CN101732256A - 一种香菇多糖壳聚糖纳米粒及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种香菇多糖壳聚糖纳米粒及其制备方法，该香菇多糖壳聚糖纳米粒由如下重量份的原料药和载体材料制成：壳聚糖150份～250份、三聚磷酸钠30份～70份和香菇多糖0.6份～1.5份。采用壳聚糖为载体，通过壳聚糖与三聚磷酸钠的阴阳离子静电作用自发形成载药纳米粒，结合离子凝胶化法和复乳溶剂挥发法携载水溶性、大分子的香菇多糖成功制备获得稳定性高、包封率好和载药量高的香菇多糖壳聚糖纳米粒，且具有良好的抗肿瘤作用和免疫增强作用，较香菇多糖溶液的抗肿瘤效果更强，稳定性更高。其制备方法操作简单、安全、有效，符合环保要求，适于工业化生产。
Description
技术领域
本发明涉及药物纳米制剂领域，具体涉及一种香菇多糖壳聚糖纳米粒及其制备方法。
背景技术
多糖是由多个单糖分子缩合、失水而成，其种类繁多，结构复杂，广泛分布于动植物中。目前对多糖的理化性质以及生物学功能的研究较多，近年来亦有研究人员对不同来源多糖的潜在功能进行了进一步研究与开发，使得多糖在医药领域的应用广受关注。
目前多糖的一个重要的应用领域在于抗肿瘤，通过研究发现多糖抗肿瘤多表现为：一方面，通过调节免疫系统发挥抗肿瘤作用，如调节免疫器官，影响巨噬细胞，T淋巴细胞(Thymus dependent lymphocyte，胸腺依赖性淋巴细胞)、B淋巴细胞(Bone marrow dependent lymphocyte，骨髓依赖性淋巴细胞)及NK细胞(natural killer cell，自然杀伤细胞)，激活补体系统等；另一方面集中在通过直接作用抑制肿瘤细胞，其机制为引起细胞凋亡，抑制致肿瘤物激活酶，激活解毒酶，影响膜蛋白及肿瘤细胞附着，影响信号转导等方面。
香菇多糖作为一种免疫增强剂具有免疫调节作用，能增强NK细胞、T细胞功能，以及诱导干扰素血中浓度增高，具有抗肿瘤、抗病毒等作用。用于治疗恶性肿瘤和慢性乙肝等病毒性疾病，在与手术、放疗、化疗等相结合的辅助治疗中，已经取得很好的疗效。但现有的多糖药物制剂往往存在诸如稳定性差、生物利用度不高以及对某些细胞穿透能力不强等缺点，近年来研究人员开始将微粒制剂应用于多糖类药物制剂的研究与开发，以克服多糖普通制剂的缺点。目前，关于携载多糖的微粒制剂如脂质体、微囊、微球等制备方法和质量评价的研究，已成为多糖新型给药系统研究的一个重要方向，但尚未有关于香菇多糖纳米粒的报道。
作为药物传递与控释的载体，纳米粒具有缓释性、靶向性、稳定性等优点，而且可减少药物使用剂量，减轻或避免其不良反应。同样针对某些多糖类药物普通制剂的靶向性、缓释性等的缺陷，对多糖药物纳米制剂进行研究与开发意义重大。尽管纳米粒在许多化学药物中得到了应用，但由于香菇多糖的水溶性、大分子等一些自身的不利于包封的性质，目前尚无有关包载香菇多糖作为抗肿瘤治疗药物的纳米粒的研究报道。
申请号为200510018524.4的中国专利中公开了一种用作药物载体的壳聚糖季铵盐纳米粒子及其制备方法和用途。壳聚糖季铵盐纳米粒子由壳聚糖季铵盐和三聚磷酸钠交联生成，粒径为100nm～500nm。其制备方法是将壳聚糖季铵盐溶解于蒸馏水中，在室温搅拌条件下加入三聚磷酸钠溶液，交联成纳米粒子，高速离心分离，冷冻干燥，获得壳聚糖季铵盐纳米粒子。这种在中性条件下制备的新型纳米粒子，可避免有机溶剂的副作用，所需能量要比溶剂蒸发等普通制备方法大为降低，尤其适合用于包封敏感大分子如蛋白质类药物。以牛血清蛋白为模型药，BSA的包封率可达90％，缓释达六天以上。但该种纳米粒子不适用于携载香菇多糖。
