CN101215736A - 一种糖基修饰丙烯腈基纳米纤维及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种通过“点击化学”制备糖基修饰丙烯腈基纳米纤维的方法。该方法采用静电纺丝技术制备带有羧基功能基团的丙烯腈基共聚物纳米纤维，通过偶联反应在其表面引入炔基，再利用“点击化学”方法将含叠氮基团的糖基固定到纳米纤维的表面。本发明结合纳米纤维高比表面积和“点击化学”反应高专一性的特点，有效提高了纳米纤维表面糖基的固定化率，有利于发挥糖基的集簇效应，从而显著提高了对蛋白质的分离效率。糖基修饰丙烯腈基纳米纤维具有制备方法简单、可多次重复使用、成本低廉等优点。

Description

一种糖基修饰丙烯腈基纳米纤维及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及一种纳米纤维的制备方法及应用，尤其涉及一种糖基修饰丙烯腈基共聚物纳米纤维的制备方法及应用。
背景技术
糖与蛋白质、脂类和核酸一样，是构成生物体的重要成分。在细胞的构建、细胞的生物合成和细胞生命活动的调控中，糖均扮演着重要的角色。其中广泛存在的糖缀合物，包括糖蛋白、蛋白聚糖和糖脂，参与了蛋白的靶向、细胞识别以及抗体-抗原相互作用等重要生理过程，对其结构和功能的研究成了继DNA和蛋白之后又一重要课题而倍受人们的重视。1988年，出现了糖生物学这一新学科来研究糖缀合物糖链的结构、生物合成和生物学功能。
糖缀合物存在于细胞膜外表面，起到了保护细胞膜和与外界通讯的作用。近年来，人们尝试将糖基固定到不同载体表面，比如二氧化硅、金纳米粒子以及膜分离材料，来模拟糖的各种生物功能，从而深入研究糖与蛋白质的亲和性相互作用，实现了对蛋白质的检测和分离。公开号为CN1200739的专利文献中公开了一种采用等离子体法将α-烯丙基葡萄糖固定到疏水性人工晶体的方法，糖基的引入提高了人工晶体的生物相容性。美观专利US 20010017270中公开了将糖基固定到金表面，可用于蛋白质、病毒或是细胞的检测的技术。公开号为CN 1935342和CN 101070401的专利文献中分别公开了把糖基固定到聚丙烯膜表面和聚丙烯微球表面的方法，有利于蛋白的分离、浓缩或靶向清除。最近，也有利用表面糖探针的特异识别性作用，将糖基修饰材料拓展到聚糖微阵列、生物芯片等应用领域。
静电纺丝技术是一种获得纳米到微米尺寸纤维材料的方法，近年来引起了重视。目前，静电纺丝可以用于100多种聚合物纳米纤维的制备。美国专利US 20030215624和US 20040013873中将常见的聚合物诸如：聚乙烯醇、聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚砜、聚碳酸酯、聚氨酯、聚甲基丙烯酸酯、聚氯乙烯、聚酰胺、聚丙烯酸酯、聚乙烯吡咯烷酮等通过静电纺丝制备成纳米纤维。公开号为CN 1843592的专利文献中公开了以糖基化丙烯腈共聚物为原料，通过静电纺丝法制备了含糖纳米纤维膜，制备方法简单，对蛋白质具有一定的特异性识别效果。由于具有高比表面积和高空隙率等优点，力学性能优良的纳米纤维膜往往也是一种很好的载体材料。公开号为CN 1837266和CN 1948474的专利文献中分别公开了采用静电纺丝技术分别制备磷脂改性腈纶纳米纤维和壳聚糖纳米纤维用于酶固定化，都显著提高了固定化酶的载酶量和催化效率。Hai-Quan Mao小组制备了半乳糖修饰的纳米纤维膜用作肝细胞培养的支架材料(Chua KN，Lim WS，Zhang PC，Lu HF，Wen J，Ramakrishna S，Leong KW，Mao HQ“Stableimmobilization of rat hepatocyte spheroids on galactosylated nanofiberscaffold”《Biomaterials》2005，26：2537-2547)，实验发现其有利于促进肝细胞的聚集，在肝组织工程方面有着潜在的应用前景。
