CN101905034A - 生物多糖自组装修饰的壳聚糖抗菌生物材料的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种生物多糖自组装修饰的壳聚糖抗菌生物材料的制备方法。生物多糖自组装修饰的壳聚糖抗菌生物材料的制备方法，其特征在于它包括如下步骤：1)香菇多糖衍生物——香菇多糖硫酸酯的制备；2)壳聚糖膜基材的制备；3)香菇多糖硫酸酯溶液、壳聚糖溶液的制备；4)在基材表面进行香菇多糖硫酸酯和壳聚糖的层层自组装：将壳聚糖膜基材在壳聚糖溶液和香菇多糖硫酸酯溶液中分别交替自组装5次后，得到香菇多糖硫酸酯为最外层的含5个双分子层的表面层层自组装修饰的壳聚糖膜片，洗涤，干燥，得到生物多糖自组装修饰的壳聚糖抗菌生物材料。该方法制备的壳聚糖抗菌生物材料具有优异的抗菌活性，且该方法制备过程简单，易于控制，制备条件温和，成本低廉。
Description
技术领域
本发明属于生物材料、高分子化学和分子自组装技术领域，特别是涉及一种生物多糖自组装修饰的壳聚糖抗菌生物材料的制备方法。
背景技术
近年来，生物医用高分子材料在医疗领域的应用日益广泛，越来越多的高分子材料被用于人体器官和组织的替代材料。然而，当生物材料在植入人体内部后，往往容易引发一系列的机体防御反应如机体炎症、凝血等。此外，在植入过程中由于细菌等微生物的感染，也容易导致术后炎症等问题，这些都极大的影响了生物医用高分子材料在医疗领域的应用。因此，这就要求作为植入生物体内的生物医用高分子材料，既具有良好的生物相容性，又具有良好的抗菌活性、抗感染性能。
目前，对生物医用高分子材料进行表面修饰是科研工作者常用的改善材料生物性能的有效方法。层层自组装技术(LBL)是今年来发展起来的一种基于静电相互作用的材料表面修饰的重要方法，它具有工艺简单，厚度可控，条件温和，组装范围广泛等优点，不仅可以自组装合成聚电解质，也可以组装蛋白质、多糖、DNA等带电荷的生物大分子[高分子通报，2006，8：58-63]。
生物多糖类物质是来源于生物体的天然聚合物，具有良好的生物相容性和亲水性，因此利用多糖类生物大分子进行表面修饰是改善生物材料表面性能的有效途径之一。壳聚糖是甲壳素脱乙酰化后的一种天然碱性多糖，它具有安全无毒，良好的生物相容性和生物可降解性，以及广谱抗菌和抗感染作用，因此壳聚糖已经被广泛应用于人工透析膜、吸收缝合线、人造皮肤等生物材料领域。此外，也有研究者开展了利用壳聚糖进行生物材料表面修饰的研究工作，例如Li等人在聚对苯二甲酸乙二醇酯表面接枝固定壳聚糖，经修饰的表面对表皮葡萄球菌的粘附量显著降低[Key Engineering Materials，2005，288-289：331-334]。Fu等人采用甲壳素和肝素交替自组装于氨基化的聚对苯二甲酸乙二醇酯表面，制备出的复合膜不仅降低了大肠杆菌的粘附，同时对大肠杆菌具有抑制作用[Biomaterials，2005，26：6684-6692]。值得注意的是，在为数众多的生物多糖中，香菇多糖及其衍生物表现出显著的抗肿瘤、免疫调节、抗菌、抗病毒、抗凝血等多方面的生物活性。然而，目前利用香菇多糖及其衍生物进行生物材料表面修饰从而制备抗菌生物材料的研究几乎未见报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种生物多糖自组装修饰的壳聚糖抗菌生物材料的制备方法，该方法制备的壳聚糖抗菌生物材料具有优异的抑制大肠杆菌及绿脓杆菌的抗菌活性，且该方法制备过程简单，易于控制，制备条件温和。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：生物多糖自组装修饰的壳聚糖抗菌生物材料的制备方法，其特征在于它包括如下步骤：
