CN102387858B - 使用非均相催化剂的点击化学 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于通过点击反应使用非均相催化剂系统偶联分子的新的方法和试剂。此外，本发明涉及用于进行点击反应的新的装置。

Description

使用非均相催化剂的点击化学
本发明涉及用于通过点击反应(Click reaction)使用非均相催化剂系统偶联分子的新的方法和试剂。此外，本发明涉及用于进行点击反应的新的装置。
发明背景
在2001/2002年Sharpless和Meldal的小组独立地定义了“点击化学”的概念和将转化认为是点击反应的标准[2]和[3]。自此，铜催化的由叠氮化物与炔类得到1，2，3-三唑类(1，3-偶记Huisgen环加成[1])的反应就被成了应用最广泛的点击反应。由于其条件温和且效率高，该反应在生物学和材料科学中得到了非常广泛的应用，诸如目的为DNA标记方面的应用[16]。
当应用于生物分子标记时该方法的限制之一涉及Cu(I)作为点击反应催化剂的应用。Cu-离子对细菌和哺乳动物细胞是有毒的，因而限制该反用于活体系统内部。此外，对于DNA和RNA，由于Cu-离子催化磷酸二酯水解，因此不恰当的操作催化剂能引起寡核苷酸类的降解[17、18]。这些问题的解决方法已经有报道，包括原位Cu(I)生成和/或使用Cu(I)-稳定配体。后者受限于底物和实验条件，其耐受点击反应所用的用以溶解有机配体(通常为叔胺)的有机溶剂的存在。加入甚至是小量的有机溶剂后分子诸如蛋白质或长DNA链最终沉淀或形成不溶解的附聚物，因而对点击反应的产出有负面影响。
在任何情况中，游离Cu(I)离子在环境条件下存在时间有限，其被氧化为点击反应-无活性的Cu(II)。所以，为点击反应新鲜制备的Cu(I)配体混合物的操作需要小心和迅速。因此该方法只能用在劳动密集型的手工作业中，但不能用在自动化过程中。
依据最新的综述[4]，在硫酸铜(II)(约1％)和抗坏血酸钠(约10％)存在下点击反应足以在含水介质(例如H2O/tBuOH)中原位生成催化活性的Cu(I)，且通常是优选的。作为选择的条件，诸如原位氧化Cu(0)或直接引入Cu(I)盐(通常为CuI或CuBr)也被已使用[5]。当两个反应配偶体均已在固相条件下各自被偶联时(例如在聚苯乙烯上)[3、6]，鲜见由非均相铜(I)源介导的点击化学的实例。有一个报道依赖于通过基于聚苯乙烯的苄型胺螯合于可能不稳定的铜[7a]。其中只研究了无阻碍的、低分子量的和非碱性含氮的实例，而没有定量的从固体载体损失铜的数据。基于未被负载的铜簇的混悬液的其它的研究也受到了限制[7b]。
Lipshutz等人最近描述了炭载铜(Cu-C)作为用于该新领域的简单、价廉且尤其是广泛和高效的非均相催化剂的优点[19]。据报道，在水中使用超声波浴将Cu(II)源、例如Cu(NO3)2)浸透活性木炭(Aldrich，100目，$53.90/千克)[8]，将水蒸馏，并干燥后，可得到纳米粒-尺寸的Cu(I)-C[9]。该Cu(I)由Cu(II)产生，不是在原位还原反应中产生，而是经由炭介导的还原反应产生，这使得这样产生的Cu(I)源的预组装和存储时间延长。由于CuO和Cu2O两者均被提出过作为在炭基质内的物质[10]，所以Cu(I)的出现表明可能不需要还原剂。实际上，该作者已经证实在室温在10mol％Cu-C存在下一旦将苄基叠氮与苯乙炔(1∶1)在二烷中混合，环加成10小时内完成。过滤和溶剂蒸发后区域专一性地且近乎定量地得到纯的三唑[19]。此外，Lipshutz等人证实在溶液中没有游离Cu(I)，确证了该点击反应事件的非均相性质。
总之，Lipshutz等人报道了可以通过包埋在活性炭细孔中的铜纳米粒非均相催化有机叠氮化物与末端炔类之间的高效的点击化学[9]。此外，该作者还展示反应能用化学计量的Et3N加速或通过简单地增加该反应的温度而加速。在微波辐照下，能在150℃形成三唑类。环加成能在纯有机介质中、含水溶剂混合液中或在纯水中进行。通常与铜盐的选择有关的溶解度问题、铜污染和产率不高可完全避免。不需要已知可加速点击反应的外部配体。该催化剂似乎不受暴露于空气而影响，表明其保存期限长。其对一个或两个配偶体中的空间位阻耐受良好，且产物分离显著容易，如Lipshutz等人[19]所证明。
在[20]和[21]中还公开了Cu/C催化剂在游离形式的有机分子的点击反应中的应用。然而这些文献中没有一篇描述了其中点击配偶体之一被固定于固体载体上的点击反应。
在[16]、[22]、[23]和[24]中公开了涉及生物分子的应用的点击反应。这些反应在可溶解性催化剂的存在的进行。
本发明描述了非均相催化剂的应用，特别是用于标记诸如DNA的生物分子的Cu(I)-C-催化剂的应用，以及许多可行的基于本发明的易用的装置或方法，其中几种在本申请中作为概念验证和实施例显示。
发明概述
本发明涉及在非均相催化剂存在下、优选在水相中对生物分子进行的点击反应，例如用于标记生物分子诸如核酸的点击反应。本发明为新的和易用的生物分子-标记程序以及易于操作的和/或自动化生物分子-标记方案开辟了道路。
该点击反应在下文为1，3-偶极基团、特别是叠氮化物与不饱和的基团、特别是炔烃之间的通过非均相催化剂例如非均相铜(I)或其它的金属催化剂所催化的反应。优选地，该点击反应包括得到5-元杂环基团诸如1，2，3-三唑基团的(3+2)1，3-偶极环加成反应。
本发明的第一个方面涉及将第一个分子与第二个分子通过点击反应偶联的方法，其中第一个分子包含第一个点击官能团，其为点击-反应性的不饱和基团，且第二个分子包含第二个互补的点击官能团，其为能与第一个点击官能团进行点击反应的点击-反应性的1，3-偶极基团，所述方法包括在非均相催化剂存在下将第一个和第二个分子在其中第一个和第二个分子之间发生点击反应的条件下接触，其中第一个和第二个分子之一为生物分子。
本发明的另一个方面涉及将第一个分子与第二个分子通过点击反应偶联的方法，其中第一个分子包含第一个点击官能团，其为点击-反应性的不饱和基团，且第二个分子包含第二个互补的点击官能团，其为能与第一个点击官能团进行点击反应的点击-反应性的1，3-偶极基团，所述方法包括在非均相催化剂存在下将第一个和第二个分子在其中第一个和第二个分子之间发生点击反应的条件下接触，其中第一个和第二个分子之一被固定于固体载体，例如被固定于非均相催化剂和/或被固定于另外的固体载体物质，例如色谱填料。在该实施方案中，点击反应可被视为“在固体载体上点击”。
本发明的另一个方面涉及具有至少一个反应室的装置，其中所述反应室包含用于进行点击反应的非均相催化剂并任选地包含另外的固体载体物质，其中点击反应的配偶体可被固定于所述非均相催化剂和/或被固定于所述另外的固体载体物质，特别是用于上文所述的方法。
本发明的另一个方面涉及具有至少一个反应室的装置，其包含用于点击反应的非均相催化剂并任选地包含被固定于前述非均相催化剂上的用于点击反应的配偶体之一、优选包含点击-反应性的1，3偶极基团的配偶体。
本发明的另一个方面涉及用于点击反应的试剂盒，其包含具有至少一个反应室的装置，其中所述反应室包含用于进行点击反应的非均相催化剂并任选地包含另外的固体载体物质，其中点击反应的配偶体可被固定于所述非均相催化剂和/或被固定于所述另外的固体载体物质，且包含第一个和第二个分子，其中第一个分子包含第一个点击官能团，其为点击-反应性的不饱和基团，且第二个分子包含第二个互补的点击官能团，其为点击-反应性的1，3-偶极基团。
本发明的另一个方面涉及以上方法和用于制备标记的生物分子的试剂的应用。这些标记的生物分子可用于检测被分析物，例如样品中的核酸，特别涉及通过点击反应标记的化合物的应用，其与待检测的被分析物形成结合产物。
该方面的实施方案涉及用于检测样品中的被分析物的方法，其包括以下步骤：