为了提高糖基的固定化率，充分发挥糖基的集簇效应(指大量糖基通过一定的方式在空间上聚集在一起，其与蛋白质的特异性相互作用要远远高于等数目糖基单独作用的加和)，引入“点击化学”(Click chemistry)方法来实现糖基修饰是一个比较可行的方法。“点击化学”是由Sharpless首先提出来(Kolb HC，Finn MG，Sharpless KB Click chemistry：Diversechemical function from a few good reactions.Angew.Chem.Int.Ed.2001，40：2004-2021)，常用的反应类型是1，3-偶极环加成反应，即炔基和叠氮基形成1，2，3-三唑的反应。由于具有快速、有效、高选择性、高收率等优点，在高分子合成化学领域的应用越来越多。专利申请WO 2005087818公开了在带有特定功能基的聚合物上通过“点击化学”方法引入新的功能基，得到了新功能聚合物。公开号为CN 101022895公开了的专利文献中在金属表面通过“点击化学”方法形成粘合用聚合物涂层。专利申请WO2007011967公开了采用偶极环加成反应制备了功能化的超支化大分子，反应无需保护基团、产率高、且纯化步骤少。专利申请WO 2007003054公开了通过“点击化学”方法将生物大分子固定到合成的聚合物纳米/微米离子表面，可用于药物释放，生物传感器，医用移植材料等方面。近年来，“点击化学”在糖化学的研究中也取得了一定进展，尤其最近，Haddleton小组(Chen GJ，Tao L，Mantovani G，Geng J，Nystrom D，Haddleton DM“Amodular click approach to glycosylated polymeric beads：Design，synthesisand preliminary lectin，recognition studies”《Macromolecules》2007，40：7513-7520)报道了采用“点击化学”方法在聚合物微球表面固定甘露糖基的研究，结果表明微球表面75％摩尔含量的羟基可以转化为糖基。
发明内容
本发明提供了一种获得糖基修饰丙烯腈基共聚物纳米纤维的方法并将其应用于蛋白质的吸附分离。
一种糖基修饰丙烯腈基纳米纤维的制备方法，具体步骤包括：
(1)将丙烯腈基共聚物溶于溶剂中得到溶液A。
所述的溶液A中丙烯腈基共聚物的质量百分含量为2～8％。
所述的丙烯腈基共聚物为丙烯腈/丙烯酸共聚物、丙烯腈/甲基丙烯酸共聚物或丙烯腈/马来酸共聚物，粘均分子量为8～30万，羧基的摩尔含量为5～25％。
所述溶剂为二甲基亚砜、二甲基甲酰氨、二甲基乙酰氨中的一种或以任意比例混合的混合溶剂。
(2)以溶液A为纺丝液，采用静电纺丝法，制备丙烯腈基共聚物纳米纤维。
静电纺丝的纺丝电压为6～25千伏，喷丝头溶液流速为0.5～2.0毫升/小时，接收距离为8～20厘米，得到的纤维直径为60～1000纳米。
(3)将丙烯腈基共聚物纳米纤维浸没在含有复合活化剂和炔基类化合物的磷酸氢二钠/磷酸二氢钾缓冲溶液(pH5.5)中，反应5～20小时，取出后用去离子水、乙醇依次重复清洗、烘干，得到炔基修饰的丙烯腈基共聚物纳米纤维，纤维表面羧基的转化率为10～85％。
所述的炔基类化合物为丙炔胺、丙炔醇、戊炔醇，加入量(摩尔用量)为纤维表面羧基物质的量的1～20倍。