发明内容
本发明提供了一种香菇多糖壳聚糖纳米粒，用于弥补现有香菇多糖纳米制剂的空白，其采用壳聚糖和三聚磷酸钠为载体材料，通过离子凝胶化法携载香菇多糖成功制备获得稳定性高、包封率好的纳米粒，克服了目前香菇多糖由于其具有水溶性、大分子等一些自身的不利于包封的性质而难于制备纳米制剂的难题。
本发明还提供了一种香菇多糖壳聚糖纳米粒的制备方法，操作简单、安全、有效，符合环保要求。
一种香菇多糖壳聚糖纳米粒，由如下重量份的原料药和载体材料制成：壳聚糖150份～250份、三聚磷酸钠(简称STPP)30份～70份和香菇多糖0.6份～1.5份。
进一步优选由如下重量份的原料药和载体材料制成：壳聚糖200份～250份、三聚磷酸钠30份～45份和香菇多糖0.6份～1.5份。
所述的壳聚糖(简称CS)是自然界中广泛存在的阳离子聚合物，具有较好的生物相容性和生物降解性，来源广泛，通过不同合成方法可以得到不同分子量和脱乙酰度的壳聚糖，可用于制备不同粒径和不同香菇多糖浓度的纳米粒。本发明优选使用较为普遍的分子量为10kDa～100kDa的壳聚糖。
壳聚糖的分子量过大会造成壳聚糖和香菇多糖分子量接近，会影响后续检测时用离子交换法测定香菇多糖的含量，为香菇多糖壳聚糖纳米粒的质量监控带来一定难度。
所述的壳聚糖的脱乙酰度优选为90％～95％，因为壳聚糖的脱乙酰度过低会影响壳聚糖质子化氨基离子的量，进而对纳米粒的形成有一定影响，使形成的纳米粒量过少。
所述的脱乙酰度通常用碱量法来测定，其原理是用过量的稀酸与一定量的待测壳聚糖反应，然后用标准NaOH溶液滴定过量的酸来测量壳聚糖中自由氨基的质量百分含量(a)，从而计算壳聚糖的脱乙酰度(即DD值)，其计算公式为：DD＝(a÷0.0994)×100％。
经检测，所述的香菇多糖壳聚糖纳米粒的粒径为100nm～500nm。
所述的香菇多糖壳聚糖纳米粒的zeta电位为0～20mv。
所述的香菇多糖壳聚糖纳米粒的制备方法，包括步骤：
(1)将壳聚糖在醋酸或醋酸水溶液中溶胀配制成壳聚糖溶液；
(2)将香菇多糖热溶于水中配制成香菇多糖溶液；
(3)先将香菇多糖溶液加入壳聚糖溶液中，调节壳聚糖溶液的pH值为4～6，再缓慢滴加三聚磷酸钠水溶液，搅拌均匀后离心，收集沉淀，把沉淀复溶、过滤，滤液冷冻干燥，即制得香菇多糖壳聚糖纳米粒。
适当地调整壳聚糖溶液浓度或三聚磷酸钠水溶液浓度对纳米粒的制备影响不大，但是若壳聚糖浓度过高，或三聚磷酸钠浓度过高则会使带负电荷的磷酸根离子与壳聚糖上带正电荷的质子化氨基发生分子间和分子内交联时由于离子局部浓度过高，导致所制备的纳米粒粒径过大，并且也可能造成所制备的纳米粒浓度过高，纳米粒子之间容易聚集，影响纳米粒的稳定性。因此需要控制壳聚糖阳离子和磷酸根离子的用量。
为了得到粒径合适，稳定性更好的香菇多糖壳聚糖纳米粒，优选：
步骤(1)中，壳聚糖溶液中壳聚糖的浓度为1.5g/L～2.5g/L。
为了便于步骤(3)中进行pH的调节，节约试剂，优选质量百分浓度为0.5％～2.5％的醋酸水溶液。
步骤(2)中，香菇多糖溶液的浓度为60μg/ml～150μg/ml。
