CN108410003A - 一种聚丙烯腈改性膜的制备及其应用于固定酶的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种聚丙烯腈改性膜的制备及其应用于固定酶的方法，以聚丙烯腈为原料、聚乙二醇为致孔剂、N,N‑二甲基甲酰胺为溶剂，采用L‑S相转化法制备中空膜载体；并采用化学法在聚丙烯腈中空膜载体表面交联多胺类物质聚乙烯亚胺，酸化后利用静电吸附作用固定酶；同时在酶的固定过程中加入具有生物亲和性的海藻酸钠提高酶的固定量和固定化酶稳定性；最后，使用不同的化学试剂来增加固定化酶与固定化载体之间的刚性。本发明的固定化载体由相转化法制备的聚丙烯腈中空膜表面改性得到，在固定过程中将静电吸附固定法和包埋/交联法联用，得到重复利用性优良的固定化酶，该方法操作简单、材料本身性能稳定，具有良好的科研和工业应用前景。

Description

一种聚丙烯腈改性膜的制备及其应用于固定酶的方法
技术领域
本发明涉及酶的固定化技术领域，尤其是涉及聚丙烯腈中空膜载体的制备及聚乙烯亚胺修饰改性和其酶固定应用技术。
背景技术
固定化技术是上世纪中期发展起来的生物技术。采用各种方法，将酶固定在不溶性的载体上，制备成固定化酶的过程叫做酶的固定化(enzyme immobilization)，而固定在载体上并且能够在一定的空间范围内进行催化反应的酶称为固定化酶(immobilizedenzyme)。固定化酶具有成本低、使用效率高、酶重复利用能力强、产物易分离等优点。基于以上优点，相比游离酶，固定化酶更适用于大规模的工业生产。
根据酶与载体间作用方式的不同，可以分为物理吸附(氢键作用等)、离子键作用、共价键作用和特异性作用(亲和作用等)方式。物理吸附是一种简单低成本的固定酶的方法，而且不需要对酶进行任何的化学性的修饰，不会改变酶的构象，但是物理吸附不够牢固，易被水等溶液浸出。酶在载体上的吸附的主要原因是酶与载体间的相互作用力，如范德华力、熵作用和氢键作用(需要糖残基)等，常表现出亲脂酶-疏水载体、亲水酶-亲水载体。
离子作用力也是一种非共价键结合力，大部分酶可以与多糖类聚合物(葡聚糖，琼脂糖和去乙酰壳聚糖等)键合，实际上，固体载体与酶分子或者细胞表面的连接作用是通过表面离子基团间相互反应而实现的，这些表面离子基团不包括酶活性位点和底物结合位点处的氨基或羧基。优点是酶与载体结合紧密，稳定性好，不易从载体上脱落。缺点是反应条件激烈、对酶活影响较大、酶活回收率低。固定化过程之后，酶的三级结构是稳定的，因此具有更高抗失活能力。
酶固定化载体有很多种，如无机材料、生物大分子和高分子聚合物材料，其中，高分子聚合物因比表面积大、成本低和易修饰改性被广泛应用。聚丙烯腈(polyacrylonitrile，PAN)外观为白色或略带黄色的不透明粉末；相对密度1.12，玻璃化温度约90℃。它溶于N,N二甲基甲酰胺等极性有机溶剂，还能溶于硫氰酸盐无机盐的浓水溶液，以及浓硝酸等特殊溶剂。聚丙烯腈耐大多数溶剂、不易水解、抗氧化、化学稳定性好、丙烯腈单体易于和其它单体共聚，提升聚合物的性能。这些特点使得聚丙烯腈有着极高的工业应用价值和经济价值。
聚丙烯腈是一种常见的成膜和成纤材料，可用来制备聚丙烯腈膜。聚丙烯腈中空纤维膜采用相转化法制备，该方法制备工艺简单，工艺成本低，制备得到的PAN中空纤维膜不易水解、抗氧化，化学性质稳定，对酸碱的耐受性好，对大部分有机试剂也有一定的耐受性，有一定的抗污染能力，还可以抵抗微生物侵蚀的作用。在酶的固定研究方面，PAN膜载体是一种常用的载体基质。但聚丙烯腈富含惰性强的腈基，分子链间作用力强，链对称性差，成膜后表面反应性差，机械强度一般，生物相容性差，因此为获得性能更好的酶固定化载体，需对聚丙烯腈中空膜进行表面改性，常用的改性方法有化学交联、复合涂层等。