(i)提供具有至少一个反应室的装置，
其中所述反应室包含用于进行点击反应的非均相催化剂并任选地包含另外的固体载体物质，其中点击反应的配偶体可被固定于所述非均相催化剂和/或被固定于所述另外的固体载体物质。
(ii)在所述反应室中、在非均相催化剂存在下，将作为第一个点击配偶体的第一个分子与作为第二个点击配偶体的第二个分子在其中第一个和第二个分子之间发生点击反应的条件下接触，其中第二个分子优选包含报道基团或报道前体基团，
(iii)如需要，则将报道前体基团转化为报道基团，
(iv)将第一个分子和第二个分子的偶联产物与样品在允许检测被分析物的条件下接触，和
(v)定性地和/或定量地检测被分析物，优选通过所述报道基团进行。
优选地，被分析物检测包括自动化操作。更优选所述点击反应和被分析物检测在单一的一体化装置内进行。
本发明可高度灵敏地检测被分析物并设计与合成通过适于生命科学研究、分子诊断、药物和纳米技术应用的非均相催化的点击反应而连接的新的轭合物。优选的应用包括但不限于遗传变异性的检测，例如单核苷酸多态性(SNP)、杀虫剂或药物抵抗、耐受或不耐性、基因分型，例如有机体物种或株系的检测；基因修饰的有机体或株系的检测，或者病原体或有害生物的检测；和疾病的诊断，例如遗传性疾病、变应性疾病、自身免疫疾病或感染性疾病。进一步优选的应用是检测样品中的核酸用于品牌保护，其中使用产品特异性信息对产品诸如农业产品、食品或有价值的商品和/或这些产品的包装进行编码，所述产品特异性信息例如但不限于生产地点、生产日期、经销商等，且其中所述信息使用如上文所述的方法进行检测。
优选实施方案详述
本发明提供了方法和试剂，由此可用报道基团通过点击反应对被分析物进行易用的和特定的标记。此外，本发明提供了方法和试剂，由此通过单个或多个点击反应从两个或多个配偶体形成特定的轭合物。所述点击反应在非均相催化剂存在下在第一个分子和第二个分子之间进行。这些分子之一是包含不饱和的点击-反应性的基团、优选炔基的点击配偶体，其能与点击-反应性的1，3-偶极基团、优选叠氮基团通过点击反应进行反应。另一个分子为互补的点击配偶体，其包含点击-反应性的1，3-偶极基团、优选叠氮基团。
在优选的实施方案中，点击反应配偶体之一或者在多个点击反应的情况下超过一个配偶体可例如通过共价或非共价负载和/或吸附方式被固定于非均相催化剂和/或另外的固体载体物质，从而得到易用的试剂盒。此外，所述试剂盒在洗涤步骤之后可重复使用。
点击-反应性的不饱和基团的优选的实例为亲偶极物质(dipolarophiles)，诸如烯烃和炔烃和具有相关杂原子官能团的分子(诸如羰基类和腈类)。点击-反应性的不饱和基团的尤其优选的实例为炔类。
点击-反应性的1，3-偶极基团的优选的实例为包含一个或多个杂原子的化合物，其能被描述为具有至少一个表示带电荷偶极的中介结构。优选为直链的1，3-偶极基团，例如炔丙基-丙二烯基-型偶极诸如
腈氧化物：
叠氮化物：
重氮烷：
点击配偶体包含可与互补的点击配偶体进行环加成反应的官能团，在所述环加成反应中在点击官能团和反应配偶体之间的形成环连接、例如杂环连接。所述点击反应的尤其优选的实例是叠氮化物和炔基之间的(3+2)环加成，该反应导致形成1，2，3-三唑环。因而，偶联产物可通过包含叠氮化物的配偶体和包含炔基的配偶体进行点击反应而生成。
该点击反应的尤其优选的实施方案包括铜催化的(3+2)环加成反应，例如叠氮化物和炔基之间的反应。作为叠氮化物/炔烃环加成反应的结果的1，2，3-三唑类的不可逆的形成是正交的(orthogonal)，所需的化学基团小(掺入而对生物分子的环境破坏最小)且具有选择性，原因是自然界中没有叠氮化物和炔类。
其中R1和R2为第一个和第二个分子。
本发明的方法包括在非均相催化剂存在下的点击反应。所述非均相催化剂优选为非均相Cu-催化剂，更优选为非均相Cu(I)-催化剂。然而，应当注意的是：可使用其它的非均相金属催化剂诸如Zr、W、Fe、Ru、Co、Rh、Ir、Ni、Pd、Pt、Ag、Au、Zn、Cd、Hg和对点击反应连接的催化有直接或间接作用的其它的金属离子。在优选的实施方案中，所述非均相催化剂为金属-C-催化剂，即包含基于碳的载体的催化剂，诸如其中掺入金属离子、例如Cu(I)-离子的炭。在尤其优选的实施方案中，所述非均相催化剂为Cu(I)-C-催化剂，例如Cu(I)-炭催化剂，其可如[19]中所述而制备。
适合的Cu(I)-炭催化剂的及其制备的简图描述如图1a中所示。将木炭装载Cu(II)源，Cu(II)源被炭还原并掺入其中，由此得到稳定的Cu(I)源。在第一个和第二个分子之间的点击反应的优选的实施方案，即在非均相催化剂存在下DNA-炔烃和叠氮化物之间的反应如图1b中所示。
非均相催化剂可以是微粒催化剂，例如由10nm至1000μm大小的粒子构成的非均相催化剂，优选10μm至200μm或10nm至1000nm的粒子。或者，催化剂还可以是多孔的非微粒催化剂，例如其中包埋催化活性粒子的固体基质。
此外，该反应可在以下条件下进行：其中该反应配偶体之一被固定于固体载体物质，所述固体载体物质能与点击反应的试剂和/或产物(核酸或其它的点击配偶体)发生物理的相互作用。所述固体载体物质优选为例如能固定点击反应的配偶体的微粒或非微粒固体物质的固体载体物质。在一个实施方案中，所述固体载体物质可以是非均相催化剂，例如Cu(I)-C-催化剂，其上可吸附例如点击-官能团化报道分子，例如荧光或非荧光染料或生物素。在另一个实施方案中，所述固体载体物质为不同于非均相催化剂的物质，例如固定有生物分子、诸如核酸、核酸类似物、蛋白质或肽的色谱填料。在这些实施方案中，点击反应能在以下条件下进行：其中第一个和/或第二个反应配偶体被固定于固体载体，且另一个配偶体为在溶液中的游离态。
适合的色谱填料的实例为离子交换材料、亲水材料或疏水材料。在一个优选的实施方案中，亲水材料、例如硅胶能与非均相催化剂、例如Cu(I)/C组合使用。在另一个优选的实施方案中，疏水材料、例如二氧化硅C18或C4或离子交换树脂能与非均相催化剂、例如Cu(I)/C组合使用。在另一个优选的实施方案中，所述固体载体物质可以是用于生物分子、例如核酸、核酸类似物、蛋白质或肽类的固相合成的树脂。
令人惊讶发现非均相催化剂系统可有效地催化固定的反应配偶体(例如共价的或非共价固定的反应配偶体)和在溶液中游离的反应配偶体之间的点击反应。所述策略可同时完成点击反应以及产物从杂质和/或最终出现在试剂溶液中的盐中的纯化和/或分离。
在本发明一个优选的实施方案中，点击反应在包含至少一个反应室的装置中进行，例如移液器吸头、旋转柱(spin column)、生物芯片上或微量滴定板中的反应室等。所述反应室包含非均相催化剂并任选地包含上文所述的用于固定反应配偶体的另外的固体载体物质。所述催化剂和载体物质可处于单一反应室中，例如作为粒子的物理混合物或作为非均相固体基质或在该反应室中的分隔的各隔室中。
各点击反应配偶体可同时或依次放入反应室。如果反应室包含固体载体，优选在发生固定化的条件下首先放入待固定于反应室的反应配偶体。在该实施方案中，固定的反应配偶体优选为生物分子、例如核酸或肽或多肽。然后，可在其中固定的和游离的点击配偶体可完成点击反应的条件下将游离的点击配偶体、例如点击-官能团化报道分子放入反应室。
在另一个优选的实施方案中，固体载体物质(即所述催化剂和/或任选另外的载体物质)可被反应配偶体之一预浸透，并以干燥形式提供。然后可在固定的和游离的点击-配偶体之间发生点击反应的条件下将包含另一个反应配偶体的液体介质通过所述固体载体物质。
非均相催化剂和另外的载体物质各自的量可在很大程度不同。例如，催化剂和另外的载体物质比率可由1∶1000至1000∶1(以重量计)。在点击反应完成后，优选将偶联产物从固体载体物质洗脱，例如通过改变温度和/或介质组分(例如通过改变盐和/或有机溶剂的量等)。