步骤(3)中，三聚磷酸钠水溶液的质量百分浓度为0.1％～1％。
沉淀复溶所用的溶剂采用常用的实验用水(如双蒸水)即可。
pH调节选用本领域常用的碱性试剂即可，如氢氧化钠、氢氧化钾等，使壳聚糖溶液的pH值为4～6，在该pH范围内，壳聚糖的氨基质子化程度较高，利于壳聚糖和三聚磷酸钠通过阴阳离子静电作用自发形成载药纳米粒。壳聚糖纳米粒作为一种纳米水凝胶体系，具有一定的溶胀度，而pH的变化可促进或抑制氨基解离而改变凝胶体系的电性和溶胀行为。而随着溶液pH升高，氨基离解程度降低，zeta电位降低使纳米粒子稳定性变差。
本发明先将香菇多糖加入到壳聚糖溶液中再制备成纳米粒，可以形成较稳定的纳米粒。
一、香菇多糖壳聚糖纳米粒的形态观察：
取适量香菇多糖纳米粒加适量的双蒸水稀释后，加至专用铜网上，用质量百分浓度为0.2％的磷钨酸水溶液染色，在透射电子显微镜下观察粒子的大小和形态，见图1。
从图1可看出，本发明香菇多糖纳米粒粒子的大小均匀，形态相似，分布均匀。
二、香菇多糖壳聚糖纳米粒的粒径和电位测定：
一定量香菇多糖纳米粒，用PBS缓冲液(即吐温-20的质量百分浓度为0.05％、pH7.4的磷酸盐缓冲液)稀释至香菇多糖纳米粒的质量百分浓度为0.01％～0.1％，利用激光粒度测定仪和电位测定仪分别测定纳米粒的粒径和电位，观察纳米粒的粒径分布和电位，见表1和图2。
从表1和图2可看出，本发明香菇多糖壳聚糖纳米粒的粒径随壳聚糖与三聚磷酸钠质量比的增加而逐渐减小，当壳聚糖与三聚磷酸钠质量比约为5.5时，纳米粒的粒径小于220nm，纳米粒的电位随壳聚糖与三聚磷酸钠质量比的增加而逐渐增大，一般小于22mv。
三、香菇多糖壳聚糖纳米粒稳定性考察：
取适量香菇多糖壳聚糖纳米粒用激光粒径测定仪测定纳米粒的粒径，两周后取同一批香菇多糖壳聚糖纳米粒，用同样方法测定粒径，发现粒径大小接近，几乎无差异，表明本发明的香菇多糖壳聚糖纳米粒稳定性良好。
四、香菇多糖壳聚糖纳米粒包封率和载药量测定：
由于香菇多糖和纳米粒材料壳聚糖难于分离，且材料对香菇多糖吸光度的测量值影响很大，因此用普通紫外分光光度法难以测定。通过文献查阅(Bao XF等人，Structural features of immunologically active polysaccharides from Ganoderma lucidum.Phytochemistry 2002；59(2)：175-181；Ch-eong J等人，Characterization of an alkali-extracted peptidoglycan from Korean Ganoderma lucidum，Arch Pharm Res 1999，22(5)：515-519；He Y等人，Chemical studies on immunologically active polysaccharides of Ganoder-ma lucidum(Leyss.ex Fr.)Karst，中国中药杂志1992，17(4)：226-228.)香菇多糖可以用二乙胺基乙基纤维素(DEAE-纤维素)阴离子交换层析法测定其含量，只要调整Tris-NaCl缓冲液的浓度，可以使香菇多糖与纳米粒载体材料壳聚糖、三聚磷酸钠在不同缓冲液浓度下出峰，达到分离检测药物与材料的目的。