CN1546660A提供了一种固定微生物的通孔膜微囊载体及其制备方法，以N,N-二甲基甲酰胺为溶剂，采用表面活性剂-水的凝固浴的方式固定微生物，但是其固定原理是吸附作用，对微生物的附着力较低。
CN103013976A提供了一种固定化生物大分子的有机-无机复合水凝胶膜及接枝材料的制备方法，该方法先吸附酶再制备海藻酸钠水凝胶膜最后有机层交联，吸附原理是先吸附包埋再交联。这种方法制备出来的凝胶膜强度低，只适合包埋一些有机大分子，对于微生物则无法负载。
发明内容
针对现有技术存在的上述问题，本申请提供了一种聚丙烯腈改性膜的制备及其应用于固定酶的方法。本发明的固定化载体由相转化法制备的聚丙烯腈中空膜表面改性得到，在固定过程中将静电吸附固定法和包埋/交联法联用，得到重复利用性优良的固定化酶，该方法操作简单、材料本身性能稳定，具有良好的科研和工业应用前景。
本发明的技术方案如下：
一种改性聚丙烯腈中空膜的制备方法，采用相转化法制备聚丙烯腈中空膜，并用聚乙烯亚胺进行表面改性。包括以下步骤：
(1)以聚丙烯腈作原料、聚乙二醇作致孔剂、N,N-二甲基甲酰胺作溶剂，相转化法制备聚丙烯腈中空膜；
(2)碱溶液加热水解聚丙烯腈中空膜；
(3)聚丙烯腈中空膜水解后盐酸质子化后与聚乙烯亚胺交联反应。
步骤(1)所述相转化法制备聚丙烯腈中空膜过程中，聚丙烯腈：聚乙二醇：N,N-二甲基甲酰胺＝10g：5mL：55mL；所述聚丙烯腈分子量为60000-80000；所述聚乙二醇分子量为400。
步骤(2)所述碱溶液包括氢氧化钠溶液和/或氢氧化钾溶液。
步骤(3)所述聚乙烯亚胺包括分子量为600、1800和10000在内的多种不同大小的聚乙烯亚胺中的至少一种；所述聚乙烯亚胺使用量为10-20g/L，所述交联反应温度为30-60℃、反应时间为10-12h。
本申请还提供了所述的改性聚丙烯腈中空膜在酶固定中的应用，将所述改性聚丙烯腈中空膜固定酶，并在固定过程中加入海藻酸钠，固定结束后用化学试剂处理。包括以下步骤：
(1)改性聚丙烯腈中空膜经盐酸酸化；
(2)酸化后的改性聚丙烯腈中空膜投入酶和海藻酸钠混合液中，进行酶固定；
(3)固定结束后，用试剂对固定有酶的聚丙烯腈膜混合物进行固化。
所述的酶包括酶和辅酶中的至少一种。优选的，所述酶包括脂肪酶、L-天冬氨酸α-脱羧酶、磷酸吡哆醛中的至少一种。
所述海藻酸钠与酶用量比为1-3g/L：0.2-1g/L，所述酶固定条件为20-40℃、100-200r/min，1-4h。
所述固化方法包括以下方法中的任一种：氯化钙、环氧氯丙烷、戊二醛固化；所述氯化钙固化中，氯化钙浓度为0.1-10g/L，固化条件为30-40℃、静置或搅拌1-3h；所述戊二醛固化中，戊二醛浓度为0.1-2％，固化条件为10-40℃、静置或搅拌1-3h；所述环氧氯丙烷固化中，环氧氯丙烷浓度为0.1-5％，固化条件为30-40℃、静置或搅拌1-3h。
在本发明的一种实施方式中，所述聚丙烯腈中空膜由相转化法制备：
(1)铸膜液选用N,N-二甲基甲酰胺为溶剂，聚乙二醇为致孔剂，三者比例为10g：55mL：5mL；
(2)铸膜液密封反应时间为48h，反应温度60℃；