依据本发明所述点击反应优选在含水介质中进行，即在包含至少60％(v/v)、优选至少75％(v/v)、甚至更优选至少90％(v/v)和甚至更优选至少95％(v/v)、98％(v/v)或99％(v/v)水的液体介质中进行。最优选含水介质中没有有机溶剂。除水之外，如需要时，所述液体介质还可包含适合的缓冲物质或其它的辅助剂。或者，该反应可在有机或含水/有机液体介质中使用与相应的非均相催化剂相容的有机溶剂进行。
依据本发明，我们发现非均相催化的点击反应可在环境温度可有效进行。一般情况下，反应温度可以为约4至约80℃或更高的温度，尤其为约10至约40℃。最优选地，所述反应在约15至约25℃的温度进行。
此外，我们发现本发明的非均相催化的点击反应进行得相当快，从而为生物分子的标记提供方便的和简单的方案。例如，反应时间可为约1分钟至约10分钟或更长时间，尤其是约2分钟至约5分钟。在特定的情况中，可能需要较长的反应时间，特别是10分钟至4小时或10分钟至8小时。
非均相催化的点击反应能通过与非均相催化剂和/或与底物相互作用的胺类或其它的分子的存在而加速。在一个优选的实施方案中，将高至10％(v/v)、更优选高至1％(v/v)和最优选地高至0.1％(v/v)的胺加入所述催化剂/试剂混合物。所述胺可以是伯胺、仲胺或叔胺，其可以具有芳族的、杂芳族的、脂肪族的、脂环族的、不饱和的或完全饱和的骨架。优选地，所述胺为叔胺诸如三乙胺。
此外，非均相催化的点击反应能通过不同来源的能量加速，诸如微波或红外辐照。
此外，我们发现所述反应可以在非常小的体积中进行，例如以存在于微量滴定孔中、移液器吸头或旋转柱中的反应体积中进行。例如，所述反应可在具有可从约0.1至约1000μl或更大、优选约0.1μl至约100μl、且更优选约0.1μl至约10μl的体积的反应室中进行。在尤其优选的实施方案中，所述反应在移液器吸头中进行，例如在其中提供了预定量的非均相催化剂的移液器吸头中进行。在另一个优选的实施方案中，所述反应可在已经在其中掺入了预定量的非均相催化剂的旋转柱中进行。在不同的优选的实施方案中，所述反应能在注射器内操作，所述注射器装有多至10ml(用于大规模的点击反应)或1至5ml或优选0.1至1ml的确定量的非均相催化剂。
在本发明的一个实施方案中，第一个和/或第二个分子选自：
(1)天然和人工氨基酸及它们的低聚物和聚合物，诸如肽类、轮烷、糖肽类、蛋白质、酶类、抗体类等，
(2)核酸和核酸类似物，诸如DNA、RNA、LNA、PNA、MeO-RNA、硫代磷酸酯核酸等，
(3)脂质，诸如脂肪酸类及它们的衍生物，例如脂肪酸酯，磷脂类，鞘脂类和包含诸如脂质体、胶束、细胞膜结构的脂质等，
(4)聚合物和生物聚合物或它们的单体、凝胶类和膜类，
(5)病毒类、维生素类、激素类、神经递质诸如多巴胺、肾上腺素、5-羟色胺等，
(6)糖类诸如单糖类、寡糖类和多糖类，
(7)高分子类诸如有机和无机粒子、玻璃表面(glass surface)、硅材料、二氧化硅珠、磁性小珠、金属纳米粒、金属络合物、金属茂合物、树状高分子、糖树状分子(glycodendrimer)、纳米管、富勒烯、量子点。
所述分子已经被用于点击反应，然而，不是与非均相催化剂组合使用。在“用于生物技术和材料科学的点击化学(Click Chemisty forBiotechnology and Materials Science)”(作者Joerg Laham，Wiley 2009)一书中可以找到多方面的概述，其内容被引入本文作为参考。
在优选的实施方案中，第一个和第二个分子之一是生物分子，例如选自核苷类、核苷酸类、氨基酸、肽类、糖类和脂质的分子，其包括天然生成的和人工修饰的核苷酸类或核酸类。更优选地，所述生物分子选自核酸类、其包括修饰的核酸类。所述生物分子可以游离分子或以固定形式出现，例如如上文所述地共价或非共价地结合于固体载体物质。
第一个和第二个分子中的另一个可以是
(i)报道分子，
(ii)亲和性分子，
(iii)固相，
(iv)生物分子，例如蛋白质或脂质，
(v)接头分子或间隔分子，其可包含脂肪族或脂环族基团、芳族或杂芳族基团、烯基、炔基和/或聚合物基团、例如聚乙二醇基团，
(vi)药用的化合物或基团、光敏的基团，和/或氧化还原活性的基团，和/或识别部位。
报道分子可以是能通过已知的分析方法检测的任何分子。优选的报道分子是染料，即通过光学方法可检测的分子。所述染料可以是荧光、发光的或另外的光学可测的染料。所述亲和性分子可以是能与互补的亲和性配偶体特异性地形成非共价的亲合势键的任何分子，所述互补的亲和性配偶体诸如生物素或生物素类似物，其可与链霉抗生物素或抗生物素蛋白形成亲合势键，或半抗原，其可与抗体形成亲合势键。所述固相可以是任何在分析方法中适用的固相，例如芯片(chip)的表面、微孔等或微粒。第二个点击配偶体还可以是任何天然产生的或具有确定或不确定分布的合成的聚合物，例如聚乙二醇，或药物或那些分子的组合。
在尤其优选的实施方案中，第一个分子(为生物分子)与至少一个第二个分子(为报道分子或亲和性分子或者用于与报道分子或亲和性分子偶联的反应性化合物)反应。第一个分子优选包含至少一个炔基且各第二个分子优选包含叠氮基。
在非均相催化剂存在下在含水介质中通过点击反应标记生物分子有巨大优势。这些优势可被总为以下几项：
1.非均相催化剂在环境条件下稳定，且不引起生物分子的破坏，例如在核酸中的链断裂。因此，所述金属催化剂能预先制备并长期存储。对于点击反应而言，这代表这一个非常重要的改善，尤其对与生物分子进行的点击反应而言如此。
2.所述反应可在没有非水溶性金属配体、例如Cu(I)-配体的情况下进行。
3.所述反应能在含水介质中，即在没有有机溶剂诸如DMSO和/或叔丁醇的情况下进行。这些有机溶剂对较长的核酸分子即超过30个核苷酸类的DNA链不是最佳的。此外，这些分子与多肽类不相容或与使用HPLC对反应混合物进行后处理不相容。
4.通过使用非均相催化剂能大幅度减少包括准备、进行反应以及后处理在内的反应时间。
5.所述非均相催化的点击反应能用在自动化操作中，例如用于自动化标记操作诸如用在DNA-自动合成仪上，这扩展了点击化学的工业应用。
6.炭一般用于脱色并纯化反应混合物。
因而，使用非均相基于碳的催化剂、例如Cu(I)/C催化剂的另一个优势是一个步骤的反应-纯化。使用Cu(I)/C与例如保有核酸分子(例如点击反应期间或结束后的寡核苷酸)的C18材料的混合物或基质可增加这一优势的效果，这样做使得可以洗掉样品的盐类和其它的杂质并可以浓缩样品。然后可在适合的洗脱剂、例如1∶1或8∶2或不同组成的乙腈/水存在下，实现产物例如核酸轭合物的最终洗脱。
7.所述反应可在固定有第一个或第二个反应配偶体的固体载体物质存在下进行。这使得所需反应产物可有效纯化和/或分离。
典型的现有技术的点击反应方案(图2)和本发明的有创造性的点击反应方案(图3)的对比表明了以上优势。
在另一个优选的实施方案中，反应配偶体之一(例如点击-反应性的荧光或非荧光染料或生物分子诸如DNA)能预先直接吸附于固体载体，所述固体载体可以是非均相催化剂(例如Cu-C)和/或另外的固体载体物质。由此提供了易用的试剂盒，例如用于生物分子-标记的试剂盒，其包含(a)非均相催化剂并任选地包含另外的固体载体物质，和(b)点击反应的配偶体之一，优选标记物，其可非共价地被固定于所述催化剂和/或另外的固体载体物质。这极大方便了生物分子的标记方案，例如寡核苷酸类或蛋白质，其将实际动手的工作简化为简单地将待标记的所述生物分子分配到包含预吸附的固相(例如Cu-C-荧光素，以获得荧光-标记的-生物分子；Cu-C-生物素；Cu-C-Alexa550，Cu-C-Eterneon等)的反应室中。所述易用的试剂盒也适于自动化操作。