离子交换层析由离子交换柱、恒流泵、核酸蛋白监测仪、绘图仪组成。实验发现香菇多糖可以在缓冲液浓度为1mol/L时出峰，而纳米粒材料CS和STPP分别在缓冲液浓度为0.2mol/L、0.4mol/L时就被洗脱。一般情况下，DEAE-纤维素用于分离酸性蛋白，而羟甲基纤维素(CM纤维素)用于分离碱性蛋白质。考虑到香菇多糖壳聚糖纳米粒制备过程中的pH为5左右，因此本实验采用DEAE-纤维素交换剂，采用连续洗脱法洗脱要层析的样品，从而达到分离的效果。
1、标准曲线制备
用0.2mol/L的Tris-NaCl缓冲液(市售产品)配制香菇多糖浓度为6mg/100mL、8mg/100mL、10mg/100mL、12mg/100mL，15mg/100mL的香菇多糖溶液，Tris-NaCl缓冲液浓度配制三组：0.2mol/L、0.4mol/L、1.0mol/L。待离子交换柱平衡后，取10ml待测液上样测量，横流泵流速控制在5mL/min，分别用上述三种浓度的Tris-NaCl缓冲液洗脱柱体。
数据处理：由于测绘仪出峰非常小，如果直接测量其峰面积，那会导致实验误差相当大。但是峰面积下纸张的质量与面积成正比，故实验时把测绘仪绘制的峰小心剪下，用万分之一天平称量，记录，以峰面积质量代替其面积。
2、香菇多糖含量测定
取冷冻干燥后的香菇多糖壳聚糖纳米粒，用0.2mol/L的Tris-NaCl缓冲液复溶，配置成浓度为20mg/100mL，经超声破坏后进样10mL，用0.2mol/L、0.4mol/L、1.0mol/L的Tris-NaCl缓冲液逐个过柱。
数据处理：把测绘仪绘制的峰小心剪下，用万分之一天平称量，记录。
3、计算包封率和载药量
包封率＝被包裹药物质量÷总投药量×100％；
载药量＝被包裹药物质量÷纳米制剂总质量×100％；
计算结果见表1。
表1不同质量比壳聚糖/STPP制备的香菇多糖壳聚糖纳米粒的理化性质评价(n＝3，n代表测试次数)
| 壳聚糖与STPP的质量比 | 粒径，nm | 包封率，％ | 载药量，％ |
| 5 | 227±9 | 26.10±1.4 | 42.90±2.1 |
| 5.5 | 217±6 | 24.70±0.3 | 41.50±1.7 |
| 6.25 | 205±14 | 24.30±0.9 | 41.25±1.2 |
从表1看出，本发明不同质量比壳聚糖/STPP制备的香菇多糖壳聚糖纳米粒的粒径小，包封率可达24％以上，载药量也可达41％以上。
五、香菇多糖壳聚糖纳米粒的细胞毒性实验
将HeLa细胞，HepG2细胞，A549细胞分别按照1×104个/孔接种于96孔培养板中，过夜培养至细胞完全贴壁，融合度为60％～80％。用PBS缓冲液洗涤后按180μL/孔加入RPMI1640培养液，并加入20μL不同浓度的香菇多糖壳聚糖纳米粒溶液，空白对照组加入20μL空白纳米粒(即未添加香菇多糖的壳聚糖纳米粒)，继续培养48h。然后每孔加入20μL浓度为5mg/mlL的MTT(四甲基偶氮唑盐)-PBS缓冲溶液，4h后吸去培养液，加入150μL二甲基亚砜(DMSO)每孔，振摇10min，在酶标仪上，于570nm测定A值，每组测定3次，求平均值，结果见图3、图4和图5。按以下公式计算细胞抑制率：
细胞抑制率(％)＝(空白对照组A值-实验组A值)÷空白对照组A值×100％