所述的复合活化剂是摩尔比为1∶1的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐在缓冲溶液中的浓度为5～20毫克/毫升。
(4)将上述炔基修饰的丙烯腈基共聚物纳米纤维浸没在含有复合催化剂和叠氮糖的水溶液中，25℃下氮气保护振荡反应10～20小时，取出后用去离子水，乙醇依次重复清洗，烘干，得到糖基修饰丙烯腈基纳米纤维，纤维表面炔基转化率为70～90％。
所述的复合催化剂为五水硫酸铜和抗坏血酸钠，其中五水硫酸铜的加入量(摩尔用量)为纤维表面炔基物质的量的10～20％，五水硫酸铜与抗坏血酸钠的摩尔比为1∶5。
所述的叠氮糖为2-叠氮乙基-α-葡萄糖、2-叠氮乙基-β-葡萄糖、2-叠氮乙基-α-甘露糖、2-叠氮乙基-β-半乳糖、2-叠氮乙基乳糖、1-叠氮-α-葡萄糖、1-叠氮-β-葡萄糖、1-叠氮-α-甘露糖、1-叠氮-β-半乳糖或1-叠氮乳糖，叠氮糖加入量(摩尔用量)是纤维表面炔基物质的量的2倍。
糖基修饰丙烯腈基纳米纤维在蛋白质的分离纯化中的应用。
将糖基修饰丙烯腈基纳米纤维浸入蛋白质混合溶液中，25℃下振荡吸附2小时后，滤出、清洗。利用不同糖基与特定蛋白质的特异性识别作用，纳米纤维会选择性地吸附蛋白质，用高浓度的糖溶液可以把蛋白质从纤维上洗脱下来，从而实现混合液中蛋白质的分离。
本发明主要是利用丙烯腈基共聚物纳米纤维高的比表面积以及优良的力学性能等优点，将其作为糖基固定的载体材料。针对非均相反应糖基固定化率相对较低的问题，将具有专一选择性好、转化率高和操作条件温和等特点的“点击化学”方法引入，大大提高了纤维表面糖基的固定化密度，有助于发挥糖基的集簇效应，从而增加了糖基对特定蛋白质的结合容量，有效地提高了分离效率。
本发明的优点在于：
(1)丙烯腈基共聚物纳米纤维制备简单，直径范围在60～1000纳米内可调，是一类高比表面的载体材料；
(2)“点击化学”方法操作简单，专一性强，可以大大提高纤维表面糖基固定化率，经济实用；
(3)固定化方法适用于任何含叠氮基的单糖和多糖，且无需对糖上羟基进行保护；
(4)糖基是通过化学键键合的方法固定到纳米纤维的表面，稳定性和持久性好；
(5)糖基修饰丙烯腈基纳米纤维用于蛋白质的分离纯化，可以多次重复使用，成本低廉。
附图说明
图1为实施例6得到的糖基修饰纳米纤维的结构示意图。
图2为实施例9得到的糖基修饰纳米纤维的结构示意图。
具体实施方式
本发明中丙烯腈基共聚物的粘均分子量是采用粘度法中的一点法测定；共聚物中羧基含量是采用1H核磁共振谱测定；纳米纤维直径是采用场发射扫描电镜测量；炔基修饰纳米纤维膜表面炔基含量是利用羧基染色法，通过羧基含量的变化量计算得到；糖基修饰纳米纤维膜表面糖基含量是通过元素分析法测定；糖基修饰纳米纤维膜对蛋白质的分离是采用紫外-可见光分光光度计测定。
糖基修饰丙烯腈基共聚物纳米纤维的制备
实施例1
将质量分数为6％的丙烯腈/丙烯酸共聚物(粘均分子量为8.0万，羧基摩尔含量为25.0％)溶于二甲基甲酰胺溶剂中，在纺丝电压为15千伏、喷丝头溶液流速为0.5毫升/小时、接收距离为15厘米的条件下进行静电纺丝，制备成直径为78±23纳米的丙烯腈/丙烯酸共聚物纳米纤维。
将10毫克丙烯腈/丙烯酸共聚物纳米纤维浸入10毫升EDC浓度为20毫克/毫升(EDC/NHS摩尔比为1∶1)的磷酸氢二钠/磷酸二氢钾缓冲溶液(pH5.5)中，丙炔胺加入量为纤维表面羧基物质的量的20倍，反应20小时，取出后用去离子水、乙醇依次重复清洗、烘干，纤维表面羧基转化率为75％。
把上述炔基修饰的丙烯腈/丙烯酸共聚物纳米纤维浸入10毫升2-叠氮乙基-α-葡萄糖水溶液中，然后加入五水硫酸铜和抗坏血酸钠复合催化剂(纤维表面炔基、叠氮糖、五水硫酸铜以及抗坏血酸钠的摩尔比为1∶2∶0.15∶0.75)，25℃下氮气保护振荡反应40小时，取出后用去离子水、乙醇依次重复清洗，烘干，得到糖基修饰纳米纤维，纤维表面炔基转化率为88％，固定化率为835毫克/克纤维。