在尤其优选的实施方案中，包含点击-反应性的不饱和基团的第一个分子为如上文所述的生物分子。该生物分子优选包含多个可以相同或不同的点击-反应性的不饱和基团。第二个分子优选为如上文所述报道分子，例如荧光或非荧光染料。
在另一个作为选择的尤其优选的实施方案中，包含点击-反应性的1，3-偶极基团的第二个分子为如上文所述的生物分子。该生物分子可包含单个点击-反应性的1，3-偶极基团。优选地，该生物分子包含多个可以相同或不同的点击-反应性的1，3-偶极基团。第二个分子优选是如上文所述的报道分子，例如荧光或非荧光染料。
本发明的另一个尤其优选的实施方案包括在非均相催化剂存在下在水或含水缓冲液中进行的例如炔烃-修饰的核酸、诸如DNA与叠氮化物-修饰的报道基团、例如荧光或非荧光染料的反应，或者叠氮化物-修饰的核酸、诸如DNA与炔烃-修饰的报道基团、例如荧光或非荧光染料的反应。在所述反应的终点，产物可从原料(如果仍在该溶液中的话)中纯化，例如通过尺寸排阻从原料中分离最终产物，和/或例如通过过滤从非均相催化剂中分离。所述产物在含水溶液中获得，可以在反应后照原样被分析或者使用。
从样品中过滤Cu/C的步骤能在从反应混合物(例如染料、核苷、小分子等)中分离其它的组分的步骤之前、期间和/或之后进行。适合的过滤/纯化系统的实例是用于纯化超过100bp的DNA片段的硅胶膜(例如JenaBioscience)、用于除去未掺入的核苷酸类的离心过滤机单元(例如来自JenaBioscience)、QIAquick PCR纯化试剂盒(来自QIAGEN)，离心过滤机装置(来自Millipore)，Ultra-0.5和Ultra-15离心过滤机装置(来自Millipore)，-MC和-CL离心过滤机装置(来自Millipore)，孔径0.2和0.45μm的13mm和25mm注射器式过滤器(来自PALL Science)，带有醋酸纤维素或尼龙膜的 离心管过滤器(例如膜孔径为0.22或0.45μm)，Vectaspin Micro，AnoporeTM(来自)，Nanosep MF装置，Sample Reservoir过滤器，例如13mm注射器式滤器，0.2μm，用于样品制备和小体积化学过滤的PTFE、尼龙或聚丙烯膜(来自VWR)，EconoSpinTM All-in-1微型旋转柱和适合的接收管，Filterplate 96-孔，1ml，GF/FF，GF/N和GF/B过滤器，RC/5，10-Ultrafiltration-微孔板，5和10kD，96-孔，RC/30和100Ultrafiltration-微孔板，30和100kD，96-孔，和AcroPrep 96和384 Multi-Well Filter Plates(来自PALL)。
本发明还包括被分析物的检测。所述检测可以是定性测定，例如被分析物、例如待分析样品中特定的核酸序列存在或不存在的检测。然而，本发明还能定量检测待检测样品中的被分析物、例如核酸序列。定性和/或定量检测可包括依据本领域已知的方法检测报道基团。
待检测的被分析物优选选自在生物学或环境样品中的被分析物诸如生物分子、药物或有毒化合物。生物分子的实例包括核酸、肽类、多肽类、糖类、脂质、甾体类等。例如，所述被分析物可选自核酸和核苷-、核苷酸-或核酸-结合的分子，例如核苷-、核苷酸-或核酸-结合的蛋白质。更优选地，所述被分析物是核酸，例如能依据已知的技术、特别是杂交技术检测的任何类型的核酸。例如，核酸被分析物可选自DNA，例如双链或单链DNA、RNA或DNA-RNA杂交物。核酸被分析物的特别的实例是基因组DNA、mRNA或源自其的产物，例如cDNA。
本发明的方法能进行依据适于检测被测物、特别是样品中的核酸被分析物的任何已知的测试模式进行。例如，所述方法可涉及被固定于固体表面上的被分析物的检测，所述固体表面诸如膜，例如在免疫印迹、DNA印迹或RNA印迹中，芯片，晶片(array)或微粒诸如小珠。此外，所述检测能在凝胶中进行，例如在凝胶、例如琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶中的样品电泳分离之后进行，通过色谱方法和/或通过质谱方法进行。所述方法可包括测定单个被分析物或并行检测多个被分析物，例如在芯片或微阵列模式中。
所述样品可以是可包含待检测被分析物的任何样品。例如，所述样品可以是生物学样品，诸如农业样品，例如包含植物材料的样品和/或与植物生长、植物材料存储或加工的位置相关的物质。另一方面，所述样品还可以是临床的样品，诸如组织样品或体液样品、诸如血液、血清、血浆等，特别是人类来源的。样品的进一步的类型包括但不限于环境样品、土壤样品、食品样品、法医样品或来自为品牌保护而检测的有价值的商品的样品。
由于其高灵敏度，本发明的方法适于直接检测被分析物而不用放大。例如，可通过DNA印迹法和本发明方法联合进行生物学样品中的被分析物例如基因的检测。然而，应当注意本发明的方法也允许核酸的检测与放大步骤组合，所述放大步骤可依据已知的方案进行，诸如PCR或其改进方法、诸如不对称PCR、实时PCR、逆转录PCR等或其它的放大方案诸如LCR。
在本发明的一个优选的实施方案中，进行被分析物的序列特异性检测，其中例如将样品中具有特异性序列的核酸与其它的核酸序列相区别，或者将样品中能结合特异性核酸序列多肽与其它的多肽类区别。所述序列特异性检测优选包括序列特异性杂交反应，通过所述反应待检测的核酸序列与带有标记基团或标记前体基团的化合物结合。然而，应当注意本发明还可以非序列特异性地检测核酸，例如检测样品中存在的任何核酸。
为鉴定待检测的被分析物，可将所述样品在其中与被分析物、例如核酸形成结合产物的条件下与检测试剂接触，所述检测试剂为点击配偶体，即如上文所述的第一个或第二个分子。在该实施方案中，点击反应可在被分析物存在下进行，即在所形成的结合产物上进行。
在一个不同的实施方案中，通过点击反应第一个和第二个分子进行反应，得到标记的检测试剂，接着将其与待检测的被分析物接触。点击反应和被分析物可通过自动化操作进行、优选在单一的整体设备中进行。
第一个分子可包含单个点击官能团或多个官能团。例如，分子可偶联于包含多个、例如2、3、4、5、6、7、8或更多个如上文所示的点击官能团的树枝状基团。树枝状基团可通过已知的技术合成。第一个分子上的点击官能团可是相同的或不同的，例如未保护的炔基与一种或若干种类型的受保护的炔基的组合，如在WO2008/052775中所述，其内容被引入本文作为参考。在第一个分子包含未保护的和受保护的点击官能团的情况下，可与若干种类型的不同的第二个分子发生连续的反应。
所述点击官能团连接于能与被分析物形成结合产物的分子。所述分子可以是核苷类或核苷酸类化合物，例如核苷或核苷类似物或核苷酸或核苷酸类似物或低聚物或聚合物，例如核酸或核酸类似物。核苷类或核苷酸类化合物是能例如通过化学或酶法被引入核酸或核酸类似物的核苷或核苷类似物或核苷酸或核苷酸类似物。得到的核酸或核酸类似物应当能形成结合产物，例如核酸与被分析物的杂交物。优选地，所述化合物包含碱性部分，例如核苷碱基或能与核苷碱基形成碱基对的另外的杂环碱性部分，以及骨架部分，在核苷或核苷酸中例如包含糖基并任选地包含磷酸基或在核苷或核苷酸类似物中包含不同的骨架部分。
优选的官能团化核苷类化合物的实例，其中核苷碱基是7-dN-G、C、7-dN-A或T。
优选地，所述点击官能团连接于碱性部分，例如连接于核苷碱基。然而，所述点击官能团还可连接于骨架部分，例如糖基、磷酸基，或者在核苷或核苷酸类似物的情况中，连接于修饰的糖基、修饰的磷酸基或肽骨架部分等。优选地，所述官能团以共价方式经直接的键或间隔分子连接于所述化合物。如果连接经间隔分子实现，所述间隔分子可包含脂肪族基团或脂环族基团、芳族或杂芳族基团、烯基和/或炔基和/或聚乙烯基团。