结果表明：本发明香菇多糖壳聚糖纳米粒的细胞毒性远大于空白纳米粒和香菇多糖溶液，且本发明香菇多糖壳聚糖纳米粒与同浓度下各组结果相比具有显著性差异(*表示P＜0.05)，与空白纳米粒相比具有显著性差异(#表示P＜0.05)。
六、香菇多糖壳聚糖纳米粒促进小鼠脾细胞增殖实验
1、小鼠脾细胞的制备
试验选取5～7周小鼠，实验时脱颈处死小鼠，置质量百分浓度75％乙醇中浸泡消毒5min。无菌分离脾脏，用Hanks液冲洗以去除结缔组织和血液。用无菌注射器芯挤压脾脏，过200目网，加入脾脏体积2倍量的RPMI-1640培养液，制成脾细胞悬液。于脾细胞悬液中加入pH7.2、0.01mol/L的Tris-NH4Cl，去除红细胞。37℃温育10min，除去贴壁细胞，以1000r/min速度离心10min，弃上清。用含10％(质量百分浓度)小牛血清的RPMI-1640重悬沉淀，吹打混匀。
2、脾细胞计数
取上述悬液100μL，稀释10倍，用计数板计数(细胞存活率高于95％)。根据计数结果，用含10％(质量百分浓度)小牛血清的RPMI-1640调整细胞浓度为1×106个细胞/mL。
3、纳米粒促进小鼠脾细胞增殖实验
取96孔板，每孔加入180μL的小鼠脾细胞悬液；过夜培养至细胞完全贴壁，融合度为60％～80％。PBS缓冲液洗涤后加入RPMI培养液180μlL/孔，并加入20μL不同浓度的香菇多糖纳米粒，空白对照组加入20μL空白纳米粒(即未添加香菇多糖的壳聚糖纳米粒)，继续培养48h。每孔加入20μLMTT(5mg/ml)，4h后吸去培养液，加入150μLDMSO每孔，振摇10min，在酶标仪上，于570nm测定A值，每组测定3次，求平均值，结果见图6。按以下公式计算细胞促生长率：
促生长率(％)＝(实验组A值-空白对照组A值)÷空白对照组A值×100％
结果表明：香菇多糖壳聚糖纳米粒促小鼠脾细胞生长率远大于空白纳米粒和香菇多糖溶液组，且本发明香菇多糖壳聚糖纳米粒与同浓度下各组结果相比具有显著性差异(*表示P＜0.05)，与空白纳米粒相比具有显著性差异(#表示P＜0.05)。
本发明具有如下有益效果：
本发明香菇多糖壳聚糖纳米粒采用CS与STPP为载体，通过CS与STPP的阴阳离子静电作用自发形成载药纳米粒，结合离子凝胶化法携载水溶性、大分子的香菇多糖成功制备获得稳定性高、包封率好和载药量高的香菇多糖壳聚糖纳米粒。通过对该纳米粒的抗肿瘤作用和免疫增强作用进行考察，发现与香菇多糖溶液相比，香菇多糖壳聚糖纳米粒对HeLa、HepG2、A549等肿瘤细胞的杀伤能力显著增强，并且对小鼠脾细胞的增殖产生了明显的促进作用。表明本发明香菇多糖纳米制剂具有良好的抗肿瘤作用和免疫增强作用，较香菇多糖溶液的抗肿瘤效果更强，稳定性更高。
本发明的制备方法中先将香菇多糖加入到壳聚糖溶液中再制备成纳米粒，可以形成更稳定的纳米粒，且操作简单、安全、有效，符合环保要求，适于工业化生产。
附图说明
图1为本发明香菇多糖壳聚糖纳米粒的透射电镜图；
图2为CS与STPP不同质量比的香菇多糖壳聚糖纳米粒的粒径分布和电位分布图；
图3为不同浓度香菇多糖壳聚糖纳米粒对HeLa细胞的抑制率；
图4为不同浓度香菇多糖壳聚糖纳米粒对HepG2细胞的抑制率；
图5为不同浓度香菇多糖壳聚糖纳米粒对A549细胞的抑制率；
图6为不同浓度香菇多糖壳聚糖纳米粒对小鼠脾淋巴细胞的促生长率；