实施例2
将质量分数为8％的丙烯腈/丙烯酸共聚物(粘均分子量为27.0万，羧基摩尔含量为5.0％)溶于二甲基甲酰胺溶剂中，在纺丝电压为20千伏、喷丝头溶液流速为0.5毫升/小时、接收距离为15厘米的条件下进行静电纺丝，制备成直径为897±36纳米的丙烯腈/丙烯酸共聚物纳米纤维。
将10毫克丙烯腈/丙烯酸共聚物纳米纤维浸入10毫升EDC浓度为5毫克/毫升(EDC/NHS摩尔比为1∶1)的磷酸氢二钠/磷酸二氢钾缓冲溶液(pH 5.5)中，丙炔胺加入量与纤维表面羧基等物质的量，反应10小时，取出后用去离子水、乙醇依次重复清洗、烘干，纤维表面羧基转化率为10％。
把上述炔基修饰的丙烯腈/丙烯酸共聚物纳米纤维浸入10毫升2-叠氮乙基-α-葡萄糖水溶液中，然后加入五水硫酸铜和抗坏血酸钠复合催化剂(纤维表面炔基、叠氮糖、五水硫酸铜以及抗坏血酸钠的摩尔比为1∶2∶0.15∶0.75)，25℃下氮气保护振荡反应40小时，取出后用去离子水、乙醇依次重复清洗，烘干，得到糖基修饰纳米纤维，纤维表面炔基转化率为90％，固定化率为21毫克/克纤维。
实施例3
将质量分数为6％的丙烯腈/丙烯酸共聚物(粘均分子量为8.0万，羧基摩尔含量为25.0％)溶于二甲基甲酰胺溶剂中，在纺丝电压为15千伏、喷丝头溶液流速为0.5毫升/小时、接收距离为15厘米的条件下进行静电纺丝，制备成直径为78±23纳米的丙烯腈/丙烯酸共聚物纳米纤维。
将10毫克丙烯腈/丙烯酸共聚物纳米纤维浸入10毫升EDC浓度为20毫克/毫升(EDC/NHS摩尔比为1∶1)的磷酸氢二钠/磷酸二氢钾缓冲溶液(pH5.5)中，丙炔醇加入量为纤维表面羧基物质的量的20倍，反应20小时，取出后用去离子水、乙醇依次重复清洗、烘干，纤维表面羧基转化率为84％。
把上述炔基修饰的丙烯腈/丙烯酸共聚物纳米纤维浸入10毫升2-叠氮乙基-α-葡萄糖水溶液中，然后加入五水硫酸铜和抗坏血酸钠复合催化剂(纤维表面炔基、叠氮糖、五水硫酸铜以及抗坏血酸钠的摩尔比为1∶2∶0.1∶0.5)，25℃下氮气保护振荡反应10小时，取出后用去离子水、乙醇依次重复清洗，烘干，得到糖基修饰纳米纤维，纤维表面炔基转化率为72％，固定化率为651毫克/克纤维。
实施例4
将质量分数为6％的丙烯腈/丙烯酸共聚物(粘均分子量为8.0万，羧基摩尔含量为25.0％)溶于二甲基甲酰胺溶剂中，在纺丝电压为15千伏、喷丝头溶液流速为0.5毫升/小时、接收距离为15厘米的条件下进行静电纺丝，制备成直径为78±23纳米的丙烯腈/丙烯酸共聚物纳米纤维。
将10毫克丙烯腈/丙烯酸共聚物纳米纤维浸入10毫升EDC浓度为20毫克/毫升(EDC/NHS摩尔比为1∶1)的磷酸氢二钠/磷酸二氢钾缓冲溶液(pH5.5)中，丙炔醇加入量为纤维表面羧基物质的量的20倍，反应20小时，取出后用去离子水、乙醇依次重复清洗、烘干，纤维表面羧基转化率为84％。
把上述炔基修饰的丙烯腈/丙烯酸共聚物纳米纤维浸入10毫升2-叠氮乙基-β-葡萄糖水溶液中，然后加入五水硫酸铜和抗坏血酸钠复合催化剂(纤维表面炔基、叠氮糖、五水硫酸铜以及抗坏血酸钠的摩尔比为1∶2∶0.15∶0.75)，25℃下氮气保护振荡反应40小时，取出后用去离子水、乙醇依次重复清洗，烘干，得到糖基修饰纳米纤维，纤维表面炔基转化率为89％，固定化率为806毫克/克纤维。
实施例5
将质量分数为4％的丙烯腈/甲基丙烯酸共聚物(粘均分子量为18.0万，羧基摩尔含量为11.2％)溶于二甲基乙酰胺溶剂中，在纺丝电压为16千伏、喷丝头溶液流速为0.5毫升/小时、接收距离为15厘米的条件下进行静电纺丝，制备成直径为218±20纳米的丙烯腈/甲基丙烯酸共聚物纳米纤维。
