改性等。

阴离子基可以是硫酸基、磺酸基、羧基、磷酸基或膦酸酯基。这些基团可能分布在整个膜中，也可能只是分布在膜或膜孔的表面。如果这些基团仅处于膜的表面，那么这些基团在膜中所占的比例与膜的总重量相比是很小的。

本发明中阴离子膜可以通过接枝反应获得含有阴离子基团的聚合物膜。如丙烯酸接枝的聚乙烯膜，聚乙烯磺酸膜等。

用Ce(IV)盐作引发剂，通过含阴离子单体接枝共聚的方法，可以将纤维素膜改性为含阴离子基团的聚合物膜。如丙烯酸或丙烯酰胺接枝纤维素膜等。

本发明适用的膜可以用任何一种聚合物制成，可以通过阴离子单体接枝共聚的方法来改性。其方法是将聚合物膜浸泡在含有阴离子单体和双丙烯酰胺交联剂的水溶液中，采用紫外辐照的方法引发接枝聚合反应。

用于血液透析的丙烯腈-甲基丙烯基磺酸共聚膜或磺化聚砜膜用于本发明也能获得良好的效果。

本发明方法对聚合物膜厚度的要求不高，因此是对现有固定化酶技术的很大革新。根据本发明，只要能通过浸泡的方法吸附中介聚合物和酶的阴离子膜均可使用。所有厚度为10～200μm的聚合物膜都能用于固定化酶的目的。

显然，本发明所介绍的方法可以适用于具有不同物理结构的膜，如致密均质膜、含有致密皮层的不对称膜、含有微孔皮层的不对称膜及均质微孔膜等。

本发明也可用于不同构型的膜，如平板膜、管式膜、中空纤维膜或其他类型的膜。

符合本发明的固定化酶膜可用于不同的领域，如酶膜反应器、膜电极等各类含活性酶的膜产品。

用本发明方法可在聚合物膜上固定具有分离和催化活性成份的化合物，使聚合物膜在化学反应或化工分离中具有分离和催化功能，从而应用于各种化学产品，尤其是生物产品的合成和分离。

本发明方法经中介聚合物吸附的聚合物膜若因时间长或保存不当而失效，可以用同样的方法进行再生，从而节约制备成本。

与文献中报道的方法相比，本发明中所用的方法有如下一些优点：

-膜的选择范围更大：它能将酶固定在不同性质的膜上，可以根据膜的物理化学性质独立地进行选择。因此，根据固定化酶膜在应用上的要求，可以选用厚度很薄的膜(如厚度仅十几微米的中孔纤维膜)或孔径及空孔率合适的膜。后面我们将举一些例子来说明初始膜的选择能明显改善固定化酶的效果。

-经中介聚合物层处理后的膜有很高的稳定性(膜的稳定性与基膜相当)，而且能很简便而快捷地在这些经过预处理的膜上固定化酶。它能在即将使用时将酶固定在预先经过合适处理的膜上，这样就能大大增加固定化酶膜的保存和使用期，因此，经济效益是显而易见的。

-固定化效果好。由于支撑膜的表面积很大，且在聚合物上有很多活性基团，因此固定化酶的量也很大，效率很高。

-由于中介层聚合物形成的亲水性环境，固定化酶有很好稳定性。

-固定化酶的形式非常随意，可以将酶可逆或不可逆地固定在膜上，还可以将酶固定在膜的一个表面，两个表面，或固定在膜的内孔中

具体实施方式：

下面例举一些有限的例子来说明本发明及其实施过程。

例1选用SARTORIUS生产的SM116型再生纤维素膜，膜厚110μm，孔径0.45μm。

1)用化学改性的方法使膜带上负电荷，反应发生在孔的表面。为此，在室温下，将膜在浓度为0.01mol/L的Ce(IV)稀硫酸溶液中浸泡15分钟，然后用滤纸将膜吸干。再将膜在0.1mol/L的丙烯酸在0.05 N硫酸的溶液中在室温下浸泡20小时，使发生丙烯酸在膜上的接枝聚合反应。这样制得的改性膜性能十分稳定，可在室温下以干态或湿态长期保存。

2)将这种膜在室温下在聚乙烯基亚胺的水溶液(10～20g/L)中浸泡20分钟，溶液中加入少许H₂SO₄调节pH为10。然后用水漂洗干净，用1％的戊二醛溶液在室温下处理30秒。制得的改性膜可在室温下以干态或湿态长期保存。

葡萄糖氧化酶的固定：将用2)法制得的膜在室温下，在浓度为1mg/mL的葡萄糖氧化酶水溶液中浸泡30分钟。该膜可以专门用于测定葡萄糖在水溶液中的浓度。测定是在一台电流计中进行的，所用的极化电流为0.6V，缓冲液为pH 5.5的醋酸盐。可同时测得葡萄糖水溶液的电流强度和讯号的响应时间。所谓响应时间是指将一定量的葡萄糖一次加入到pH为5.5的缓冲溶液中配成浓度为0.5mM的溶液，当信号达到稳定时的时间。