1)香菇多糖衍生物——香菇多糖硫酸酯的制备：
按香菇多糖∶二甲基亚砜∶吡啶∶氯磺酸＝(0.6～1.2)g∶(50～100)mL∶(9～18)mL∶(3.7～7.4)mL，选取香菇多糖、二甲基亚砜、吡啶和氯磺酸，备用；
将香菇多糖加入装有二甲基亚砜的反应容器中，在20～30℃下搅拌12～18小时，再以2～4mL/分钟的速度缓慢逐滴滴加吡啶，继续搅拌30～40分钟，然后将反应容器置于冰浴中，搅拌下用恒压漏斗以0.5～1mL/分钟的速度逐滴缓慢滴加氯磺酸，滴加完毕后升温至80℃继续搅拌反应100～120分钟，反应停止后冷却至室温，用质量百分数为1～10wt％的NaOH溶液调节pH至7.0，得到反应液；再将所得反应液注入再生纤维素透析袋中，在pH为10的NaOH溶液中透析12～18小时，再用自来水流水透析4～6天，去离子水透析3～5天，然后将透析液旋转蒸发浓缩，最后经过冷冻干燥，得到白色粉末状的香菇多糖硫酸酯；
2)壳聚糖膜基材的制备：
按壳聚糖∶乙酸溶液＝(3.0～6.0)g∶(100～200)mL，其中，乙酸溶液的质量百分数为2wt％，将壳聚糖加入到乙酸溶液中，搅拌至壳聚糖充分溶解后，静置除去气泡后得到壳聚糖溶液；
按壳聚糖溶液∶戊二醛溶液＝(50～100)mL∶(2～4)mL，其中，戊二醛溶液的质量百分数为0.5wt％，将戊二醛加入到壳聚糖溶液中，搅拌至混合均匀后将溶液倒入平底成膜盘内，在38～45℃下干燥24～48小时，得到交联壳聚糖膜；
将上述交联壳聚糖膜切成直径为7.0mm、厚为0.5mm的圆形膜片，并用去离子水超声清洗4～6次，然后在室温下将膜片用浓度为0.012mol/L的HCl溶液浸泡15～30分钟，再用去离子水洗涤膜片4～6次，得到壳聚糖膜基材(C-CS)；
3)香菇多糖硫酸酯溶液、壳聚糖溶液的制备：
按香菇多糖硫酸酯∶壳聚糖＝(1.0～2.0)mg∶(1.5～3.0)mg，选取香菇多糖硫酸酯和壳聚糖；
将香菇多糖硫酸酯溶解于浓度为0.14mol/L的NaCl溶液中，得到香菇多糖硫酸酯溶液，其中香菇多糖硫酸酯的浓度为(1.0～2.0)mg/mL；
配制含乙酸的NaCl溶液：将乙酸溶入0.14mol/L的NaCl溶液中，得到含乙酸的NaCl溶液，其中，所述NaCl溶液中含乙酸的浓度为质量百分数为0.6wt％；
将壳聚糖溶解于含乙酸的NaCl溶液中，得到壳聚糖溶液，其中壳聚糖的浓度1.5～3.0mg/mL；
4)在基材表面进行香菇多糖硫酸酯和壳聚糖的层层自组装：