将10毫克丙烯腈/甲基丙烯酸共聚物纳米纤维浸入10毫升EDC浓度为5毫克/毫升(EDC/NHS摩尔比为1∶1)的磷酸氢二钠/磷酸二氢钾缓冲溶液(pH5.5)中，丙炔胺加入量与纤维表面羧基等物质的量，反应20小时，取出后用去离子水、乙醇依次重复清洗、烘干，纤维表面羧基转化率为15％。
把上述炔基修饰的丙烯腈/甲基丙烯酸共聚物纳米纤维浸入10毫升2-叠氮乙基-α-甘露糖水溶液中，然后加入五水硫酸铜和抗坏血酸钠复合催化剂(纤维表面炔基、叠氮糖、五水硫酸铜以及抗坏血酸钠的摩尔比为1∶2∶0.1∶0.5)，25℃下氮气保护振荡反应20小时，取出后用去离子水、乙醇依次重复清洗，烘干，得到糖基修饰纳米纤维，纤维表面炔基转化率为83％，固定化率为205毫克/克纤维。
实施例6
将质量分数为4％的丙烯腈/甲基丙烯酸共聚物(粘均分子量为18.0万，羧基摩尔含量为11.2％)溶于二甲基乙酰胺溶剂中，在纺丝电压为16千伏、喷丝头溶液流速为0.5毫升/小时、接收距离为15厘米的条件下进行静电纺丝，制备成直径为218±20纳米的丙烯腈/甲基丙烯酸共聚物纳米纤维。
将10毫克丙烯腈/甲基丙烯酸共聚物纳米纤维浸入10毫升EDC浓度为10毫克/毫升(EDC/NHS摩尔比为1∶1)的磷酸氢二钠/磷酸二氢钾缓冲溶液(pH5.5)中，丙炔胺加入量为纤维表面羧基物质的量的10倍，反应20小时，取出后用去离子水、乙醇依次重复清洗、烘干，纤维表面羧基转化率为49％。
把上述炔基修饰的丙烯腈/甲基丙烯酸共聚物纳米纤维浸入10毫升2-叠氮乙基-β-半乳糖水溶液中，然后加入五水硫酸铜和抗坏血酸钠复合催化剂(纤维表面炔基、叠氮糖、五水硫酸铜以及抗坏血酸钠的摩尔比为1∶2∶0.1∶0.5)，25℃下氮气保护振荡反应20小时，取出后用去离子水、乙醇依次重复清洗，烘干，得到糖基修饰纳米纤维，纤维表面炔基转化率为79％，固定化率为61毫克/克纤维。
实施例7
将质量分数为3％的丙烯腈/马来酸共聚物(粘均分子量为24.0万，羧基摩尔含量为7.8％)溶于二甲基乙酰胺溶剂中，在纺丝电压为20千伏、喷丝头溶液流速为0.5毫升/小时、接收距离为15厘米的条件下进行静电纺丝，制备成直径为243±26纳米的丙烯腈/马来酸共聚物纳米纤维。
将10毫克丙烯腈/马来酸共聚物纳米纤维浸入10毫升EDC浓度为10毫克/毫升(EDC/NHS摩尔比为1∶1)的磷酸氢二钠/磷酸二氢钾缓冲溶液(pH5.5)中，丙炔胺加入量为纤维表面羧基物质的量的10倍，反应20小时，取出后用去离子水、乙醇依次重复清洗、烘干，纤维表面羧基转化率为49％。
把上述炔基修饰的丙烯腈/马来酸共聚物纳米纤维浸入10毫升2-叠氮乙基乳糖水溶液中，然后加入五水硫酸铜和抗坏血酸钠复合催化剂(纤维表面炔基、叠氮糖、五水硫酸铜以及抗坏血酸钠的摩尔比为1∶2∶0.1∶0.5)，25℃下氮气保护振荡反应20小时，取出后用去离子水、乙醇依次重复清洗，烘干，得到糖基修饰纳米纤维，纤维表面炔基转化率为79％，固定化率为132毫克/克纤维。
实施例8
将质量分数为6％的丙烯腈/丙烯酸共聚物(粘均分子量为8.0万，羧基摩尔含量为25.0％)溶于二甲基亚砜溶剂中，在纺丝电压为15千伏、喷丝头溶液流速为0.5毫升/小时、接收距离为15厘米的条件下进行静电纺丝，制备成直径为78±23纳米的丙烯腈/丙烯酸共聚物纳米纤维。
将10毫克丙烯腈/丙烯酸共聚物纳米纤维浸入10毫升EDC浓度为20毫克/毫升(EDC/NHS摩尔比为1∶1)的磷酸氢二钠/磷酸二氢钾缓冲溶液(pH5.5)中，丙炔胺加入量为纤维表面羧基物质的量的20倍，反应20小时，取出后用去离子水、乙醇依次重复清洗、烘干，纤维表面羧基转化率为80％。