(3)铸膜液在平板上展开，展开厚度为1mm，展开时间为90s；
(4)凝固浴为N,N-二甲基甲酰胺/水溶液(质量比为1：9)，凝固温度25℃，凝固时间5min；
在本发明的一种实施方式中，所述聚丙烯腈中空膜改性膜改性步骤如下：
(1)碱溶液热水解聚丙烯腈中空膜，碱浓度为2mol/L，时间为90min，温度为60℃；
(2)前一步所述聚丙烯腈中空膜水解后质子化处理，质子化酸浓度1mol/L，时间为6h以上；
(3)前一步所述质子化的聚丙烯腈碱水解膜与聚乙烯亚胺过夜交联反应，聚乙烯亚胺浓度为1-20g/L。
本发明的提供的基于聚乙烯亚胺改性的聚丙烯腈中空膜载体的酶固定应用方法中，该固定化方法将静电吸附和包埋/交联法联用。其中一种实施方式中，所述的酶固定应用技术包括以下步骤：
(1)海藻酸钠与脂肪酶按一定比例溶于缓冲液中，得到海藻酸钠/酶液，海藻酸钠浓度2g/L，酶液浓度6mg/mL；
(2)将上述聚丙烯腈改性膜载体加入到前一步所述海藻酸钠/酶液中，25℃，搅拌固定2h，通过静电吸附作用，得到固定有脂肪酶的聚丙烯腈改性膜载体；
(3)将前一步所述的固定有脂肪酶的聚丙烯腈改性膜载体取出后分别用不同试剂(氯化钙、环氧氯丙烷、戊二醛)进行处理，在聚丙烯腈中空膜改性膜表面联用静电吸附和包埋/交联法联用，得到固定化酶。
本发明有益的技术效果在于：
聚丙烯腈是富腈基的高分子聚合物，易修饰改性，广泛应用于膜分离应用。本发明采用化学法在聚丙烯腈中空膜载体表面交联多胺类物质聚乙烯亚胺以提高聚丙烯腈中空膜载体的表面反应活性，最后，使用不同的化学试剂(氯化钙、环氧氯丙烷、戊二醛)来增加固定化酶与固定化载体之间的刚性，增加固定化酶的稳定性，最终获得重复利用能力强的固定化酶。
聚乙烯亚胺(PEI)作为一种重要的多胺类荷正电聚电解质，分子链上的伯仲叔胺基团比例一般为1：2：1，与其他含胺或者含季铵基团的荷正电材料(壳聚糖及其衍生物、聚六亚甲基胍、聚烯丙基胺、聚酰胺胺等)相比，其亲水性好，荷电密度高，反应活性强，且价格适中，在生物医药、气体响应、CO2捕捉/封装及水处理等方面有着广泛的利用。聚乙烯亚胺富含胺类基团，可用于聚丙烯腈表面改性以增强聚丙烯腈中空膜的表面反应活性。
在自然界中，海藻酸钠(SA)是褐藻细胞壁的主要组分，其在海带中的含量高达30％-40％，是一类丰富的可再生资源，海藻酸钠纯品为白色或淡黄色粉末，几乎无臭无味，易溶于水，不溶于酸(pH值<3)和乙醇等有机溶剂，海藻酸钠水溶液在pH值6-11范围内稳定性最好，pH值低于6时易形成海藻酸凝胶析出，而pH值高于11时又会凝聚。当pH值为7时海藻酸钠水溶液的黏度最大，且黏度随温度的升高显著降低，其作为一种优良的具有生物相容性、无毒及可生物降解的多糖类生物高分子，已经被广泛用于食品、农业、医药等行业领域。海藻酸钠能与钙离子发生反应形成凝胶，因此在固定化酶的过程中，海藻酸钠常与氯化钙一起被用作酶的包埋试剂。
本发明在聚丙烯腈中空膜表面采用化学法交联聚乙烯亚胺后用于固定酶，在固定过程中加入海藻酸钠提高固定化酶的固定量和稳定性，最后再用化学试剂(氯化钙、环氧氯丙烷、戊二醛)来处理得到的固定化酶，在载体表面将静电吸附固定法与包埋/化学交联法联用，得到性能优良的固定化酶。
附图说明
图1为聚丙烯腈中空膜表面扫描电子显微镜图；
图2为聚乙烯亚胺改性聚丙烯腈中空膜表面扫描电子显微镜图；
图3为聚丙烯腈改性膜固定脂肪酶后表面扫描电子显微镜图；
图4为氯化钙处理后，聚丙烯腈改性膜固定化脂肪酶载体表面扫描电子显微镜图；