将上述步骤2)得到壳聚糖膜基材(C-CS)加入到香菇多糖硫酸酯溶液中浸泡15～20分钟，然后分离出膜片用0.14mol/L NaCl溶液洗涤4～6次，制备出表面具有香菇多糖硫酸酯的C-CS/LS膜片；再将C-CS/LS膜片加入到壳聚糖溶液中浸泡15～20分钟，分离出膜片用0.14mol/L NaCl溶液洗涤4～6次，然后再加入到香菇多糖硫酸酯溶液中浸泡15～20分钟，分离出膜片用0.14mol/L NaCl溶液洗涤4～6次，完成基材表面的第一个双分子层自组装；重复本步骤的上述过程，在壳聚糖溶液和香菇多糖硫酸酯溶液中分别交替自组装5次后，得到香菇多糖硫酸酯为最外层的含5个双分子层的表面层层自组装修饰的壳聚糖膜片，再用去离子水洗涤4～6次后，再将壳聚糖膜片在38～45℃的条件下真空干燥24～48小时，得到生物多糖自组装修饰的壳聚糖抗菌生物材料。
本发明制备得到的生物多糖自组装修饰的壳聚糖抗菌生物材料在作为植入人体的人造器官或器件等应用于生物医用材料方面(它应用于生物材料领域)，特别适用于制备具有复杂形状结构的人造器官和装置的抗菌生物材料。
本发明采用层层自组装技术进行壳聚糖的表面修饰，在壳聚糖基材表面交替层层自组装带负电荷的香菇多糖硫酸酯和带正电荷的壳聚糖，利用这两种具有生物活性的多糖类物质改善材料的表面生物性能，表面修饰后的壳聚糖材料具有优异的抑制大肠杆菌及绿脓杆菌的抗菌活性。
生物多糖自组装修饰的壳聚糖抗菌生物材料，它由基材和修饰层组成，基材由壳聚糖材料构成，修饰层是在该基材的表面利用层层自组装技术进行表面修饰而得到；其中，修饰层中含有在基材表面交替层层自组装的带负电荷的香菇多糖硫酸酯(LS)和带正电荷的壳聚糖(CS)。
本发明先通过化学改性方法制备一种香菇多糖衍生物——香菇多糖硫酸酯，然后以表面带正电荷的壳聚糖膜片作为基材，通过层层自组装技术在基材表面交替吸附带负电荷的香菇多糖硫酸酯和带正电荷的壳聚糖，从而构成修饰层；基材采用壳聚糖材料，其和修饰层构成所述的生物多糖自组装修饰的壳聚糖抗菌生物材料。
本发明利用的壳聚糖是一种天然高分子聚电解质，它具有良好的生物相容性、生物可降解性，以及广谱抗菌和抗感染作用。采用壳聚糖作为基材，以及作为表面修饰层中的一种修饰材料，有利于制备具有良好生物相容性的抗菌生物材料。表面修饰层中的另一种多糖物质——香菇多糖硫酸酯具有良好的抗肿瘤、抗菌、抗病毒、免疫调节等多方面的生物活性。通过层层自组装的方法将两种生物多糖类物质固定于壳聚糖基材的表面，该方法制备工艺简单，制备条件温和，易于控制，有利于保持生物大分子的活性和天然构象。
本发明的有益效果是：该方法制备的生物多糖自组装修饰的壳聚糖抗菌生物材料具有优异的抑制大肠杆菌及绿脓杆菌的抗菌活性，抑菌率达到了100％。首先，壳聚糖是一种带有氨基的生物多糖，它具有无毒性、广谱抗菌性能和抗感染作用等优点；另外值得注意的是，香菇多糖及其衍生物表现出十分显著的抗肿瘤、抗菌、抗病毒、抗凝血、免疫调节等多方面的生物活性，采用壳聚糖和香菇多糖硫酸酯作为修饰层有利于进一步提高生物材料的抗菌活性。其次，本发明所采用的层层自组装表面修饰技术与其它生物材料表面修饰技术相比，具有一系列优点，例如制备条件温和，工艺简单(过程简单)，易于控制，可实现多种生物分子的表面固定并有利于生物分子维持活性和天然构象，可适用的基材种类多，并可在具有复杂形状结构的装置和材料上实现等。最后，该方法制备的生物多糖自组装修饰的壳聚糖抗菌生物材料，其基材以及用于表面修饰的物质都是来源于生物体的生物多糖类物质，它们本身就具有良好的生物相容性，而且这些生物多糖的主链具有高亲水性、柔顺性等特点，有利于改善生物医用高分子材料作为植入材料时的生物相容性。