把上述炔基修饰的丙烯腈/丙烯酸共聚物纳米纤维浸入10毫升1-叠氮-α-葡萄糖水溶液中，然后加入五水硫酸铜和抗坏血酸钠复合催化剂(纤维表面炔基、叠氮糖、五水硫酸铜以及抗坏血酸钠的摩尔比为1∶2∶0.15∶0.75)，25℃下氮气保护振荡反应40小时，取出后用去离子水、乙醇依次重复清洗，烘干，得到糖基修饰纳米纤维，纤维表面炔基转化率为86％，固定化率为532毫克/克纤维。
实施例9
将质量分数为4％的丙烯腈/甲基丙烯酸共聚物(粘均分子量为18.0万，羧基摩尔含量为11.2％)溶于二甲基亚砜溶剂中，在纺丝电压为16千伏、喷丝头溶液流速为0.5毫升/小时、接收距离为15厘米的条件下进行静电纺丝，制备成直径为218±20纳米的丙烯腈/甲基丙烯酸共聚物纳米纤维。
将10毫克丙烯腈/甲基丙烯酸共聚物纳米纤维浸入10毫升EDC浓度为20毫克/毫升(EDC/NHS摩尔比为1∶1)的磷酸氢二钠/磷酸二氢钾缓冲溶液(pH5.5)中，丙炔胺加入量为纤维表面羧基物质的量的20倍，反应20小时，取出后用去离子水、乙醇依次重复清洗、烘干，纤维表面羧基转化率为80％。
把上述炔基修饰的丙烯腈/甲基丙烯酸共聚物纳米纤维浸入10毫升1-叠氮-β-半乳糖水溶液中，然后加入五水硫酸铜和抗坏血酸钠复合催化剂(纤维表面炔基、叠氮糖、五水硫酸铜以及抗坏血酸钠的摩尔比为1∶2∶0.15∶0.75)，25℃下氮气保护振荡反应40小时，取出后用去离子水、乙醇依次重复清洗，烘干，得到糖基修饰纳米纤维，纤维表面炔基转化率为84％，固定化率为272毫克/克纤维。
实施例10
将质量分数为3％的丙烯腈/马来酸共聚物(粘均分子量为24.0万，羧基摩尔含量为7.8％)溶于二甲基亚砜溶剂中，在纺丝电压为20千伏、喷丝头溶液流速为0.5毫升/小时、接收距离为15厘米的条件下进行静电纺丝，制备成直径为243±26纳米的丙烯腈/马来酸共聚物纳米纤维。
将10毫克丙烯腈/马来酸共聚物纳米纤维浸入10毫升EDC浓度为10毫克/毫升(EDC/NHS摩尔比为1∶1)的磷酸氢二钠/磷酸二氢钾缓冲溶液(pH5.5)中，丙炔胺加入量为纤维表面羧基物质的量的5倍，反应20小时，取出后用去离子水、乙醇依次重复清洗、烘干，纤维表面羧基转化率为39％。
把上述炔基修饰的丙烯腈/马来酸共聚物纳米纤维浸入10毫克1-叠氮乳糖水溶液中，然后加入五水硫酸铜和抗坏血酸钠复合催化剂(纤维表面炔基、叠氮糖、五水硫酸铜以及抗坏血酸钠的摩尔比为1∶2∶0.1∶0.5)，25℃下氮气保护振荡反应10小时，取出后用去离子水、乙醇依次重复清洗，烘干，得到糖基修饰纳米纤维，纤维表面炔基转化率为73％，固定化率为87毫克/克纤维。
二、糖基修饰丙烯腈基共聚物纳米纤维的应用实例
1、糖基修饰丙烯腈基共聚物纳米纤维对伴刀豆球蛋白的吸附分离
将实例1、4、8制备的糖基修饰纳米纤维(固定化率见表1)50毫克浸入10毫升蛋白质的磷酸盐缓冲溶液中(pH7.4，0.1摩/升)，其中，蛋白质溶液为伴刀豆球蛋白/花生凝集素的混合溶液，浓度各为2毫克/毫升。在25℃下振荡吸附2小时后，将糖基修饰纳米纤维滤出。用1摩尔/升的葡萄糖溶液把吸附的伴刀豆球蛋白洗脱下来，从而实现伴刀豆球蛋白和花生凝集素的分离。洗脱后的糖基修饰纳米纤维可以重复使用。
2、糖基修饰丙烯腈基共聚物纳米纤维对花生凝集素的吸附分离
将实施例6、7制备的糖基修饰纳米纤维(固定化率见表1)50毫克浸入10毫升蛋白质的磷酸盐缓冲溶液中(pH7.4，0.1摩/升)，其中，蛋白质溶液为伴刀豆球蛋白/花生凝集素的混合溶液，浓度各为2毫克/毫升。在25℃下振荡吸附2小时后，将糖基修饰纳米纤维滤出。用1摩尔/升的半乳糖溶液把吸附的花生凝集素洗脱下来，从而实现伴刀豆球蛋白和花生凝集素的分离。洗脱后的糖基修饰纳米纤维可以重复使用。