其中，图3～图6中，CS-GLP-NP代表本发明的香菇多糖壳聚糖纳米粒；GLP代表香菇多糖溶液；NP代表空白纳米粒。
具体实施方式
实施例1
(1)将分子量为50kDa、脱乙酰度为95％的壳聚糖250mg溶于质量百分浓度为1％的醋酸水溶液中，室温磁力搅拌10min，搅拌速度为70r/min，使壳聚糖在醋酸环境下溶胀，配制成壳聚糖浓度为1.5g/L的壳聚糖溶液；
(2)将6mg的香菇多糖热溶于100ml水中配制成浓度为60μg/mL的香菇多糖溶液；
(3)精确量取10ml香菇多糖溶液加入上述壳聚糖溶液，用质量百分浓度为1％的NaOH水溶液调节使壳聚糖溶液的pH值为5，再缓慢滴加4.5ml质量百分浓度为1％的三聚磷酸钠水溶液(三聚磷酸钠重量为45mg)，使三聚磷酸钠与壳聚糖通过阴阳离子静电作用自发形成载药纳米粒。然后再磁力搅拌60min，使纳米粒稳定后离心，收集沉淀，把沉淀用双蒸水复溶，过450nm的滤膜，除去多余的壳聚糖凝集物，滤液冷冻干燥，即制得香菇多糖壳聚糖纳米粒。
实施例2
(1)将分子量为10kDa、脱乙酰度为90％的壳聚糖250mg溶于质量百分浓度为0.5％的醋酸水溶液中，室温磁力搅拌10min，搅拌速度为70r/min，使壳聚糖在醋酸环境下溶胀，配制成壳聚糖浓度为2g/L的壳聚糖溶液；
(2)将6mg的香菇多糖热溶于100ml水中配制成浓度为60μg/mL的香菇多糖溶液；
(3)精确量取10ml香菇多糖溶液加入上述壳聚糖溶液，用质量百分浓度为1％的NaOH水溶液调节使壳聚糖溶液的pH值为5，再缓慢滴加4.5ml质量百分浓度为1％的三聚磷酸钠水溶液(三聚磷酸钠重量为45mg)，使三聚磷酸钠与壳聚糖通过阴阳离子静电作用自发形成载药纳米粒。然后再磁力搅拌60min，使纳米粒稳定后离心，收集沉淀，把沉淀用双蒸水复溶，过450nm的滤膜，除去多余的壳聚糖凝集物，滤液冷冻干燥，即制得香菇多糖壳聚糖纳米粒。
实施例3
(1)将分子量为50kDa、脱乙酰度为90％的壳聚糖250mg溶于质量百分浓度为2.5％的醋酸水溶液中，室温磁力搅拌10min，搅拌速度为70r/min，使壳聚糖在醋酸环境下溶胀，配制成壳聚糖浓度为2.5g/L的壳聚糖溶液；
(2)将6mg的香菇多糖热溶于100ml水中配制成浓度为60μg/mL的香菇多糖溶液；
(3)精确量取10ml香菇多糖溶液加入壳聚糖溶液，用质量百分浓度为1％的NaOH水溶液调节使壳聚糖溶液的pH值为5，再缓慢滴加4.5ml质量百分浓度为1％的三聚磷酸钠水溶液(三聚磷酸钠重量为45mg)，使三聚磷酸钠与壳聚糖通过阴阳离子静电作用自发形成载药纳米粒。然后再磁力搅拌60min，使纳米粒稳定后离心，收集沉淀，把沉淀用双蒸水复溶，过450nm的滤膜，除去多余的壳聚糖凝集物，滤液冷冻干燥，即制得香菇多糖壳聚糖纳米粒。
实施例4
(1)将分子量为100kDa、脱乙酰度为95％的壳聚糖250mg溶于质量百分浓度为1％的醋酸水溶液中，室温磁力搅拌10min，搅拌速度为70r/min，使壳聚糖在醋酸环境下溶胀，配制成壳聚糖浓度为2.5g/L的壳聚糖溶液；
(2)将6mg的香菇多糖热溶于100ml水中配制成浓度为60μg/mL的香菇多糖溶液；
