CN115299445B - 提升香菇多糖对植物诱导抗病性的复合溶液和配制方法、方法及植物田间防治病毒方法 - Google Patents

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Abstract

本申请公开了一种提升香菇多糖对植物诱导抗病性的复合溶液和配制方法、方法及植物田间防治病毒方法，包括：含香菇多糖原药的溶液、含SPc的溶液；SPc为树枝状大分子且经过氨基官能团功能化，结构式如式I，其中n=1~100。所得复合溶液中产生香菇多糖/SPc的复合体，SPc通过氢键作用自发与香菇多糖结合，打破香菇多糖在水溶液中形成的团粒结构，减小其粒径至纳米级，形成了近球形颗粒，并能显著减小香菇多糖水溶液的接触角，促进香菇多糖的分布和扩散，展现出显著增强植物诱抗能力的特性。

Description

提升香菇多糖对植物诱导抗病性的复合溶液和配制方法、方 法及植物田间防治病毒方法
技术领域
本申请涉及农药技术领域，特别是一种提升香菇多糖对植物诱导抗病性的复合溶液和配制方法、方法及植物田间防治病毒方法。
背景技术
近年来，我国农药使用量零增长行动稳步推进，农药利用率逐步提高，但与农业发达国家相比，我国单位面积化学农药用量比世界平均用量高2倍以上，农药利用率比欧美发达国家低11至20个百分点。如何进一步提升农药利用率、降低传统化学农药使用量成为了我国植保工作者的共同课题。发展纳米农药是实现农药减量控害的有效途径之一，纳米载体助剂可以大幅改善农药的理化性质，实现农药分子的高效递送，达到农药增效、减量的作用，具有广阔的应用前景。
申请人前期研发了一系列药剂型纳米载体其中CN201910618636 .5中公开了一种树枝状大分子且经过氨基官能团功能化的纳米载体，该载体能与植物源农药分子经氢键和疏水作用结合，以克服现有植物源农药毒力和持效性较差的问题。其中所用植物源农药分子为苦参碱、除虫菊酯和D-柠檬烯。但其中并未关注香菇多糖，也未关注该载体如何才能提升香菇多糖对植物诱导抗病性作用。通过分子间相互作用实现纳米级药物装载，大幅提升进入活体细胞的递送效率，初步研究结果证明其具有提升防治效率、降低农药使用量、扩大防治谱的作用，为农药的有效利用提供了新的技术途径。
香菇多糖由香菇(Lentinus edodes)子实体中提取、纯化而得的一种多糖,基本结构为5个β(1→3)结合的葡萄糖直链上有2个β-(1→6)结合侧链的高分子葡聚糖。现有香菇多糖在农药领域也可防治植物病毒，如CN200910248521.8中公开了将香菇多糖与井冈霉素复配后作为新型生物农药使用，其中公开了香菇多糖可单独使用实现防治水稻条纹叶枯病。
同时现有文献李鹏鹏. 香菇多糖诱导黄瓜抗霜霉病的作用及与氟醚菌酰胺混效作用的研究[D].山东农业大学,2014.中公开了香菇多糖可用于诱导黄瓜产生抗霜霉病的作用。但现有香菇多糖在田间施用诱导作物抗病的能力不强烈，不持久。若不提前施药预防或发病后不及时施药，病情难以控制。
但现有技术中缺乏能高效诱导烟草产生针对烟草重要病害——烟草病毒病抗性的试剂及诱导方法。
发明内容
本申请提供了一种提升香菇多糖对植物诱导抗病性的复合溶液和配制方法、方法及植物田间防治病毒方法，用于解决现有技术中存在的香菇多糖诱导植株抗病性效果较差，无法通过喷洒现有香菇多糖实现对感染病毒植株快速、有效防治的技术问题。
本申请提供了一种用于提升香菇多糖对植物诱导抗病性的复合溶液，包括：含香菇多糖原药的溶液、含SPc的溶液；