在官能团化的核苷、核苷酸和核酸中，点击基团优选连接于核苷碱基，其选自天然产生的和非天然产生的嘌呤和嘧啶碱基。优选地，所述核苷碱基选自胞苷、尿嘧啶、胸腺嘧啶、腺嘌呤、鸟嘌呤、7-脱氮腺嘌呤(7-deazaadenine)、7-脱氮鸟嘌呤(7-deazaguanine)、肌苷和黄嘌呤。官能团优选连接于嘧啶核苷碱基的5或6位、更优选连接于嘧啶核苷碱基的5位，或者连接于嘌呤核苷碱基的7或8位、更优选连接于嘌呤核苷碱基的7位，特别是如果需要酶法进入核酸时如此。
点击官能团、即不饱和基团和1，3-偶极基团分别以共价方式连接于第一个或第二个分子。一个或这两个基团均可经由接头基团连接于各自的分子。优选地，至少所述1，3-偶极基团经由接头基团连接于其分子。含接头基团的基团可通过直连键或通过具有长度多至20个原子的链的接头基团连接于其分子。所述接头基团可具有1-20个或更多个原子的长度，且是柔性的，例如基于亚烷基的接头基团，任选地包含诸如O、S和/或N的杂原子，或者是至少部分刚性的，例如包含至少一个刚性基团的接头基团，所述刚性基团选自烯基、炔基、环状基团、特别是芳族或杂芳族基团，还有脂环族基团及它们的组合
第一个或第二个分子和/或它们的偶联产物可以是能够与待检测的被分析物形成结合产物。
例如，第一个或第二个分子可以是包括修饰的核苷酸或核酸的核苷酸或核酸。依据本发明术语“核苷酸”尤其涉及核糖核苷酸类，2′-脱氧核糖核苷酸类或2′、3′-双脱氧核糖核苷酸类。核苷酸类似物可选自糖-或骨架修饰的核苷酸类，特别是能以酶法引入核酸的核苷酸类似物。在优选的糖-修饰的核苷酸中，核糖的2′-OH或H-基团被选自OR、R、卤素、SH、SR、NH2、NHR、NR2或CN的基团所代替，其中R是C1-C6烷基、烯基或炔基且卤素是F、Cl、Br或I。核糖自身可以被其它的碳环或杂环5-或6-元基团诸如环戊烷或环己烯基团所代替。在优选的骨架修饰的核苷酸中，磷酸(三)酯基团可被修饰的基团例如硫代磷酸酯基团或H-膦酸酯基团所代替。进一步优选的核苷酸类似物包括用于合成核酸类似物的结构单元诸如吗啉代核酸、肽核酸、锁核酸或硫代磷酸酯。
点击-或官能团化核酸可以是寡核苷酸类，例如具有多至30个核苷酸(或核苷酸类似物)结构单元的长度的核酸，或具有多于30个核苷酸(或核苷酸类似物)结构单元的长度的聚核苷酸类。优选地，所述核酸和核酸类似物能特异性地与被分析物结合，例如在试验条件下能与核酸被分析物杂交。最小的长度优选为12个且更优选为14个核苷酸(或核苷酸类似物)结构单元。
官能团化核酸或核酸类似物结构单元可通过用于化学合成的标准技术和/或酶法引入核酸，如WO2006/117161中所述其内容被引入本文作为参考。本发明的方法提供了多个检测被分析物的实施方案。用于检测核酸的方法在例如WO2006/117161中描述，其内容被引入本文作为参考。
在另一个实施方案，可采用本发明的方法对活细胞(例如包括哺乳动物或人细胞的真核细胞，或原核细胞)进行体内标记。所述方法在例如WO2007/50811和WO 2007/120192中描述，其内容被引入本文作为参考。在该实施方案中，所述反应可在适于接收和/或维持活细胞的反应室中进行。
用于检测其它的被分析物、诸如多肽类、碳水化合物或脂质、药物或有毒物质的方法可依据基本已知的方法进行，然而，其涉及包含聚乙二醇点击官能团、例如聚乙二醇-叠氮基团的试剂的应用，或者涉及该试剂与互补的点击配偶体的偶联产物的应用，如上文详述。
例如，本发明的检测方法可通过任何已知的检测方案进行，例如涉及固体载体的应用。例如，可提供能与待检测的被分析物结合、例如杂交的固体载体(例如芯片或晶片或微粒材料诸如小珠)，捕获试剂结合于所述载体。固相结合的被分析物的检测可通过以下方法进行：使用固相结合被分析物，随后对该结合了的试剂进行检测。该方法特别适于农业和临床领域的诊断应用，例如用于检测被分析物，例如来自植物(例如基因修饰的物质)的DNA和/或mRNA，来自病原体或植物有害生物等的DNA。
报道分子中标记基团的检测可依据已知的方法进行。例如，通过光学方法和/或电方法可定性和/或定量测定金属沉积。荧光标记基团可通过已知的荧光测定方法定性和/或定量地测定，例如经适合的光源诸如激光激发并检测发出的荧光。
在优选的实施方案中，本发明的方法和试剂盒用于农业应用。例如，本发明适于检测来自植物、植物病原体或植物有害生物诸如病毒、细菌、真菌或昆虫的核酸。此外，本发明适于检测遗传变异性，例如植物、植物各部分、植物病原体或植物有害生物(诸如昆虫)中的SNP。
进一步的应用是检测或监测有机体或有机体群体中除草剂、杀真菌剂或杀虫剂的抵抗、耐受或不耐性，例如其在真菌、昆虫或植物中的抵抗、耐受或不耐性。本发明还适于快速基因分型，例如适于快速检测和/或区分真菌、昆虫或植物的物种或株系。此外，可能用于检测和/或区分基因修饰的有机体或株系，例如真菌、昆虫或植物的有机体或株系。
此外，本发明适于的医药、诊断和法医应用，例如在人医学或兽医学中的应用，例如用于检测来自病原体的核酸，例如人的病原体或牲畜类或宠物动物的病原体的核酸。
进一步优选的应用包括遗传变异性的检测、例如人的SNP的检测，或者药物的抵抗、耐受或不耐性或者变应性的检测。此外，本发明适于基因分型、特别是人的基因分型以确定与素因或紊乱、变态反应和不耐性的风险增加相关的突变。本发明还可用于检测基因修饰有机体或株系、细菌或病毒的有机体或株系以及基因修饰的牲畜等。本发明特别适于快速疾病的诊断，例如遗传疾病、变应性疾病、自身免疫疾病或感染性疾病。
此外，本发明适于检测基因的功能和/或表达，例如用于研究目的。
另一个实施方案是用于品牌保护的方法的应用，例如用于检测在产品中编码的特定的信息，所述产品诸如有价值的商品如植物保护产品、药物、化妆品和精细化学品(例如维生素和氨基酸)和饮料产品、燃料产品(例如汽油和柴油)、消费类电子产品，以上均能被标记。此外，能标记这些产品或其它的产品的包装。所述信息通过核酸或核酸类似物编码，所述核酸或核酸类似物已被掺入产品和/或产品的包装。所述信息可涉及制造商的确定、生产地点、生产日期和/或经销商。通过本发明能对产品特定数据进行快速检测。样品可由产品的等分试样制备，然后将其与一个或若干能检测样品中核酸-编码的信息存在的序列特异性的官能团化杂交探针接触。
本发明还适合营养物领域。例如，在饲料领域，动物营养物、例如玉米中补充有较大数量的防腐剂诸如丙酸。通过应用本发明的方法，能减少防腐剂的添加。此外，使用本发明方法进行基因组分析可以预测个体利用特定营养物的能力(营养基因组学)。
另一个优选的实施方案涉及实验胚胎学领域。该实施方案特别涉及DNA的分析，例如关于胞嘧啶碱基甲基化的基因组DNA。在该实施方案中，所述DNA可用胞嘧啶-特异性试剂处理，例如肼和/或羟胺。通过所述处理，会发生胞嘧啶或甲基胞嘧啶残基的选择反应。例如，使用羟胺处理导致胞嘧啶残基的选择性修饰。优选地，加入亚化学计量量的所述试剂以获得部分修饰，例如胞嘧啶基团的部分修饰。然后例如使用至少一个如上文所示的修饰的核酸结构单元、例如dU和/或dC碱基通过引物延伸反应分析处理过的DNA。优选使用点击修饰的碱基、例如炔烃-修饰的碱基。所述引物延伸反应得到来自该反应在修饰的dC或5-甲基-dC碱基中断的特征性测序梯。
涉及非均相催化的点击反应的本发明的方法和试剂可应用于若干特定的实施方案中。一个实施方案包括生物分子的直接标记，所述生物分子例如在合成器上的寡核苷酸类或肽类、例如用于自动化合成生物分子(例如DNA/RNA)的寡核苷酸-合成器。在该实施方案中，当生物分子、例如寡核苷酸或肽以共价方式结合于固相时，可进行所述点击反应或点击反应的至少一个步骤。任选地，在将生物分子从载体物质裂解下后，可与不同的点击配偶体进行进一步的点击反应。其它的实施方案包括在体外和/或体内标记细胞内和细胞外的基因。另一个实施方案包括在核酸扩增模式中标记分子，例如在PCR-模式中进行。此外，还可使用非均相催化剂标记固体表面。其它的优选的实施方案包括在装置(例如，移液器吸头或旋转柱)中标记生物分子，所述装置部分或完全填充有非均相催化剂，且任选地部分或完全填充如上文所述的固体载体物质，包括微流系统(micro-flow system)和HPLC-样应用。