本发明实施例1～10制备的糖基修饰丙烯腈基共聚物纳米纤维各性能参数如表1所示；实施例1、4、6、7、8得到的糖基修饰的纳米纤维对蛋白质的吸附分离效果如表2所示；不同糖基与其识别的蛋白质对照表如表3所示。
表1
实施例 糖基种类 功能单体  共聚物粘均分子量(×10-4，克/摩) 羧基摩尔含量(％) 纺丝液质量分数(％) 纤维直径(纳米) EDC浓度(毫克/毫升)a 炔胺种类 炔胺含量(等当量)b 反应时间(小时) 羧基转化率(％) 催化剂(等当量)c 反应时间(小时) 炔基转化率(％) 糖基含量(毫克/克纤维)
1   2-叠氮乙基-α-葡萄糖 丙烯酸 8.0 25.0 6 78±23 20 丙炔胺 20 20 75 15％ 40 88 835
2   2-叠氮乙基-α-葡萄糖 丙烯酸 27.0 5.0 8 897±36 5 丙炔胺 1 5 10 15％ 40 90 21
3   2-叠氮乙基-α-葡萄糖 丙烯酸 8.0 25.0 6 78±23 20 丙炔醇 20 20 84 10％ 10 72 651
4   2-叠氮乙基-β-葡萄糖 丙烯酸 8.0 25.0 6 78±23 20 丙炔醇 20 20 84 15％ 40 89 806
5   2-叠氮乙基-α-甘露糖 甲基丙烯酸 18.0 11.2 4 218±20 10 丙炔胺 10 20 52 10％ 20 80 205
6   2-叠氮乙基-β-半乳糖 甲基丙烯酸 18.0 11.2 4 218±20 5 丙炔胺 1 5 15 10％ 20 83 61
7   2-叠氮乙基乳糖 马来酸酐 24.0 7.8 3 243±26 10 丙炔胺 10 20 49 10％ 20 79 132
8   1-叠氮-α-葡萄糖 丙烯酸 8.0 25.0 6 78±23 20 丙炔胺 20 20 70 15％ 40 86 532
9   1-叠氮-β-半乳糖 甲基丙烯酸 18.0 11.2 4 218±20 20 丙炔醇 20 20 80 15％ 40 84 272
10   1-叠氮乳糖 马来酸酐 24.0 7.8 3 243±26 10 戊炔醇 5 20 39 10％ 10 73 87
a：EDC与NHS的摩尔比为1∶1；b：等当量指炔胺相对于羧基的摩尔含量；c：催化剂为五水硫酸铜和抗坏血酸钠，摩尔比为1∶5，等当量是指五水硫酸铜相对于炔基的摩尔含量。
表2
实施例 糖基种类 糖基含量(毫克/克纤维)   伴刀豆球蛋白(毫克/毫升)   花生凝集素(毫克/毫升)
  吸附前   吸附后   吸附前   吸附后
1   2-叠氮乙基-α-葡萄糖 835 2 0 2 1.94
4   2-叠氮乙基-β-葡萄糖 503 2 0.12 2 1.95
6   2-叠氮乙基-β-半乳糖 61 2 1.96 2 0
7   2-叠氮乙基乳糖 132 2 1.93 2 0
8   1-叠氮-α-葡萄糖 532 2 0 2 1.96
表3
  糖基类型   蛋白质  英文全称及缩写   来源
  葡萄糖   伴刀豆球蛋白  Concanavalin A(Con A)   刀豆
  小麦菌凝集素  Wheat germ agglutinin(WGA)   小麦
  马铃薯凝集素  Solanum tubrosum agglutinin(STA)   马铃薯
  甘露糖   豌豆凝集素  Pisum sativum agglutinin(PSA)   豌豆
  扁豆凝集素  Lens culinaris agglutinin(LCA)   扁豆
  雪铃花凝集素  Galanthus nivalus agglutinin(GNA)   雪铃花
  半乳糖   蓖麻凝集素  Ricinus communis agglutinin(RCA)   蓖麻