SPc为树枝状大分子且经过氨基官能团功能化，结构式如式I，其中n=1~100：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
式（I）；
植物诱导抗病性为诱导烟草植株抗病毒特性、诱导番茄植株抗病毒特性、诱导马铃薯植株抗病毒特性、诱导黄瓜植株抗病毒特性中的至少一种；
优选地，植物诱导抗病性为诱导烟草植株抗烟草花叶病毒 (TMV)特性、诱导番茄植株抗番茄褪绿病毒 (ToCV)特性、诱导马铃薯植株抗马铃薯Y病毒 (PVY)特性、诱导黄瓜植株抗黄瓜花叶病毒（CMV）特性中的至少一种。
SPC具体结构可参加CN201910618636.5。
该复合溶液将含SPc的溶液与香菇多糖原药溶液混合后，能有效提高香菇多糖对烟草植株对TMV表达明显改变的基因数量，可实现对多达555个基因表达的显著改变。相对单独使用香菇多糖诱导后，烟草植株基因表达显著提高；香菇多糖/SPc复合体较香菇多糖单独处理的TMV表达量下降33.84%；提前喷施处理组中，香菇多糖/SPc复合体较香菇多糖单独处理的TMV表达量下降26.82%；接种TMV后喷施药剂处理组中，提前喷施处理组中，香菇多糖/SPc复合体较香菇多糖单独处理的TMV表达量下降24.50%。效果显著。
该复合溶液还可以用于上述植株的抗病毒特性的诱导中，效果较优。
复合液的配制方法为将含香菇多糖原药的溶液与含SPc的溶液混合，得到复合体溶液。
优选的，按质量比含香菇多糖原药的溶液：含SPc的溶液=1:1~4。
优选地，含香菇多糖原药的溶液浓度为1~4mg/mL；含SPc的溶液浓度为1~16 mg/mL。按该比例混合上述溶液可配制具有上述效果的复合溶液。
优选地，复合溶液中香菇多糖的浓度为20~1000 mg/mL。
优选地，复合溶液中SPC与香菇多糖的结合系数Ka（M-1）为5.099×105；吉布斯自由能ΔG为-38.29 kJ/mol；SPc与香菇多糖之间产生非共价分子相互作用，以氢键作用为主。
优选地，复合溶液中SPC与香菇多糖形成大小均一的球状香菇多糖/SPc复合体；香菇多糖/SPc复合体的平均粒径为141.79±1.38nm；香菇多糖/SPc复合物的接触角降低至82.67°。
以上特性均证明复合溶液中SPC与香菇多糖结合可靠，且接触角降低后，更有利于复合溶液在植株表面流平成膜，促进香菇多糖向植株内渗透。
本申请的另一方面还提供了一种上述复合溶液的配制方法，包括以下步骤：溶解香菇多糖原药后，与含SPc的溶液混合，超声助溶后过滤，得到复合溶液。
优选地，超声助溶处理时间为2~3 min；过滤操作采用450 nm的滤膜。
采用上述方法可配制得到该复合溶液中可可靠形成香菇多糖/SPc复合体，实现促进香菇多糖向植物体内吸作用。
本申请的另一方面还提供一种提升香菇多糖对植物诱导抗病性的方法，包括a~c步骤中的至少一种：
a、采用植物病毒上清液分别溶解香菇多糖原药、SPc，将所得溶液混合后得到如上述复合溶液，将所得复合溶液接种于待诱导抗性植株上；
b、以水为溶剂分别溶解香菇多糖原药、SPc，将所得溶液混合后得到如上述复合溶液，将所得复合溶液接种于待诱导抗性植株上；
c、将植物病毒上清液接种于待诱导抗性植株上，6~48 h后向待诱导抗性植株喷洒如上述复合溶液；
所述复合溶液以水为溶剂分别溶解香菇多糖原药、SPc，将所得溶液混合后得到；
优选地，所述植物病毒为烟草花叶病毒、番茄褪绿病毒、马铃薯Y病毒、黄瓜花叶病毒中的至少一种。
通过上述方法处理后，能诱导待诱导抗性植株产生对该病毒的抗性，同时提高诱导效果。
本申请的另一方面还提供一种植物田间防治病毒方法，包括a或b步骤：
a、将如上述复合溶液喷洒于感染待防治病毒植株的表面；