附图描述
图1是(a)Cu(I)炭催化剂的简图描述及其制备和(b)在非均相催化剂存在下第一个和第二个点击官能团化分子之间的反应的简图描述。
图2是用于DNA-标记的现有技术点击反应方案的简图描述。
图3是使用Cu/C催化剂系统的用于核酸标记的本发明有创造性的点击反应方案的简图描述。
图4是涉及包含非均相催化剂系统的移液器吸头的应用的点击反应的简图描述。
图5显示适合用于本发明的旋转柱的典型的实例。
图6是在旋转柱中进行的点击反应的简图描述。
图7是与固定的生物分子诸如DNA进行的点击反应的简图描述。
图8是于固定的报道分子诸如标记物-叠氮化物分子进行的点击反应的简图描述。
图9是使用非均相Cu(I)-C-催化剂和移液器吸头(“点击吸头”(ClickTip))或旋转柱(“点击旋柱”(Click Spin))的用于DNA标记的点击反应方案的优选的实施方案。
实施例1：“点击吸头”(ClickTip)
“点击吸头”是一种具有大致定量体积(例如，0.2-0.6μL或更高)的非均相催化剂(诸如Cu(I))床的移液器吸头(例如，10μL，100μL或1000μL)，催化剂被固体多孔载体负载，例如负载在炭上，优选固定于其末端以避免死体积，任选地存在色谱填料诸如硅胶和/或C18和/或C4和/或离子交换树脂和/或任何其它的能保持一种或多种点击反应组分的材料。催化或促进点击反应或另外的共价键形成的其它的非均相物质能用于类似的装置中。在催化剂上或在色谱填料上可提供以吸附形式的点击反应配偶体之一，例如用于生物分子的标记物。
“点击吸头”移液器吸头简单且易用。可将其置于适合的抽吸器上，例如单-或多-通道移液器，标准的22-号平端HPLC针，或相容的自动化液体处理/样品制备站。对处理样品而言，可将点击-反应性的分子、例如DNA-炔烃和标记物-叠氮化物吸出并分送而通过载体一次或若干次。点击反应在该过程期间在移液器吸头本身发生(图4)。最终将新形成的点击产品、例如DNA/标记物轭合物释放，并最后用新鲜的介质(即水)洗涤ClickTip。对需要更小反应体积(例如，＜1μL)的应用而言，制备包含更小体积载体(例如，0.2μL)的微珠模式。大的反应装备是可能的，其使用较大的吸头(例如，100μL或1000μL)进行。在另一个优选的实施方案中，将非均相催化剂与色谱填料、例如C18或C4或离子交换树脂直接组合以提供一个步骤的反应/纯化的试验。
实施例2：“点击旋柱”(ClickSpin)
“点击旋柱”是用于进行点击反应和之后的分离/纯化的易用的、微量离心机相容的柱。它们由两个分离的部分组成：柱和管(图5)。
用于点击反应的非均相催化剂、例如Cu(I)/炭催化剂可加入柱中，并被固定于其中的玻璃料上，例如用于体积排阻或微粒过滤或离子交换。所述点击反应发生在填充了的柱上，例如通过标准的振荡法(使用例如恒温混匀仪(Thermomixer))进行，或直接在离心步骤期间进行(对于进行迅速的反应)。分离/纯化步骤通过离心完成：固体载体(例如催化剂)被保留在柱中(在过滤器上或在体积排阻材料上)，且产物、例如DNA/染料轭合物被洗脱至管中。当使用体积排阻载体时，分离步骤可以包括从最终未反应的底物纯化产物的步骤(图6)。在另一个优选的实施方案中，将非均相催化剂与色谱填料、例如C18或C4或离子交换树脂直接组合以提供一个步骤的反应/纯化的试验。
实施例3：与固相固定分子进行的点击化学
在本发明的另一个实施方案中，点击配偶体之一可被固定于非均相催化剂和/或另外的固体载体物质、例如实施例1和2中所述的色谱填料上。
在图7中描述了一个实施方案，其中将催化剂与固体载体组合，例如DNA固定的于色谱填料，例如疏水的C18或C4树脂或离子交换树脂。
非均相催化剂(例如Cu(I)炭)和色谱填料(例如C18)的组合使点击反应能在固体载体上发生。该实施方案在图8中以简图描述。
在另一个实施方案中，在将催化剂负载至适合的筒、例如上文所述的“点击吸头”或“点击旋柱”筒中之前，将反应配偶体之一、例如叠氮官能团化的报道分子(RN3)固定于非均相催化剂(例如C/Cu)。为该目的，可将在适合的溶剂中的适合量的官能团化反应配偶体与催化剂接触，且溶剂可被蒸发。由此得到的预浸透的筒准备好与生物分子、例如炔烃-官能团化生物分子诸如DNA进行反应。
例如，报道分子可以选自荧光染料诸如FAM、Cy3、Atto、Eterneon等，选自其它的标记基团、诸如生物素。
所述非均相催化剂可与另外的固体载体物质、例如色谱填料、诸如上文所述的C18组合。
实施例4：用于使用非均相催化剂系统的标记DNA的点击反应方案
将包含炔基的分子(例如DNA)与叠氮化物-修饰的报道基团(例如染料)混合，并与非均相催化剂、例如在适合的装置、例如实施例1和2中所述的“点击吸头”或“点击旋柱”中的Cu(I)-C催化剂接触。该准备步骤的时间多至1分钟。在所述装置中的点击反应优选历时2-5分钟，然而也可考虑更长的反应时间。最后，例如通过可历时1分钟的过滤可对反应产物进行后处理。
该方案的简图描述如图9中所示。
实施例5：在非均相催化剂的存在下的点击反应
5.1Cu/C催化剂的制备
将Darco KB活性炭(15.0g，100目，25％的H2O含量)加入包含搅拌棒的300-mL圆底烧瓶中。将Cu(NO3)2 3H2O(Acros Organics，3.334g，13.80mmol)在去离子的H2O(100mL)中的溶液加入活性炭中，并加入另外的去离子的H2O(125mL)以从烧瓶壁洗下。用氩气清洁烧瓶，并剧烈搅拌30分钟。然后，在正性的氩气流下将烧瓶浸入超声波浴中达1小时，之后将其与氩气净化的蒸馏装置连接，并置于预加热至175-180℃的带有搅拌片的沙浴中。待蒸馏完成，烧瓶温度开始升高，并保持在210℃之下再经过15分钟。待冷却至室温加入甲苯(75mL)以从烧瓶壁洗下。将烧瓶再次置于热的沙浴中，直至甲苯/H2O共沸物已蒸馏。一旦蒸馏完成，再次重复共沸蒸馏。冷却至室温后，在氩气下用甲苯(2×50mL)将黑色的固体洗涤至预干燥的150-mL粗制烧结式漏斗(在真空下)。在真空下将烧结式漏斗上下颠倒5小时直至Cu/C由玻璃料落至收集烧瓶中。然后将收集烧瓶在110-115℃的沙浴在在真空下加热18小时以再次干燥催化剂。将预浸透的炭(约13克)转移并储存在琥珀色瓶中。催化剂的ICP-EAS分析表明负载1.01mmol Cu/g催化剂或6.4wt.％Cu。
由此制备的Cu/C催化剂具有约12个月的有限的储藏期限，如果在惰性气氛下密封存储储藏期限>18个月。
在乙二醇(EG)中的Cu/C的制备：
将120mg Cu/C加入500μl EG中。将该混合物涡旋并离心。
在聚乙二醇(PEG)中的Cu/C的制备：
将120mg Cu/C加入500μl PEG中。将该混合物涡旋并离心。
5.2寡核苷酸的制备
依据标准方法制备包含Z＝C8dC(X)基团的寡核苷酸，其中X在下文进一步定义。
寡核苷酸1：22-mer
5′-CGCGTATCGCTATCGCTATGGZ-3′(序列号：1)
寡核苷酸2：5-mer
5′-ZCTAG-3′(序列号：2)
寡核苷酸3：33-mer
5′-ZAAAT[C][T]AGAGAATCCCAGAATGCGAAACTCAG-磷酸-3′
(序列号：3)
[C]和[T]表示修饰的(LNA)核苷酸类
5.3回收率和转化率的定义
在本文中认为“回收率”是沉淀步骤后得到的寡核苷酸(nmol)的百分比。
在本文中认为“转化率”是在反应中形成的产物的MALDI百分比。
5.4用于MALDI测定的样品制备