本发明制备得到的生物多糖自组装修饰的壳聚糖抗菌生物材料能够在生物材料领域，特别是制备具有良好生物相容性及复杂形状结构的抗菌生物材料方面，具有广泛的用途。
附图说明
图1是表面层层自组装修饰前后壳聚糖材料对大肠杆菌的抑制效果。
其中control代表未加膜片的空白对照组，C-CS代表壳聚糖膜片，C-CS/(CS-LS)5代表自组装第五个双分子层香菇多糖硫酸酯LS在最外层的膜片。
图2是表面层层自组装修饰前后壳聚糖材料对绿脓杆菌的抑制效果。
其中control代表未加膜片的空白对照组，C-CS代表壳聚糖膜片，C-CS/(CS-LS)5代表自组装第五个双分子层香菇多糖硫酸酯LS在最外层的膜片。
具体实施方式
为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。
实施例1：
生物多糖自组装修饰的壳聚糖抗菌生物材料的制备方法，它包括如下步骤：
1)真菌多糖衍生物——香菇多糖硫酸酯的制备：将0.6g香菇多糖加入装有50mL二甲基亚砜的反应瓶中，在20℃下搅拌12小时，再以2mL/分钟的速度缓慢逐滴滴加9mL吡啶，继续搅拌30分钟，然后将反应瓶置于冰浴中，搅拌下用恒压漏斗以0.5mL/分钟的速度缓慢逐滴滴加3.7mL氯磺酸(其中氯磺酸与吡啶的摩尔比为1∶2)，然后升温至80℃继续搅拌反应100分钟，反应停止后冷却至室温，用浓度为5wt％的NaOH(浓度为5wt％表示100gNaOH溶液中含NaOH 5g)溶液调节pH至7.0，得到反应液；再将所得反应液注入再生纤维素透析袋(36mm，Mw：8000-14000)中，在pH为10的NaOH溶液中透析12小时，再用自来水流水透析4天，去离子水透析3天，然后将透析液旋转蒸发浓缩，最后经冷冻干燥，得到白色粉末状的香菇多糖硫酸酯(LS)；
2)壳聚糖膜基材的制备：将3g壳聚糖溶于100mL、2wt％的乙酸溶液中，搅拌至壳聚糖充分溶解后，静置除去气泡后得到壳聚糖溶液；再取50mL壳聚糖溶液并向其中加入2mL、0.5wt％的戊二醛溶液，搅拌至混合均匀后将溶液倒入直径为12cm的平底成膜盘内，38℃下干燥24小时，得到交联壳聚糖膜；将交联壳聚糖膜切成直径为7.0mm、厚为0.5mm的圆形膜片并用去离子水超声清洗4次，然后在室温下将膜片用浓度为0.012mol/L的HCl溶液浸泡15分钟，再用蒸馏水洗涤膜片4次，得到壳聚糖膜基材(C-CS)；
3)香菇多糖硫酸酯溶液、壳聚糖溶液的制备：将香菇多糖硫酸酯溶解于200mL的0.14mol/L NaCl溶液中，得到香菇多糖硫酸酯溶液(即溶有香菇多糖硫酸酯的NaCl溶液)，其中香菇多糖硫酸酯的浓度为1.0mg/mL(表示每mL香菇多糖硫酸酯溶液中含香菇多糖硫酸酯1.0mg)；
配制含乙酸的NaCl溶液：将乙酸溶入0.14mol/L的NaCl溶液中，得到含乙酸的NaCl溶液，其中，该NaCl溶液中含乙酸的浓度为0.6wt％(表示100g含乙酸的NaCl溶液中含乙酸0.6g)；
将壳聚糖溶解于200mL含乙酸的NaCl溶液中，得到壳聚糖溶液(即溶有壳聚糖的含乙酸的NaCl溶液)，其中壳聚糖的浓度1.5mg/mL(表示每mL壳聚糖溶液中含壳聚糖1.5mg)；