图5为氯化钙处理后，聚丙烯腈改性膜固定化脂肪酶不同温度下反应结果；
图6为氯化钙处理后，聚丙烯腈改性膜固定化脂肪酶不同温度保温后酶活；
图7为氯化钙处理后，聚丙烯腈改性膜固定化脂肪酶不同pH下反应结果；
图8为氯化钙处理后，聚丙烯腈改性膜固定化脂肪酶不同pH保温后酶活；
图9为氯化钙处理后，金属离子及EDTA对聚丙烯腈改性膜固定化脂肪酶影响
图10为聚丙烯腈改性膜载体固定脂肪酶重复反应15次的酶活保留情况；
图11为聚丙烯腈改性膜载体固定脂肪酶在不同条件下存储40h酶活保留情况；
图12为戊二醛处理后，聚丙烯腈改性膜固定化脂肪酶载体表面扫描电子显微镜图；
图13为环氧氯丙烷处理后，聚丙烯腈改性膜固定化脂肪酶载体表面扫描电子显微镜图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例，对本发明进行具体描述。
实施例1
(1)聚丙烯腈中空膜制备
采用相转化法制备聚丙烯腈中空膜：10g聚丙烯腈粉末与5mL致孔剂聚乙二醇加入55mL N,N-二甲基甲酰胺中，混匀后65℃密封反应48h，形成棕黄色粘稠液体后取出，室温冷却12h除去气泡；室温下将反应液在深度0.1mm的玻璃板槽中铺开，室温蒸发90s后转移至凝固浴(10％DMF/水溶液，25℃)中2min铸膜。将膜裁剪成20cm2待用。取样烘干称重。按照所述方法制备得到的聚丙烯腈中空膜孔隙率为0.87，所能承受的最大机械拉伸力为5.89N。聚丙烯腈中空膜表面形态如图1。
(2)聚丙烯腈改性膜制备
取前一步所述的相转化制备的聚丙烯腈中空膜，置于2mol/L NaOH溶液中，60℃反应90min；反应结束后转移至1mol/L HCl溶液中，质子化4h后蒸馏水洗净，最后投入到PEI1800的水溶液(10g/L)中，37℃过夜搅拌反应；反应结束用蒸馏水洗净，待用。按照所述方法得到的聚丙烯腈改性膜孔隙率为0.81，所能承受的最大机械拉伸力为3.42N。聚乙烯亚胺改性聚丙烯腈中空膜表面形态如图2。
(3)聚丙烯腈改性膜酶固定及后处理过程
称取20mg海藻酸钠和6mg脂肪酶粉溶于10mL乙酸-乙酸钠(0.1mol/L，pH 5.0)中，搅拌值海藻酸钠溶解。
取60mg前一步所述聚丙烯腈改性膜载体加入到10mL海藻酸钠/脂肪酶液中，25℃，150r/min，固定2h。此时聚丙烯腈改性膜固定脂肪酶后表面形态如图3。
根据所述方法，在聚丙烯腈中空膜改性膜表面联用静电吸附和包埋法，得到固定化脂肪酶。
分别用浓度为0.1、0.5、1、5、10g/L的氯化钙溶液对前一步固定得到的固定化脂肪酶进行处理，处理条件为：静置，37℃，90min。此时聚丙烯腈改性膜固定化脂肪酶载体表面形态如图4。
蛋白含量的测定参照Bradford法：取0.5mL待测样品加到2.5mL考马斯亮蓝工作液中，混匀后静置5min，于595nm处测吸光值，根据蛋白浓度标准曲线y＝6.1312x+0.0705(y为595nm处吸光值，x为蛋白浓度mg/mL，R2＝0.9984)计算样品中酶量。需做空白对照以排除PEI和海藻酸钠对测量结果的影响。
脂肪酶酶活测定参照对硝基苯酚法：玻璃试管中加PBS缓冲液(20mmol/L，pH 7.0)8mL和适量脂肪酶或固定化脂肪酶，45℃水浴预热5min后加入预热的棕榈酸对硝基苯酯(100mmol/L)0.15mL，45℃恒温振荡反应5min后，取1mL反应液加入到2倍体积的Na2CO3(1mol/L)中终止反应。空白对照不加酶。