(3)精确量取10ml香菇多糖溶液加入壳聚糖溶液，用质量百分浓度为1％的NaOH水溶液调节使壳聚糖溶液的pH值为5，再缓慢滴加4.5ml质量百分浓度为0.1％的三聚磷酸钠水溶液(三聚磷酸钠重量为45mg)，使三聚磷酸钠与壳聚糖通过阴阳离子静电作用自发形成载药纳米粒。然后再磁力搅拌60min，使纳米粒稳定后离心，收集沉淀，把沉淀用双蒸水复溶，过450nm的滤膜，除去多余的壳聚糖凝集物，滤液冷冻干燥，即制得香菇多糖壳聚糖纳米粒。
实施例5
(1)将分子量为100kDa、脱乙酰度为90％的壳聚糖250mg溶于质量百分浓度为1％的醋酸水溶液中，室温磁力搅拌10min，搅拌速度为70r/min，使壳聚糖在醋酸环境下溶胀，配制成壳聚糖浓度为2.5g/L的壳聚糖溶液；
(2)将10mg的香菇多糖热溶于100ml水中配制成浓度为100μg/mL的香菇多糖溶液；
(3)精确量取10ml香菇多糖溶液加入壳聚糖溶液，用质量百分浓度为1％的NaOH水溶液调节使壳聚糖溶液的pH值为5，再缓慢滴加45ml质量百分浓度为0.1％的三聚磷酸钠水溶液(三聚磷酸钠重量为45mg)，使三聚磷酸钠与壳聚糖通过阴阳离子静电作用自发形成载药纳米粒。然后再磁力搅拌60min，使纳米粒稳定后离心，收集沉淀，把沉淀用双蒸水复溶，过450nm的滤膜，除去多余的壳聚糖凝集物，滤液冷冻干燥，即制得香菇多糖壳聚糖纳米粒。
实施例6
(1)将分子量为100kDa、脱乙酰度为95％的壳聚糖250mg溶于质量百分浓度为1％的醋酸水溶液中，室温磁力搅拌10min，搅拌速度为70r/min，使壳聚糖在醋酸环境下溶胀，配制成壳聚糖浓度为2.5g/L的壳聚糖溶液；
(2)将15mg的香菇多糖热溶于100ml水中配制成浓度为150μg/mL的香菇多糖溶液；
(3)精确量取10ml香菇多糖溶液加入上述壳聚糖溶液中，用质量百分浓度为1％的NaOH水溶液调节使壳聚糖溶液的pH值为4，再缓慢滴加10ml质量百分浓度为0.5％的三聚磷酸钠水溶液(三聚磷酸钠重量为50mg)，使三聚磷酸钠与壳聚糖通过阴阳离子静电作用自发形成载药纳米粒。然后再磁力搅拌60min，使纳米粒稳定后离心，收集沉淀，把沉淀用双蒸水复溶，过450nm的滤膜，除去多余的壳聚糖凝集物，滤液冷冻干燥，即制得香菇多糖壳聚糖纳米粒。
实施例7
(1)将分子量为100kDa、脱乙酰度为90％的壳聚糖200mg溶于质量百分浓度为1％的醋酸水溶液中，室温磁力搅拌10min，搅拌速度为70r/min，使壳聚糖在醋酸环境下溶胀，配制成壳聚糖浓度为2.5g/L的壳聚糖溶液；
(2)将10mg的香菇多糖热溶于100ml水中配制成浓度为150μg/mL的香菇多糖溶液；
(3)精确量取10ml香菇多糖溶液加入上述壳聚糖溶液中，用质量百分浓度为1％的NaOH水溶液调节使壳聚糖溶液的pH值为6，再缓慢滴加3ml质量百分浓度为1％的三聚磷酸钠水溶液(三聚磷酸钠重量为30mg)，使三聚磷酸钠与壳聚糖通过阴阳离子静电作用自发形成载药纳米粒。然后再磁力搅拌60min，使纳米粒稳定后离心，收集沉淀，把沉淀用双蒸水复溶，过450nm的滤膜，除去多余的壳聚糖凝集物，滤液冷冻干燥，即制得香菇多糖壳聚糖纳米粒。
实施例8
(1)将分子量为100kDa、脱乙酰度为95％的壳聚糖150mg溶于质量百分浓度为1％的醋酸水溶液中，室温磁力搅拌10min，搅拌速度为70r/min，使壳聚糖在醋酸环境下溶胀，配制成壳聚糖浓度为2.5g/L的壳聚糖溶液；
(2)将15mg的香菇多糖热溶于100ml水中配制成浓度为150μg/mL的香菇多糖溶液；