b、将如上述复合溶液喷洒于未感染病毒植株的表面。
优选地，植物病毒为烟草花叶病毒、番茄褪绿病毒、马铃薯Y病毒、黄瓜花叶病毒中的至少一种。
采用该溶液可实现对已经感染病毒的烟叶的有效防治。替代农药，降低农药的使用量，达到环保的效果。
本申请能产生的有益效果包括：
1）本申请所提供的提升香菇多糖对植物诱导抗病性作用的方法及其药剂，以烟草重要病害——烟草病毒病为防治靶标，采用星型阳离子聚合物纳米载体（SPc）装载的香菇多糖减小香菇多糖在水溶液中的粒径，进一步增强诱导烟草植株的抗病作用，以提升对烟草病毒病的防控效果，进一步完善烟田有害生物绿色防控技术体系，营造绿色、可持续的农田生态环境。
2）本申请所提供的提升香菇多糖对植物诱导抗病性作用的方法及其药剂，通过配制复合溶液得到香菇多糖/SPc复合体，香菇多糖/SPc复合体一方面可以诱导植株产生对病毒的抗病特性，另一方面该复合体还能实现对已感染病毒植株的防治效果，替代农药，降低农药使用量。通过对香菇多糖纳米化可大幅度提升香菇多糖的生物活性，并产生更多的药用价值。突显表现在纳米化的香菇多糖改变了香菇多糖原有的团粒结构，进一步显著地增强了植物的免疫反应和抗病毒能力，在田间能有效控制病毒的发生和传播。
附图说明
图1为本申请实施例中所得SPc/香菇多糖复合体的ITC滴定结果；
图2为本申请实施例1中所用香菇多糖原药的透射电镜照片；
图3为本申请实施例中所得SPc/香菇多糖复合体的透射电镜照片；
图4为本申请实施例中所得SPc/香菇多糖复合体的检测强度-粒径关系曲线图；
图5为水、SPc、香菇多糖、本申请实施例中所得SPc/香菇多糖复合体的接触角结果对比图；
图6为水、SPc、香菇多糖、本申请实施例中所得SPc/香菇多糖复合体接触角测试结果柱状图；
图7为本申请实施例中所得SPc/香菇多糖复合体较香菇多糖单独处理的转录组分析结果中的火山图；图中左侧为下调的214个点，图中为正常点，图右侧为上调；
图8为本申请实施例中所得SPc/香菇多糖复合体较香菇多糖单独处理的转录组分析结果中的差异基因数量散点图；
图9为本申请实施例中所得SPc/香菇多糖复合体较香菇多糖单独处理的转录组分析结果中的诱抗相关基因分析图；
图10为本申请实施例中所得SPc/香菇多糖复合体对TMV表达的抑制效果图中的香菇多糖/SPc复合体的室内生物活性测定中烟草诱导抗病性处理（1）处理后所得结果图；
图11为本申请实施例中所得SPc/香菇多糖复合体对TMV表达的抑制效果图中香菇多糖/SPc复合体的室内生物活性测定中烟草诱导抗病性处理（2）处理后所得结果图；
图12为本申请实施例中所得SPc/香菇多糖复合体对TMV表达的抑制效果图中香菇多糖/SPc复合体的室内生物活性测定中烟草诱导抗病性处理（3）处理后所得结果图；
图13为本申请实施例中单独施用清水对TMV田间防效烟叶照片；
图14为本申请实施例中单独施用SPc对TMV田间防效烟叶照片；
图15为本申请实施例中单独施用香菇多糖对TMV田间防效烟叶照片；
图16为单独施用本申请实施例中所得SPc/香菇多糖复合体对TMV田间防效烟叶照片；
图17为本申请实施例中单独施用清水、单独施用SPc、单独施用香菇多糖、本申请实施例中所得SPc/香菇多糖复合体对TMV的田间防效结果柱状图；
具体实施方式
为使本发明实施方式的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施方式中的附图，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。