用例1所描述的方法制成的膜测定浓度为0.5mM的葡萄糖溶液时，相应的电流强度为170nA，响应时间为60秒。

例2：所用的膜为湿态的再生纤维素铜氨渗析膜(ENKA GLANZSTOFF生产)，牌号210PM，湿膜的厚度为20μm。

该膜采用例1中的1)和2)所描述的方法进行处理。葡萄糖氧化酶的固定方法也与例1相同。

用电流计测定0.5mM葡萄糖溶液的电流强度为28nA，响应时间为18秒。

例3：所用的膜为湿态的丙烯腈共聚物制的渗析膜(RHONE-POULENC生产)，牌号AN69，湿膜的厚度为40μm。

该膜已带有负电荷，可不经处理直接使用。聚乙烯基亚胺的吸附和葡萄糖氧化酶的固定化均采用与前面介绍相同的方法进行。

用电流计测定0.5mM葡萄糖溶液的电流强度为22nA，响应时间为18秒。

例4：所用的膜为实验室自制的丙烯腈(PAN)膜、磺化聚砜膜或磺化芳香族聚醚酮膜，可以用均聚膜也可以用同其他聚合物共混制成的合金膜。

用自由基聚合法合成带有负电性基团的聚丙烯腈(约40mgEq/kg)，引发剂为过硫酸盐-硫代硫酸盐，反应介质为水。将制成的聚合物溶于DMSO中，配制成浓度为10％的溶液。然后，将得到的粘稠溶液在玻璃板上刮制成薄膜，并迅速浸入沉淀浴中。沉淀浴由浓度约10％(体积)的DMSO水溶液组成。工业上用相同方法生产的PAN膜也能使用。制成的膜还需在5M的碱溶液中，在10℃～60℃的温度下处理一定的时间，使产生一定浓度的负电性羧基。羧基的含量可用常规的容量法测定。

磺化聚砜或磺化芳香聚醚酮采用文献报道的方法制备。这些聚合物采用与PAN膜相似的方法制备不对称膜。

所得的聚合物薄膜具有不对称结构，所得的膜厚为60μm，采用前面所述方法固定葡萄糖氧化酶。

用电流计测定0.5mM葡萄糖溶液的电流强度为200nA，响应时间为20秒。

例5：所用的膜同例4。

制备了固定化葡萄糖淀粉酶和葡萄糖氧化酶的双酶膜。为此我们采用了与前面的例子相同的方法，但所用的酶制剂中含1mg/mL葡萄糖氧化酶和2mg/mL葡萄糖淀粉酶。

用电流计测定0.5mM饴糖溶液的电流强度为90nA，响应时间为50秒。

根据文献报道，单纯固定葡萄糖氧化酶的胶原膜对同样浓度的葡萄糖溶液的响应时间大于2分(见THEVENOT D.R.，STERNBERG R.，COULET P.R.，LAURENT J.et GAUTHERON D.C.，Anal.chem.51，96(1979)，而一种磁性双酶膜对乳糖的响应时间为15分(见CORDONNIER M.，LAWNY F.，CHAPOT D.，THOMAS D.，FEBS Lett.，59，263(1975)。

例6：一只市售的中孔纤维膜组件(如纤维素，PAN，或AN 69)，采用前述方法固定化葡萄糖淀粉酶。改性后的组件能用于将可溶性淀粉转化为葡萄糖。其方法为将淀粉溶液在组件中在20℃～70℃的温度下，反复循环一段时间，直至达到所期望的水解度。

Claims (10)

1.一种在聚合物膜上固定化酶的方法，其特征是将含有多阳离子或多胺基的中介聚合物通过浸泡，吸附在含有阴离子基团的聚合物膜上，然后，再在pH高于酶的等电点的酶溶液中浸泡吸附，漂洗干净，即可使酶固定在聚合物膜上。

2.根据权利要求1所述的聚合物膜上固定化酶的方法，其特征是在聚合物膜上首先吸附一个中介聚合物，然后在酶吸附前或在酶吸附的同时对中介聚合物膜进行交联反应。

3.根据权利要求1所述的聚合物膜上固定酶的方法，其特征是上述膜在pH值比酶的等电点高1～2的条件下进行浸泡。

4.根据权利要求1所述的聚合物膜上固定酶的方法，其特征是中介聚合物带有阳离子、胺基或非离子型亲水基。

5.根据权利要求2所述的聚合物膜上固定化酶的方法，其特征是交联剂是戊二醛。

6.根据权利要求1所述的聚合物膜上固定化酶的方法，其特征是聚合物膜是通过改性后获得的含有阴离子基的膜。

7.根据权利要求1所述的聚合物膜上固定化酶的方法，其特征是聚合物膜是通过接枝反应获得的含阴离子基团的膜。

8.根据权利要求7所述的聚合物膜上固定酶的方法，其特征是用IV价铈盐作引发剂，通过阴离子单体接枝共聚的方法改性，获得含有阴离子基团的纤维素类聚合物膜。

9.根据权利要求7所述的聚合物膜上固定酶的方法，其特征是将聚合物膜浸泡在含有阴离子单体及双丙烯酰胺交联剂的水溶液中，通过紫外辐照引发接枝聚合的方法获得含阴离子基团的聚合物膜。

10.根据权利要求1所述的聚合物膜上固定酶的方法，其特征是聚合物膜的厚度为10～200μm。