(3)精确量取10ml香菇多糖溶液加入上述壳聚糖溶液中，用质量百分浓度为1％的NaOH水溶液调节使壳聚糖溶液的pH值为4，再缓慢滴加14ml质量百分浓度为0.5％的三聚磷酸钠水溶液(三聚磷酸钠重量为70mg)，使三聚磷酸钠与壳聚糖通过阴阳离子静电作用自发形成载药纳米粒。然后再磁力搅拌60min，使纳米粒稳定后离心，收集沉淀，把沉淀用双蒸水复溶，过450nm的滤膜，除去多余的壳聚糖凝集物，滤液冷冻干燥，即制得香菇多糖壳聚糖纳米粒。
对实施例1～8的香菇多糖壳聚糖纳米粒进行检测，结果表明：实施例1～7的香菇多糖壳聚糖纳米粒的粒径均在100nm～230nm，实施例8的香菇多糖壳聚糖纳米粒的粒径为400nm～500nm，实施例1～8的香菇多糖壳聚糖纳米粒稳定性好，包封率均在24％～30％，载药量均在41％～50％，对HeLa、HepG2、A549等肿瘤细胞的杀伤能力显著增强，并且对小鼠脾细胞的增殖产生了明显的促进作用。
Claims (10)
1.一种香菇多糖壳聚糖纳米粒，其特征在于，由如下重量份的原料药和载体材料制成：壳聚糖150份～250份、三聚磷酸钠30份～70份和香菇多糖0.6份～1.5份。
2.根据权利要求1所述的香菇多糖壳聚糖纳米粒，其特征在于，由如下重量份的原料药和载体材料制成：壳聚糖200份～250份、三聚磷酸钠30份～45份和香菇多糖0.6份～1.5份。
3.根据权利要求1所述的香菇多糖壳聚糖纳米粒，其特征在于，所述的壳聚糖的分子量为10kDa～100kDa。
4.根据权利要求1所述的香菇多糖壳聚糖纳米粒，其特征在于，所述的壳聚糖的脱乙酰度为90％～95％。
5.根据权利要求1所述的香菇多糖壳聚糖纳米粒，其特征在于，所述的香菇多糖壳聚糖纳米粒的粒径为100nm～500nm，zeta电位为0～20mv。
6.根据权利要求1～5任一项所述的香菇多糖壳聚糖纳米粒的制备方法，其特征在于，包括步骤：
(1)将壳聚糖在醋酸或醋酸水溶液中溶胀配制成壳聚糖溶液；
(2)将香菇多糖热溶于水中配制成香菇多糖溶液；
(3)先将香菇多糖溶液加入壳聚糖溶液中，调节壳聚糖溶液的pH值为4～6，再缓慢滴加三聚磷酸钠水溶液，搅拌均匀后离心，收集沉淀，把沉淀复溶、过滤，滤液冷冻干燥，即制得香菇多糖壳聚糖纳米粒。
7.根据权利要求6所述的香菇多糖壳聚糖纳米粒的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的壳聚糖溶液中壳聚糖的浓度为1.5g/L～2.5g/L。
8.根据权利要求6所述的香菇多糖壳聚糖纳米粒的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的醋酸水溶液的质量百分浓度为0.5％～2.5％。
9.根据权利要求6所述的香菇多糖壳聚糖纳米粒的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的香菇多糖溶液的浓度为60μg/ml～150μg/ml。
10.根据权利要求6所述的香菇多糖壳聚糖纳米粒的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述的三聚磷酸钠水溶液的质量百分浓度为0.1％～1％。
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