因此，以下对在附图中提供的本发明的实施方式的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。
本申请中未详述的且并不用于解决本申请技术问题的技术手段，均按本领域公知常识进行设置，且多种公知常识设置方式均可实现。
实施例
以下实施例中所用物料和仪器，如无特殊说明均为商业渠道获取。
实施例1
按以下步骤配制复合溶液：
准确称量20 mg香菇多糖原药，溶解于5 mL超纯水中，得到4 mg/mL的母液，与10mg/mL的SPc混合，配制得到香菇多糖与SPc质量比为1:1的香菇多糖/SPc复合体溶液，其中香菇多糖浓度为0.5 mg/mL，将所得溶液置于超声波清洗仪中超声助溶2-3 min后，过450nm的滤膜，得到复合溶液。
实施例2 测定复合溶液中香菇多糖/SPc复合体的特性：
1、等温滴定量热法测定香菇多糖/SPc复合体中香菇多糖与SPc的结合作用力
用超纯水清洗滴定用注射器、样品池和标准池各3次，在标准池中注入超纯水作为对照。用0.031 mM的香菇多糖待测液润洗样品池2次，加入香菇多糖待测液，使液面与样品池金属沿持平。用0.31 mM的SPc溶液润洗滴定用注射器2次。注射器吸入样品后，将注射器活塞拔出，并让溶液从末端滴出流向注射器末端。在溶液快流出末端时，插入注射器活塞，推压活塞，让少量液体流出针头，以确保注射器中无气泡。最终在滴定用注射器中装入250μL的0.31 mM SPc滴定液，将注射器旋入手柄，擦拭针头，确保无残留液体，再将手柄装入热量仪。设置等温滴定微量热仪（TA NANO ITC）测试条件如下：检测温度为25°C，共滴定25次，每次进样10 μL，每隔300 s进样一次。用NanoAnalyzeTM软件处理滴定数据，将滴定数据用Independent模型拟合，最终得到Ka、ΔH、ΔS等热力学参数。
实验结果：
等温滴定量热法结果显示（图1）：纳米载体与香菇多糖的结合系数Ka（M-1）为5.099×105，表明两者之间有较强的相互作用。熵变ΔH为-56.91 kJ/mol，函变ΔS为-62.46 J/mol·K，根据吉布斯自由能：ΔG=ΔH-TΔS，算得两物质相互作用反应的吉布斯自由能ΔG为-38.29 kJ/mol，表明SPc与香菇多糖能自发结合。根据反应的ΔH和ΔS，可推测SPc与香菇多糖之间的非共价分子相互作用主要由氢键作用产生。
、香菇多糖/SPc复合体的粒径及形貌观测
准确称量20 mg香菇多糖原药，溶解于5 mL超纯水中，得到4 mg/mL的母液，与10mg/mL的SPc混合，配制得到香菇多糖与SPc质量比为1:1的香菇多糖/SPc复合体溶液，其中香菇多糖浓度为0.5 mg/mL，以同浓度香菇多糖为对照。将以上样品溶液置于超声波清洗仪中超声助溶2-3 min后，过450 nm的滤膜。
利用多角度粒度与高灵敏度Zeta电位分析仪检测香菇多糖/SPc复合体和香菇多糖的粒径，检测条件为：温度25 °C，溶剂水，检测次数为三次，稳定时间为120 s。
同时取以上样品溶液10 μL，置于铜网上晾干，利用投射电镜拍摄并观察形貌。
实验结果：
1）、香菇多糖在水溶液中粒径为350 nm，香菇多糖的透射电镜结果参见图2，香菇多糖/SPc复合体粒径减小到142 nm（表1），香菇多糖/SPc复合体的透射电镜结果参见图3。以上结果与透射电镜结果一致，香菇多糖/SPc复合体为大小均一的球状（图2）。粒径与检测强度曲线图如图4所示。
表1 香菇多糖与香菇多糖/SPc复合体粒径
Figure DEST_PATH_IMAGE003
2）、香菇多糖/SPc复合体的接触角检测