样品稀释适当倍数在405nm处测吸光值，根据对硝基苯酚浓度标准曲线y＝7.4801x+0.056(y为吸光值，x为对硝基苯酚浓度(μmol/L)，R2＝0.998)计算酶活U。
酶活定义：在实验条件下，每分钟催化生成1μmol的对硝基苯酚所需要的酶量，定义为一个酶活单位(U)。
根据所述方法制备得到的固定化脂肪酶酶载量为31.70(mg enzyme)/(gcarrier)，初始酶活力为50.42U/(g carrier)
根据所述方法制备得到的固定化脂肪酶与游离脂肪酶相比，最适温度变为由40℃变为60℃，最适pH由6变为7，耐酸性和耐温性均提高(图5-8)；
根据所述方法制备得到的固定化脂肪酶与游离脂肪酶相比，在选定的金属离子和EDTA中，多数金属离子对固定化酶的抑制作用要小于游离酶(图9)；
根据所述方法制备得到的固定化脂肪酶在重复使用15次后，可以保留58.77％的初始酶活力(图10)。
根据所述方法制备得到的固定化脂肪酶在不同条件(PBS缓冲液、自来水、氯化钠、二氯甲烷、乙醇、丙酮)下存储40h，酶活力保留较好(图11)。
实施例2
按照实施例1的方法制备聚丙烯腈改性膜和固定脂肪酶，其区别在于利用浓度为0.1、0.2、0.5、1.0、2.0％的戊二醛替代氯化钙，来对所述的聚丙烯腈改性膜固定的脂肪酶进行处理，处理条件为：室温，静置，90min。
根据所述方法，在聚丙烯腈中空膜改性膜表面联用静电吸附和化学交联法，得到固定化脂肪酶。
按实施例2方法制备得到的固定化脂肪酶表面形态如图12，在重复利用15次后，能保留60％以上酶活力(图9)，且在不同条件(PBS缓冲液、自来水、氯化钠、二氯甲烷、乙醇、丙酮)下存储40h，酶活力保留较好(图10)。
实施例3
按照实施例1的方法制备聚丙烯腈改性膜和固定脂肪酶，其区别在于利用浓度为0.1、0.5、1.0、2.5、5％的环氧氯丙烷替代氯化钙，来对所述的聚丙烯腈改性膜固定的脂肪酶进行处理，处理条件为：37℃，搅拌，90min。
根据所述方法，在聚丙烯腈中空膜改性膜表面联用静电吸附和化学交联法，得到固定化脂肪酶。
按实施例3方法制备得到的固定化脂肪酶表面形态如图13，在重复利用15次后，能保留55％以上酶活力(图9)，且在不同条件(PBS缓冲液、自来水、氯化钠、二氯甲烷、乙醇、丙酮)下存储40h，酶活力保留较好(图10)。
实施例4
按照实施例1的方法制备聚丙烯腈改性膜并且固定L-天冬氨酸α-脱羧酶，固定结束后，分别按照实施例1、实施例2、实施例3的方法分别用氯化钙、环氧氯丙烷和戊二醛来对固定化L-天冬氨酸α-脱羧酶进行后续处理。
根据所述方法，在聚丙烯腈中空膜改性膜表面联用静电吸附和包埋/化学交联法，得到固定化酶。
L-天冬氨酸α-脱羧酶酶活测定方法：向PBS(50mM、pH 8.0)缓冲液中加入底物L-天冬氨酸至终浓度为100mmol/L，再加入固定化L-天冬氨酸α-脱羧酶，在70℃混合液反应1h，以高效液相色谱测量产物β-丙氨酸的生成量。酶活定义：在实验条件下，每小时反应产生1μmol产物β-Ala所消耗的酶量，定义为1U。
得到的固定化L-天冬氨酸α-脱羧酶在重复反应5次后，能够保留67.48％的初始酶活力，并且受底物的抑制作用减弱。
实施例5
按照实施例1的方法制备聚丙烯腈改性膜，分别固定辅酶磷酸吡哆醛，固定条件为12℃、15h。固定结束后，分别按照实施例1、实施例2、实施例3的方法分别用氯化钙、环氧氯丙烷和戊二醛来对固定化磷酸吡哆醛进行处理。