反应后，将样品脱盐，并将0.4μl各样品与0.4μl HPA-C基质(羟基-吡啶甲酸+15冠-5)一起点到MALDI靶标上。使用移液器吸头ZipTipc18：(Millipore)通过用水和乙腈洗涤，或使用MFTM-膜滤器0.025μm VSWP(Millipore)将样品脱盐。
5.5使用Cu/C催化剂合成5nt寡核苷酸-PEG轭合物
寡核苷酸2与PEG-8-N3的反应
将1μl PEG-N3和Cu/C加入100μl寡核苷酸2(1.6nmol/μl-＞160nmol总)中，并放入恒温混匀仪中达2小时(900rpi，25℃)。然后将样品用100μl水稀释，并经由Acrodisc 13mm注射器式滤器过滤。将过滤器用另外的100μl水洗涤，将该溶液未经处理地用于HPLC和MALDI分析。将产物经RP-HPLC再次纯化。浓度是使用微量核酸蛋白分析仪(nanophotometer)得到的。
结果：93.8％回收率
序列：3’-GATCU-X(PEG)8NH2
量＊：27nmol；MW.：2005(1567+438)。
＊该量由在260nm测定的30μL溶液的浓度计算，且其涉及溶液中的寡核苷酸浓度(参见5.3)。
其中U-X是：
5.6使用Cu/C催化剂合成33nt寡核苷酸-PEG轭合物
寡核苷酸3与PEG-8-N3的反应
将修饰的33-mer寡核苷酸(寡核苷酸3)用于该反应。其包含5’-炔烃(C8-炔烃-dU)、两个锁核苷(LNA碱基)和3’-磷酸基。
将1μl PEG-N3和Cu/C加入5μl寡核苷酸3(1.56nmol/μl-＞7.8nmol总)中，并放入恒温混匀仪中达2小时(900rpi，25℃)。然后将样品用100μl水稀释，并经由Acrodisc 13mm注射器式滤器过滤。将过滤器用另外的100μl水洗涤，将该溶液未经处理地用于HPLC和MALDI分析。将轭合物(R33-PEG8)经RP-HPLC再次纯化，得到176pmol纯品产物。浓度是使用微量核酸蛋白分析仪得到的。
结果：80％回收率
序列：3’-磷酸-GACTCAAAGCGTAAGACCCTAAGAGA[T][C]TAAAU-X(PEG)8NH2
量＊：O6＝176pmol；MW(g/mol).：10825(10387+438)。
＊所述量由在260nm测定的浓度计算，且它们涉及溶液中的寡核苷酸的浓度(参见5.3)。
其中U-X是：
5.7使用Cu/C催化剂合成5nt寡核苷酸-肽轭合物
将75μl肽-N3(1.2mM→90nmol总)和Cu/C加入75μl寡核苷酸2(1.6nmol/μl→120nmol总)中，振荡2小时(900rpi，25℃)。然后将该样品用100μl水稀释，并经由Acrodisc 13mm注射器式滤器过滤。将过滤器用另外的100μl水洗涤，得到的溶液用于MALDI、RP-HPLC分析和纯化。在280nm使用Nanodrop测定浓度。
结果：97％回收率
肽-N3序列＝XYGQLRNSRAYGQLRNSRA-OH
其中X＝
序列：3’-GATCU-XYGQLRNSRAYGQLRNSRA-OH量：124μg＊(微克)；32.6nmol；MW.：3803
＊所述量由在280nm测定的35μL溶液的浓度计算(参见5.3)。
其中U-X是：
5.8寡核苷酸与生物素的轭合物
将生物素-叠氮化物(0.4μL，326g/mol，20当量)和在EG(5μL)中的Cu/C加入3.8μl寡核苷酸1(6807.5g/mol，5nmol/μl，1当量)中。将水(10μl)用作溶剂。将反应管在恒温混匀仪中在60℃以1000rpi振荡。
6小时后，将溶液用100μl NaOAc(0.3M)稀释，并经由Nanosep旋转柱过滤，用100μl H2O和100μl DMSO/tBuOH(3∶1)预先洗涤所述旋转柱。将过滤过的溶液用100μl NaOAc(0.3M)稀释、随后加入1ml冷的EtOH/Et2O(5％)以沉淀。将该溶液以6000rpi离心20分钟。移去有机相，并加入1ml Et2O。以6000rpi离心20分钟后除去Et2O，并将沉淀在37℃干燥，并将其溶于10μl水中。
结果：44％回收率；20％转化率。
5.9寡核苷酸与FAM的轭合物
5.9.1使用PTFE膜过滤
将FAM(1μl，458g/mol，20当量)和在EG(5μL)中的Cu/C加入3.8μl寡核苷酸1(6807.5g/mol，5nmol/μl，1当量)中。将水(20μl)和5μlDMSO/tBuOH(3∶1)用作溶剂。将反应管在恒温混匀仪中以1000rpi在40℃振荡。
3小时后，将该溶液用200μl NaOAc(0.3M)稀释，并经由0.2μm PTFE膜(VWR)过滤，所述膜经NaOAc(0.3M)预先洗涤(2x100μl)。将过滤过的溶液用100μl NaOAc(0.3M)再洗涤两次、随后加入冷EtOH/Et2O(5％)以沉淀。将该溶液存储在-20℃过夜，以6000rpi离心20分钟。移去有机相，并加入1ml Et2O。以6000rpi离心20分钟后，移去Et2O，并将沉淀在37℃干燥，并将其溶于10μl水中。
结果：65％回收率；40％转化率
5.9.2使用Nanosep旋转柱过滤
将FAM(0.4μl，458g/mol，20当量)和在EG(5μL)中的Cu/C加入寡核苷酸1(3.8μl，6807.5g/mol，5nmol/μl，1当量)中。将水(20μl)用作溶剂。将反应管在恒温混匀仪中以1000rpi在60℃振荡。
6小时后，将该溶液用100μl NaOAc(0.3M)稀释，并经由Nanosep旋转柱过滤，将所述旋转柱预先用100μl H2O和100μl DMSO/tBuOH(3∶1)洗涤。将过滤过的溶液用100μl NaOAc(0.3M)再次稀释、随后加入1ml冷的EtOH/Et2O(5％)以沉淀。将该溶液以6000rpi离心20分钟。除去有机相，并加入1ml Et2O。以6000rpi离心20分钟后，移去Et2O，并将沉淀在37℃干燥，并将其溶于10μl水中。
结果：60％回收率；70％转化率
5.10寡核苷酸与PEG-接头分子的轭合物
5.10.1与NH2-PEG-8反应并使用PTFE膜过滤
将NH2-PEG-8(0.4μl，438g/mol，20当量)和在EG(5μL)中的Cu/C加入寡核苷酸1(3.8μL，6807.5g/mol，5nmol/μl，1当量)中。将水(10μl)和DMSO/tBuOH(3∶1)(5μl)用作溶剂。将反应管在恒温混匀仪中以1000rpi在40℃振荡。
3小时后，将该溶液用200μl NaOAc(0.3M)稀释，并经由0.2μm PTFE膜(VWR)过滤，将所述膜预先用NaOAc(0.3M)洗涤(2x100μl)。将滤液先用100μl NaOAc(0.3M)洗涤两次、随后加入1ml冷的EtOH/Et2O(5％)以沉淀。将该溶液存储在-20℃过夜，以6000rpi离心20分钟。移去有机相，并加入1ml Et2O。以6000rpi离心20分钟后，移去Et2O，并将沉淀在37℃干燥，并将其溶于10μl水中。
结果：8.8％回收率；100％转化率
5.10.2与NH2-PEG-8反应并使用Nanosep旋转柱过滤
将NH2-PEG-8(0.4μl，438g/mol，20当量)和在EG(5μL)中的Cu/C加入寡核苷酸1(3.8μL，6807.5g/mol，5nmol/μl，1当量)中。将水(20μl)用作溶剂。将反应管在恒温混匀仪中以1000rpi在60℃振荡。
6小时后，将该溶液用100μl NaOAc(0.3M)稀释，并经由Nanosep旋转柱过滤，将所述旋转柱用100μl H2O和100μl DMSO/tBuOH(3∶1)预先洗涤。将过滤器先用100μl NaOAc(0.3M)洗涤、随后加入1ml冷的EtOH/Et2O(5％)以沉淀。将该溶液以6000rpi离心20分钟。移去有机相，并加入1ml Et2O。以6000rpi离心20分钟后，移去Et2O，并将沉淀在37℃干燥，并将其溶于10μl水中。