4)在基材表面进行香菇多糖硫酸酯和壳聚糖的层层自组装：将上述步骤2)得到的壳聚糖膜基材(C-CS)加入到香菇多糖硫酸酯溶液中浸泡15分钟，然后分离出膜片用0.14mol/LNaCl溶液洗涤4次，制备出表面具有香菇多糖硫酸酯的C-CS/LS膜片；再将C-CS/LS膜片加入到壳聚糖溶液中浸泡15分钟，分离出膜片用0.14mol/L NaCl溶液洗涤4次，然后再加入到香菇多糖硫酸酯溶液中浸泡15分钟，分离出膜片用0.14mol/L NaCl溶液洗涤4次，完成基材表面的第一个双分子层自组装；重复本步骤的上述过程，在壳聚糖溶液和香菇多糖硫酸酯溶液中分别交替自组装5次后，得到香菇多糖硫酸酯为最外层的含5个双分子层的表面层层自组装修饰的壳聚糖膜片，用去离子水洗涤4次，然后将壳聚糖膜片在38℃的条件下真空干燥24小时，得到生物多糖自组装修饰的壳聚糖抗菌生物材料。
实施例2：
生物多糖自组装修饰的壳聚糖抗菌生物材料的制备方法，它包括如下步骤：
1)真菌多糖衍生物——香菇多糖硫酸酯的制备：将1.2g香菇多糖加入装有100mL二甲基亚砜的反应瓶中，在30℃下搅拌18小时，再以4mL/分钟的速度缓慢逐滴滴加18mL吡啶，继续搅拌40分钟，然后将反应瓶置于冰浴中，搅拌下用恒压漏斗以1mL/分钟的速度缓慢逐滴滴加7.4mL氯磺酸(其中氯磺酸与吡啶的摩尔比为1∶2)，然后升温至80℃继续搅拌反应120分钟，反应停止后冷却至室温，用浓度为5wt％的NaOH调节pH至7.0，得到反应液；再将所得反应液注入再生纤维素透析袋(36mm，Mw：8000-14000)中，在pH为10的NaOH溶液中透析18小时，再用自来水流水透析6天，去离子水透析5天，然后将透析液旋转蒸发浓缩，最后经冷冻干燥，得到白色粉末状的香菇多糖硫酸酯(LS)；
2)壳聚糖膜基材的制备：将6g壳聚糖溶于200mL、2wt％的乙酸溶液中，搅拌至壳聚糖充分溶解后，静置除去气泡后得到壳聚糖溶液；再取100mL壳聚糖溶液并向其中加入4mL、0.5wt％的戊二醛溶液，搅拌至混合均匀后将溶液倒入直径为12cm的平底成膜盘内，45℃下干燥24小时，得到交联壳聚糖膜；将所得交联壳聚糖膜切成直径为7.0mm、厚为0.5mm的圆形膜片并用去离子水超声清洗6次，然后在室温下将膜片用浓度为0.012mol/L的HCl溶液浸泡30分钟，再用蒸馏水洗涤膜片6次，得到壳聚糖膜基材(C-CS)；
3)香菇多糖硫酸酯溶液、壳聚糖溶液的制备：将香菇多糖硫酸酯溶解于200mL的0.14mol/L NaCl溶液中，得到香菇多糖硫酸酯溶液(即溶有香菇多糖硫酸酯的NaCl溶液)，其中香菇多糖硫酸酯的浓度为1.0mg/mL(表示每mL香菇多糖硫酸酯溶液中含香菇多糖硫酸酯1.0mg)；
配制含乙酸的NaCl溶液：将乙酸溶入0.14mol/L的NaCl溶液中，得到含乙酸的NaCl溶液，其中，该NaCl溶液中含乙酸的浓度为0.6wt％(表示100g含乙酸的NaCl溶液中含乙酸0.6g)；
将壳聚糖溶解于200mL含乙酸的NaCl溶液中，得到壳聚糖溶液(即溶有壳聚糖的含乙酸的NaCl溶液)，其中壳聚糖的浓度1.5mg/mL(表示每mL壳聚糖溶液中含壳聚糖1.5mg)；