按照香菇多糖与SPc质量比1:1配制0.5 mg/mL的香菇多糖/SPc复合体，以同浓度香菇多糖为对照。取10 μL溶液滴于光滑度一致的毛玻璃上，等待液滴稳定时拍摄照片，并利用椭圆法计算接触角。
如图5~6所示，香菇多糖与毛玻璃表面的接触角为87.38°，而香菇多糖/SPc复合物的接触角降低至82.67°。在SPc的作用下香菇多糖与毛玻璃的接触角显著降低。
3、香菇多糖提升烟草诱导抗性的机制解析
分别用清水、20 mg/mL的香菇多糖和20 mg/mL的香菇多糖/SPc复合体处理健康的烟草植株。在处理24 h后，使用上述的TRNzol配方(TIANGEN，中国)从每个样本的组织中提取总RNA。每个处理制备三个独立的样品。通过Illumina HiSeq测序平台构建转录文库。用BLASTX对数据库KEGG进行标注。每个转录本的表达水平用FPKM值表示。采用Deseq分析不同处理间的差异表达基因(DEGs)，筛选条件为倍数变化≥2.0和FDR<0.01。
实验结果：
1）香菇多糖/SPc复合体增强植物抗病性基因的表达
所得结果参见图7~9，较单独香菇多糖处理，香菇多糖/SPc复合体处理有555个基因的表达明显改变。共有341个基因上调，214个基因下调（图7）。DEGs可分为多种基因途径，如过氧化物酶体、植物-病原物相互作用、矿物质吸收、萜类生物合成等（图8）。
三种不同处理后，所得结果参见图10~12，香菇多糖/SPc复合体较香菇多糖单独处理，多种与植物诱导抗病性相关的基因表达上调，证明了SPc可以提升香菇多糖对烟草抗病性的诱导作用（图12）。如ACOX1基因的表达量升高可促进O2获得电子，大量生成H2O2，诱导植株更多抗病基因的表达，同时CAT基因表达量升高，增强细胞免受H2O2的毒性作用；ATOX1基因的表达量上升，将细胞质铜结合并输送到铜ATP酶蛋白中，在细胞抗氧化防御中发挥重要作用；此外，WRKY、PTI5、RPM1、RPS2和IRAK等一系列基因表达上调，激活包括超敏反应和植物先天免疫反应在内的植株防御系统，可以限制病原物的生长扩散，保护植物免受病原物的侵害。
4、香菇多糖/SPc复合体的室内生物活性测定
烟草花叶病毒（TMV）的提取：取花叶症状明显的0.1 g烟草叶片于液氮中研磨，加入1 mL的0.01M磷酸接种缓冲液（pH7.0），震荡，冰上放置5 min，以4°C，5000 rpm离心，上清液即为TMV。
评价SPc提升香菇多糖对烟草诱导抗病性采用3种处理方式：
（1）用TMV上清液分别溶解香菇多糖和SPc，得到20 mg/L的SPc、香菇多糖、香菇多糖/SPc复合体，在室温下静置30 min，以TMV上清液为对照。将上述溶液分别接种在36株六叶期烟草的第三和第四片叶。
（2）配制20 mg/L的SPc、香菇多糖和香菇多糖/SPc复合体，均匀喷洒在36株六叶期烟草上，清水为对照，24 h后将TMV上清液接种于烟草的第三和第四片叶。
（3）将TMV上清液接种于烟草的第三和第四片叶，24 h后将清水、20 mg/L的SPc、香菇多糖和香菇多糖/SPc复合体均匀喷洒在接种后的烟草上。
于接种后48 h、72 h和96 h，每处理取4株烟草的第三片叶在液氮中均匀研磨，共三个重复。利用天根RNA提取组织裂解液提取总RNA。利用Takara反转录试剂盒获得cDNA。以TMV的CP蛋白基因序列为目的基因，设计荧光定量PCR引物GCGATTGTGACACCAAACCAGCG和TCGGAAGCCGATGGACGCGA），以烟草GAPDH基因为内参基因，设计荧光定量PCR引物TGCAGTGAACGACCCATTTA和TGGATTCCACAACGAAATCA。使用ABI QuantStudio 6进行荧光定量PCR，反应条件：94°C 10 min，60°C 30 s，40个循环。利用2-ΔΔCT方法计算TMV的CP蛋白基因的相对表达量。