根据所述方法，在聚丙烯腈中空膜改性膜表面联用静电吸附和化学交联法，得到固定化磷酸吡哆醛。
磷酸吡哆醛利用分光光度计在A390nm处测吸光值，对照标准曲线表征浓度；以L-天冬氨酸α-脱羧酶酶活力表征其作为辅酶活性。
结果发现，聚丙烯腈中空膜改性后，磷酸吡哆醛固定量超过0.1mol/(g carrier)，并且在重复利用4次后保留45.67％的辅酶活性。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种改性聚丙烯腈中空膜的制备方法，其特征在于，采用相转化法制备聚丙烯腈中空膜，并用聚乙烯亚胺进行表面改性。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)以聚丙烯腈作原料、聚乙二醇作致孔剂、N,N-二甲基甲酰胺作溶剂，相转化法制备聚丙烯腈中空膜；
(2)碱溶液加热水解聚丙烯腈中空膜；
(3)聚丙烯腈中空膜水解后盐酸质子化后与聚乙烯亚胺交联反应。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述相转化法制备聚丙烯腈中空膜过程中，聚丙烯腈：聚乙二醇：N,N-二甲基甲酰胺＝10g：5mL：55mL；所述聚丙烯腈分子量为60000-80000；所述聚乙二醇分子量为400。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述碱溶液包括氢氧化钠溶液和/或氢氧化钾溶液。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述聚乙烯亚胺包括分子量为600、1800和10000在内的多种不同大小的聚乙烯亚胺中的至少一种；所述聚乙烯亚胺使用量为10-20g/L，所述交联反应温度为30-60℃、反应时间为10-12h。
6.权利要求1～5任一项所述的改性聚丙烯腈中空膜在酶固定中的应用，其特征在于，将所述改性聚丙烯腈中空膜固定酶，并在固定过程中加入海藻酸钠，固定结束后用化学试剂处理。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：
(1)改性聚丙烯腈中空膜经盐酸酸化；
(2)酸化后的改性聚丙烯腈中空膜投入酶和海藻酸钠混合液中，进行酶固定；
(3)固定结束后，用试剂对固定有酶的聚丙烯腈膜混合物进行固化。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的酶包括酶和辅酶中的至少一种。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述海藻酸钠与酶用量比为1-3g/L：0.2-1g/L，所述酶固定条件为20-40℃、100-200r/min，1-4h。
10.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述固化方法包括以下方法中的任一种：氯化钙、环氧氯丙烷、戊二醛固化；
所述氯化钙固化中，氯化钙浓度为0.1-10g/L，固化条件为30-40℃、静置或搅拌1-3h；
所述戊二醛固化中，戊二醛浓度为0.1-2％，固化条件为10-40℃、静置或搅拌1-3h；
所述环氧氯丙烷固化中，环氧氯丙烷浓度为0.1-5％，固化条件为30-40℃、静置或搅拌1-3h。
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