4)在基材表面进行香菇多糖硫酸酯和壳聚糖的层层自组装：将上述步骤2)得到的壳聚糖膜基材(C-CS)加入到香菇多糖硫酸酯溶液中浸泡20分钟，然后分离出膜片用0.14mol/LNaCl溶液洗涤4次，制备出表面具有香菇多糖硫酸酯的C-CS/LS膜片；再将C-CS/LS膜片加入到壳聚糖溶液中浸泡20分钟，分离出膜片用0.14mol/L NaCl溶液洗涤6次，然后再加入到香菇多糖硫酸酯溶液中浸泡20分钟，分离出膜片用0.14mol/L NaCl溶液洗涤6次，完成基材表面的第一个双分子层自组装；重复本步骤的上述过程，在壳聚糖溶液和香菇多糖硫酸酯溶液中分别交替自组装5次后，得到香菇多糖硫酸酯为最外层的含5个双分子层的表面层层自组装修饰的壳聚糖膜片，用去离子水洗涤6次，然后将壳聚糖膜片在45℃的条件下真空干燥24小时，得到生物多糖自组装修饰的壳聚糖抗菌生物材料。
实施例3：
生物多糖自组装修饰的壳聚糖抗菌生物材料的制备方法，它包括如下步骤：
1)真菌多糖衍生物——香菇多糖硫酸酯的制备：将0.6g香菇多糖加入装有50mL二甲基亚砜的反应瓶中，在25℃下搅拌16小时，再以3mL/分钟的速度缓慢逐滴滴加18mL吡啶，继续搅拌35分钟，然后将反应瓶置于冰浴中，搅拌下用恒压漏斗以1mL/分钟的速度缓慢逐滴滴加3.7mL氯磺酸(其中氯磺酸与吡啶的摩尔比为1∶2)，然后升温至80℃继续搅拌反应120分钟，反应停止后冷却至室温，用浓度为5wt％的NaOH调节pH至7.0，得到反应液；再将所得反应液注入再生纤维素透析袋(36mm，Mw：8000-14000)中，在pH为10的NaOH溶液中透析16小时，再用自来水流水透析5天，去离子水透析4天，然后将透析液旋转蒸发浓缩，最后经冷冻干燥，得到白色粉末状的香菇多糖硫酸酯(LS)；
2)壳聚糖膜基材的制备：将3g壳聚糖溶于100mL、2wt％的乙酸溶液中，搅拌至壳聚糖充分溶解后，静置除去气泡后得到壳聚糖溶液；再取50mL壳聚糖溶液并向其中加入2mL、0.5wt％的戊二醛溶液，搅拌至混合均匀后将溶液倒入直径为12cm平底成膜盘内，45℃下干燥48小时，得到交联壳聚糖膜；将所得交联壳聚糖膜切成直径为7.0mm、厚为0.5mm的圆形膜片并用去离子水超声清洗6次，然后在室温下将膜片用浓度为0.012mol/L的HCl溶液浸泡30分钟，再用蒸馏水洗涤膜片6次，得到壳聚糖膜基材(C-CS)；
3)香菇多糖硫酸酯溶液、壳聚糖溶液的制备：将香菇多糖硫酸酯溶解于200mL的0.14mol/L NaCl溶液中，得到香菇多糖硫酸酯溶液(即溶有香菇多糖硫酸酯的NaCl溶液)，其中香菇多糖硫酸酯的浓度为2.0mg/mL(表示每mL香菇多糖硫酸酯溶液中含香菇多糖硫酸酯2.0mg)；
配制含乙酸的NaCl溶液：将乙酸溶入0.14mol/L的NaCl溶液中，得到含乙酸的NaCl溶液，其中，该NaCl溶液中含乙酸的浓度为0.6wt％(表示100g含乙酸的NaCl溶液中含乙酸0.6g)；
将壳聚糖溶解于200mL含乙酸的NaCl溶液中，得到壳聚糖溶液(即溶有壳聚糖的含乙酸的NaCl溶液)，其中壳聚糖的浓度3.0mg/mL(表示每mL壳聚糖溶液中含壳聚糖3.0mg)；