实验结果：
香菇多糖/SPc复合体的室内生物活性
采用上述三种方法处理4 d后，提取烟草叶片总RNA，测定TMV相对表达量。
结果表明（参见图10~12）：
首先通过荧光定量可以检测到植物中TMV的相对表达量，表达量越高，植物体内的TMV含量越高，发病程度越严重，表达量越低说明更健康，体现出香菇多糖对植物的诱抗作用。
A：将病毒和香菇多糖复合体孵育后接种，对TMV进行体外处理，明确药剂对TMV是否除了诱抗作用还具有钝化作用。
B：先施药再接种TMV，是让植株先产生抗性，再接种病毒，以评价药剂对病毒病的预防作用，对田间提前施药预防病毒做出依据。
C：先接种TMV，再施药，以评价药剂对病毒的防治作用，是田间比较普遍的一种情况。
体外孵育TMV后接种组中，香菇多糖/SPc复合体较香菇多糖单独处理的TMV表达量下降33.84%；提前喷施处理组中，香菇多糖/SPc复合体较香菇多糖单独处理的TMV表达量下降26.82%；接种TMV后喷施药剂处理组中，提前喷施处理组中，香菇多糖/SPc复合体较香菇多糖单独处理的TMV表达量下降24.50%。
5、香菇多糖/SPc复合体的田间防效测定
在云南烟田开展病毒病的防治测试，挑选烟草花叶病毒病发病单一、均一的10亩烟草田，随机划分小区，设置清水对照、20 mg/mL的SPc、香菇多糖和香菇多糖/SPc纳米载体复合体四个处理，施药后7 d和14 d，按照《烟草病虫害分级及调查方法（GB/T23222-2008）》国家标准中病毒病分级标准进行调查，统计田间防效。
实验结果：香菇多糖/SPc复合体的田间防效
田间施药实验结果如图13~17所示，由图13、14、15、16，采用本申请提供的复合溶液，相对单独使用香菇多糖或单独使用SPc均能显著提高相关多糖对烟草抗病的诱导效果。
参见图17，香菇多糖制剂处理后7 d防效达64.2%，处理后14 d防效仅为31.3%；香菇多糖/SPc复合体处理后7 d防效达91.5%，处理后14 d防效仍保持在81.9%。香菇多糖/SPc复合体较香菇多糖单体在处理7 d时防效提高了27.3%，处理14 d时防效提高了50.6%。
实施例3诱导番茄植株抗ToCV（褪绿病毒）病毒特性田间防效测定
与实施例2中第5项实验条件类似，区别为：喷洒对象为未感染病毒的番茄植株，在各处理组喷洒对应处理组试剂3d后，向各处理组植株接种含番茄ToCV的溶液（OD600：0.5），并正常进行田间管理种植7天后，统计各处理组中植株病情情况。
实验结果：香菇多糖/SPc复合溶液处理后番茄植株发病比例为10.6%，香菇多糖制剂处理后番茄植株发病比例为43.7%；20 mg/mL的SPc处理后番茄植株发病比例为80.4%；清水对照处理后番茄植株发病比例为82.8%。
实施例4诱导马铃薯植株抗马铃薯Y病毒特性田间防效测定
与实施例2中第5项实验条件相同，区别为植株为感染马铃薯Y病毒的马铃薯植株。
实验结果：香菇多糖/SPc复合体处理后7 d防效达79.8%，处理后14 d防效仍保持在63.7%。其他对照组田间防效结果与实施例2中第5项实验相似，在此不累述。
实施例5诱导黄瓜植株抗黄瓜花叶病毒特性田间防效测定
与实施例2中第5项实验条件相同，区别为植株为感染黄瓜花叶病毒的黄瓜植株。