结果：20％回收率；100％转化率
5.10.3与PEG-24反应并使用PTFE膜过滤
将PEG-24(10μL，1114g/mol，20当量)和在EG(5μL)中的Cu/C加入寡核苷酸1(3.8μL，6807.5g/mol，5nmol/μl，1当量)中。将水(10μl)和5μl DMSO/tBuOH(3∶1)(5μl)用作溶剂。将反应管在恒温混匀仪中以1000rpi振荡。
3小时后将溶液用200μl NaOAc(0.3M)稀释，经由0,2μm PTFE膜(VWR)过滤，用NaOAc(0.3M)预先洗涤所述膜(2x100μl)。将滤液先用100μl NaOAc(0.3M)洗涤两次、随后加入1ml冷的EtOH/Et2O(5％)以沉淀。将该溶液存储在-20℃过夜，以6000rpi离心20分钟。移去有机相，并加入1ml Et2O。以6000rpi离心20分钟后，移去Et2O，并将沉淀在37℃干燥，并将其溶于10μl水中。
结果：16％回收率；80％转化率
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[15]对于描述了铜(II)盐在水中催化点击环加成的应用的最近的一篇文章参见：M.L.Kantam，K.Rajgopal，K.R.Reddy，Synlett 2006，957-959。
[16]Gramlich，P.M.A.；Wirges，C.T.；Manetto，A.；Carell，T.，Postsynthetic DNA Modification through the Copper-CatalyzedAzide-Alkyne Cycloaddition Reaction(通过铜-催化的叠氮化物-炔烃环加成反应的DNA后合成修饰).Angew.Chem.Int.Ed.，2008，47，8350-8358。
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[22]J.F.Lutz，Z.Zarafshani，Adv.Drug Deliv.Rev.2008，60，958-970。
[23]WO 2006/11761
[24]WO 2008/052775

Claims (25)

1.将第一个分子与第二个分子通过点击反应偶联的方法，其中第一个分子与第二个分子通过点击反应偶联，其中第一个分子包含第一个点击官能团，其为点击-反应性的不饱和基团，且第二个分子包含第二个互补的点击官能团，其为能与第一个点击官能团进行点击反应的点击-反应性的1,3-偶极基团，所述方法包括在非均相Cu-催化剂存在下将第一个和第二个分子在其中第一个和第二个分子之间发生点击反应的条件下接触，其中第一个分子和第二个分子之一固定于所述非均相Cu-催化剂，其中第一个和第二个分子之一是生物分子，其中提供了干燥的预浸透有第一个和第二个分子之一的所述非均相Cu-催化剂，将其与包含另一个分子的液体介质接触。
2.权利要求1的方法，其中第一个分子是选自以下的生物分子：核苷、核苷酸、核酸、氨基酸、肽、糖和脂质。
3.权利要求2的方法，其中第一个分子是选自核酸的生物分子。
4.权利要求1-3中任意一项的方法，其中第二个分子是
(i)报道分子,
(ii)亲和性分子,
(iii)固相,
(iv)生物分子,
(v)接头分子或间隔分子，其包含脂肪族或脂环族基团、芳族或杂芳族基团、烯基、炔基和/或聚合物基团,
(vi)药用的化合物或基团、光敏的基团，和/或氧化还原活性的基团，和/或识别部位。
5.权利要求4的方法，其中第二个分子是染料、蛋白质或脂质。
6.权利要求4的方法，其中第二个分子是接头分子或间隔分子，其包含聚乙二醇基团。
7.权利要求1-3中任意一项的方法，其中所述点击-官能不饱和基团是炔基，且其中点击-官能1,3-偶极基团是叠氮基。
8.权利要求1-3中任意一项的方法，其中所述非均相催化剂是Cu-C催化剂。
9.权利要求1-3中任意一项的方法，其中所述点击反应在增加点击反应速度的能与所述非均相Cu-催化剂相互作用的分子的存在下进行。
10.权利要求9的方法，其中所述点击反应在胺的存在下进行。
11.权利要求10的方法，其中胺的量高至10％v/v。
12.权利要求10的方法，其中胺的量高至1％v/v。
13.权利要求10的方法，其中胺的量高至0.1％v/v。
14.权利要求10的方法，其中所述的胺是伯胺、仲胺或叔胺，其具有芳族的、杂芳族的、脂肪族的、脂环族的、不饱和的或完全饱和的骨架。
15.权利要求10的方法，其中所述的胺为三乙胺。
16.权利要求1-3中任意一项的方法，其中(i)反应温度为4至80℃和/或(ii)反应时间为1分钟至8小时和/或其中反应体积为0.1μl至10ml。
17.权利要求16的方法，其中反应温度为10至40℃。
18.权利要求16的方法，其中反应时间为1分钟至10分钟。
19.权利要求16的方法，其中反应时间为2分钟至5分钟。
20.权利要求16的方法，其中反应时间为10分钟至8小时。
21.权利要求1-3中任意一项的方法，其中所述反应在移液器吸头、旋转柱或注射器中进行。
22.权利要求1-3中任意一项的方法，其进一步包括分离/纯化步骤。
23.用于点击反应的试剂盒，其包含具有至少一个反应室的装置和第一个和第二个分子，其中第一个分子包含第一个点击官能团，其为点击-反应性的不饱和基团，且第二个分子包含第二个互补的点击官能团，其为能与第一个点击官能团进行点击反应的点击-反应性的1,3-偶极基团，其中所述装置包含用于点击反应的非均相Cu-催化剂和被固定于所述非均相Cu-催化剂上的用于点击反应的配偶体之一，并且其中另一个反应配偶体包含在液体介质中。
24.用于检测样品中的被分析物的方法，其包括以下步骤：
(i)提供具有至少一个反应室的装置，
其中所述反应室包含用于进行点击反应的非均相Cu-催化剂并任选地包含另外的固体载体物质，其中点击反应的配偶体被固定于所述非均相Cu-催化剂和任选地被固定于所述另外的固体载体物质；
(ii)在所述反应室中、在非均相Cu-催化剂存在下，将作为第一个点击配偶体的第一个分子与作为第二个点击配偶体的第二个分子在其中第一个和第二个分子之间发生点击反应的条件下接触，
(iii)在一体化装置内将第一个分子和第二个分子的偶联产物与样品在允许检测被分析物的条件下接触，和
(iv)定性地和/或定量地检测被分析物；
其中第一个分子包含第一个点击官能团，其为点击-反应性的不饱和基团，且第二个分子包含第二个互补的点击官能团，其为能与第一个点击官能团进行点击反应的点击-反应性的1,3-偶极基团。
25.用于检测样品中的被分析物的方法，其包括以下步骤：
(i)提供具有至少一个反应室的装置，
其中所述反应室包含用于进行点击反应的非均相Cu-催化剂并任选地包含另外的固体载体物质，其中点击反应的配偶体被固定于所述非均相Cu-催化剂和任选地被固定于所述另外的固体载体物质；
(ii)在所述反应室中、在非均相Cu-催化剂存在下，将作为第一个点击配偶体的第一个分子与作为第二个点击配偶体的第二个分子在其中第一个和第二个分子之间发生点击反应的条件下接触，其中第二个分子包含报道基团或报道前体基团，
(iii)如需要，则将报道前体基团转化为报道基团，
(iv)在一体化装置内将第一个分子和第二个分子的偶联产物与样品在允许检测被分析物的条件下接触，和
(v)定性地和/或定量地检测被分析物，通过所述报道基团进行；
其中第一个分子包含第一个点击官能团，其为点击-反应性的不饱和基团，且第二个分子包含第二个互补的点击官能团，其为能与第一个点击官能团进行点击反应的点击-反应性的1,3-偶极基团。
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