4)在基材表面进行香菇多糖硫酸酯和壳聚糖的层层自组装：将上述步骤2)得到的壳聚糖膜基材(C-CS)加入到香菇多糖硫酸酯溶液中浸泡20分钟，然后分离出膜片用0.14mol/LNaCl溶液洗涤4次，制备出表面具有香菇多糖硫酸酯的C-CS/LS膜片；再将C-CS/LS膜片加入到壳聚糖溶液中浸泡20分钟，分离出膜片用0.14mol/L NaCl溶液洗涤4次，然后再加入到香菇多糖硫酸酯溶液中浸泡20分钟，分离出膜片用0.14mol/L NaCl溶液洗涤4次，完成基材表面的第一个双分子层自组装；重复本步骤的上述过程，在壳聚糖溶液和香菇多糖硫酸酯溶液中分别交替自组装5次后，得到香菇多糖硫酸酯为最外层的含5个双分子层的表面层层自组装修饰的壳聚糖膜片，用去离子水洗涤4次，然后将壳聚糖膜片在45℃的条件下真空干燥48小时，得到生物多糖自组装修饰的壳聚糖抗菌生物材料。
图1是表面层层自组装修饰前后壳聚糖材料对大肠杆菌的抑制效果。测试过程为(按照中华人民共和国轻工行业标准：抗菌塑料-抗菌性能测试方法和抗菌效果)：选择菌液浓度为5.0×105CFU/ml的大肠杆菌稀释液作为试验用菌液，在培养管中加入2mL菌液，分别加入修饰前后的壳聚糖膜片5片(修饰后的壳聚糖基材为实施例1中所得到的生物多糖自组装修饰的壳聚糖抗菌生物材料)，而不加入膜片的作为control空白对照组，在37℃恒温振荡培养24小时后，用平板计数法计算出活大肠杆菌的数目，每组数据做两次平行实验，每个样品做三个平行抗菌测试。从图1中可以看出，control空白对照组样品中的大肠杆菌浓度为6.87×108CFU/ml，未经表面修饰的壳聚糖材料(C-CS)中的大肠杆菌浓度为4.88×108CFU/ml，而经过表面层层自组装修饰的C-CS/(CS-LS)5中的大肠杆菌浓度为0，其抑制大肠杆菌率达到了100％。以上结果表明，本发明生物多糖自组装修饰的壳聚糖抗菌生物材料其表面具有优异的抑制大肠杆菌的抗菌活性。
图2是表面层层自组装修饰前后壳聚糖材料对绿脓杆菌的抑制效果。测试过程为(按照中华人民共和国轻工行业标准：抗菌塑料-抗菌性能测试方法和抗菌效果)：选择菌液浓度为5.0×105CFU/ml的绿脓杆菌稀释液作为试验用菌液，在培养管中加入2mL菌液，分别加入修饰前后的壳聚糖膜片5片(修饰后的壳聚糖膜片为实施例1中所得到的生物活性多糖自组装修饰的壳聚糖材料)，而不加入膜片的作为control空白对照组，在37℃恒温振荡培养24小时后，用平板计数法计算出活绿脓杆菌的数目，每组数据做两次平行实验，每个样品做三个平行抗菌测试。从图2中可以看出，control空白对照组样品中的绿脓杆菌浓度为9.63×108CFU/ml，未经表面修饰的壳聚糖材料(C-CS)中的绿脓杆菌浓度为4.94×108CFU/ml，而经过表面层层自组装修饰的C-CS/(CS-LS)5中的绿脓杆菌浓度为0，其抑制绿脓杆菌率达到了100％。以上结果表明，本发明生物多糖自组装修饰的壳聚糖抗菌生物材料其表面具有优异的抑制绿脓杆菌的抗菌活性。
本发明各原料的上下限、区间取值，以及工艺参数(如温度、时间等)的上下限、区间取值都能实现本发明，在此不一一列举实施例。
Claims (2)
1.生物多糖自组装修饰的壳聚糖抗菌生物材料的制备方法，其特征在于它包括如下步骤：
1)香菇多糖衍生物——香菇多糖硫酸酯的制备：
按香菇多糖∶二甲基亚砜∶吡啶∶氯磺酸＝(0.6～1.2)g∶(50～100)mL∶(9～18)mL∶(3.7～7.4)mL，选取香菇多糖、二甲基亚砜、吡啶和氯磺酸，备用；