  花生凝集素  Peanut agglutinin(PNA)   花生
  大豆凝集素  Soybean agglutinin(SBA)   大豆

Claims (10)

1.一种糖基修饰丙烯腈基纳米纤维的制备方法，步骤如下：
(1)将丙烯腈基共聚物溶于溶剂中得到溶液A；
(2)以溶液A为纺丝液，采用静电纺丝法，制备丙烯腈基共聚物纳米纤维；
(3)将丙烯腈基共聚物纳米纤维浸入含有复合活化剂和炔基类化合物的磷酸氢二钠/磷酸二氢钾缓冲溶液中，反应5～20小时，得到炔基修饰的丙烯腈基共聚物纳米纤维；
所述的炔基类化合物为丙炔胺、丙炔醇或戊炔醇；
所述的复合活化剂是1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺；
(4)将炔基修饰的丙烯腈基共聚物纳米纤维浸入含有复合催化剂和叠氮糖的水中，氮气保护反应10～20小时，得到糖基修饰丙烯腈基纳米纤维；
所述的复合催化剂是五水硫酸铜和抗坏血酸钠；
所述的叠氮糖为2-叠氮乙基-α-葡萄糖、2-叠氮乙基-β-葡萄糖、2-叠氮乙基-α-甘露糖、2-叠氮乙基-β-半乳糖、2-叠氮乙基乳糖、1-叠氮-α-葡萄糖、1-叠氮-β-葡萄糖、1-叠氮-α-甘露糖、1-叠氮-β-半乳糖或1-叠氮乳糖。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)所述的丙烯腈基共聚物为丙烯腈/丙烯酸共聚物、丙烯腈/甲基丙烯酸共聚物或丙烯腈/马来酸共聚物，丙烯腈基共聚物的粘均分子量为8～30万，丙烯腈基共聚物中功能单体即羧基的摩尔含量为5～25％。
所述的溶液A中丙烯腈基共聚物的质量百分含量为2～8％。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)所述的溶剂为二甲基亚砜、二甲基甲酰氨、二甲基乙酰氨中的一种或以任意比例混合的多种。
4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(2)所述的静电纺丝的纺丝电压为6～25千伏，喷丝头溶液流速为0.5～2.0毫升/小时，接收距离为8～20厘米，纤维直径为60～1000纳米。
5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(3)所述的炔基类化合物的加入量为丙烯腈基共聚物纳米纤维表面羧基物质的量的1～20倍。
6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(3)所述的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1∶1；1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐在缓冲溶液中的浓度为5～20毫克/毫升。
7.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(4)所述的五水硫酸铜和抗坏血酸钠的摩尔比为1∶5；五水硫酸铜的加入量为炔基修饰丙烯腈基共聚物纳米纤维表面炔基物质的量的10～20％。
8.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(4)所述的叠氮糖的加入量是炔基修饰丙烯腈基共聚物纳米纤维表面炔基物质的量的2倍。
9.如权利要求1所述的制备方法制备的糖基修饰丙烯腈基纳米纤维。
10.如权利要求9所述的糖基修饰丙烯腈基纳米纤维在蛋白质的分离纯化中的应用。
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