将香菇多糖加入装有二甲基亚砜的反应容器中，在20～30℃下搅拌12～18小时，再以2～4mL/分钟的速度缓慢逐滴滴加吡啶，继续搅拌30～40分钟，然后将反应容器置于冰浴中，搅拌下用恒压漏斗以0.5～1mL/分钟的速度逐滴缓慢滴加氯磺酸，滴加完毕后升温至80℃继续搅拌反应100～120分钟，反应停止后冷却至室温，用质量百分数为1～10wt％的NaOH溶液调节pH至7.0，得到反应液；再将所得反应液注入再生纤维素透析袋中，在pH为10的NaOH溶液中透析12～18小时，再用自来水流水透析4～6天，去离子水透析3～5天，然后将透析液旋转蒸发浓缩，最后经过冷冻干燥，得到香菇多糖硫酸酯；
2)壳聚糖膜基材的制备：
按壳聚糖∶乙酸溶液＝(3.0～6.0)g∶(100～200)mL，其中，乙酸溶液的质量百分数为2wt％，将壳聚糖加入到乙酸溶液中，搅拌至壳聚糖充分溶解后，静置除去气泡后得到壳聚糖溶液；
按壳聚糖溶液∶戊二醛溶液＝(50～100)mL∶(2～4)mL，其中，戊二醛溶液的质量百分数为0.5wt％，将戊二醛加入到壳聚糖溶液中，搅拌至混合均匀后将溶液倒入平底成膜盘内，在38～45℃下干燥24～48小时，得到交联壳聚糖膜；
将上述交联壳聚糖膜切成直径为7.0mm、厚为0.5mm的圆形膜片，并用去离子水超声清洗4～6次，然后在室温下将膜片用浓度为0.012mol/L的HCl溶液浸泡15～30分钟，再用去离子水洗涤膜片4～6次，得到壳聚糖膜基材；
3)香菇多糖硫酸酯溶液、壳聚糖溶液的制备：
按香菇多糖硫酸酯∶壳聚糖＝(1.0～2.0)mg∶(1.5～3.0)mg，选取香菇多糖硫酸酯和壳聚糖；
将香菇多糖硫酸酯溶解于浓度为0.14mol/L的NaCl溶液中，得到香菇多糖硫酸酯溶液，其中香菇多糖硫酸酯的浓度为(1.0～2.0)mg/mL；
配制含乙酸的NaCl溶液：将乙酸溶入0.14mol/L的NaCl溶液中，得到含乙酸的NaCl溶液，其中，所述NaCl溶液中含乙酸的浓度为质量百分数为0.6wt％；
将壳聚糖溶解于含乙酸的NaCl溶液中，得到壳聚糖溶液，其中壳聚糖的浓度1.5～3.0mg/mL；
4)在基材表面进行香菇多糖硫酸酯和壳聚糖的层层自组装：
将上述步骤2)得到壳聚糖膜基材加入到香菇多糖硫酸酯溶液中浸泡15～20分钟，然后分离出膜片用0.14mol/L NaCl溶液洗涤4～6次，制备出表面具有香菇多糖硫酸酯的C-CS/LS膜片；再将C-CS/LS膜片加入到壳聚糖溶液中浸泡15～20分钟，分离出膜片用0.14mol/L NaCl溶液洗涤4～6次，然后再加入到香菇多糖硫酸酯溶液中浸泡15～20分钟，分离出膜片用0.14mol/L NaCl溶液洗涤4～6次，完成基材表面的第一个双分子层自组装；重复上述过程，在壳聚糖溶液和香菇多糖硫酸酯溶液中分别交替自组装5次后，得到香菇多糖硫酸酯为最外层的含5个双分子层的表面层层自组装修饰的壳聚糖膜片，再用去离子水洗涤4～6次后，再将壳聚糖膜片在38～45℃的条件下真空干燥24～48小时，得到生物多糖自组装修饰的壳聚糖抗菌生物材料。
2.根据权利要求1所得到的生物多糖自组装修饰的壳聚糖抗菌生物材料的应用，其特征在于：它应用于生物材料领域。
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