实验结果：香菇多糖/SPc复合体处理后7 d防效达79.8%，处理后14 d防效仍保持在63.7%。其他对照组田间防效结果与实施例2中第5项实验相似，在此不累述。
由实施例3~5所得结果可知，采用本申请提供的复合溶液还能实现诱导烟草植株抗病毒特性、诱导番茄植株抗病毒特性、诱导马铃薯植株抗病毒特性、诱导黄瓜植株抗病毒特性。通过诱导上述植株产生抗病性，实现田间防效效果。
实施例6香菇多糖/SPc复合溶液
与实施例1的区别在于：本实施例中香菇多糖/SPc复合溶液中所用含香菇多糖原药的溶液浓度为 1 mg/mL；含香菇多糖原药的溶液：含SPc的溶液浓度为1 mg/mL；含SPc的溶液按质量比=1:1，所得复合溶液中香菇多糖的浓度为1000 mg/L。
实施例7香菇多糖/SPc复合溶液
与实施例1的区别在于：本实施例中香菇多糖/SPc复合溶液中所用含香菇多糖原药的溶液浓度为 4 mg/mL；含香菇多糖原药的溶液：含SPc的溶液浓度为16 mg/mL；含SPc的溶液按质量比=1:4，所得复合溶液中香菇多糖的浓度为20 mg/L。
实施例8香菇多糖/SPc复合溶液
与实施例1的区别在于：本实施例中香菇多糖/SPc复合溶液中所用含香菇多糖原药的溶液浓度为 3mg/mL；含香菇多糖原药的溶液：含SPc的溶液浓度为10 mg/mL；含SPc的溶液按质量比=1:3，所得复合溶液中香菇多糖的浓度为800 mg/L。
实施例9提升香菇多糖对植物诱导抗病性的方法
与实施例2中第4项实验中的第3中处理的区别在于：将植物病毒上清液接种于待诱导抗性植株上6h后喷洒所述复合溶液。
实施例10提升香菇多糖对植物诱导抗病性的方法
与实施例2中第4项实验中的第3中处理的区别在于：将植物病毒上清液接种于待诱导抗性植株上48h后喷洒所述复合溶液。
实验结论：
本研究成功构建了一种香菇多糖纳米递送系统。
（1）SPc可以通过氢键作用自发与香菇多糖结合，打破香菇多糖在水溶液中形成的团粒结构，减小其粒径至纳米级，形成了近球形颗粒，并能显著减小香菇多糖水溶液的接触角，促进香菇多糖的分布和扩散。
（2）转录组测序分析表明，香菇多糖/SPc复合体可以进一步激活过氧化物酶体、植物-病原物相互作用、矿物质吸收、萜类生物合成等相关基因通路，提升了一系列的植物抗病相关基因的表达。
（3）在实验室和田间环境下，香菇多糖/SPc复合体展现出更好的诱导植物抗病性能，较香菇多糖单体处理，可以显著提升对TMV的防效。综上所述，本研究构建了一种香菇多糖纳米载药体系，可以提升香菇多糖对植物诱导抗病性的作用，可用于烟草多种病害的高效防控，助力国家“碳达峰”和“碳中和”目标 和农业可持续发展。
尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换,凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种提升香菇多糖对植物诱导抗病性的复合溶液，其特征在于，包括：含香菇多糖原药的溶液、含SPc的溶液；
SPc为树枝状大分子且经过氨基官能团功能化，结构式如式I，其中n=1~100：
Figure DEST_PATH_IMAGE002
式（I）；
植物诱导抗病性为诱导烟草植株抗烟草花叶病毒特性、诱导番茄植株抗番茄褪绿病毒特性、诱导马铃薯植株抗马铃薯Y病毒特性、诱导黄瓜植株抗黄瓜花叶病毒特性中的至少一种；
含香菇多糖原药的溶液：含SPc的溶液按质量比=1:1~4；含香菇多糖原药的溶液浓度为1~4 mg/mL；
含SPc的溶液浓度为1~16 mg/mL；
复合溶液中香菇多糖的浓度为20~1000 mg/L。
2.根据权利要求1所述的复合溶液，其特征在于，复合溶液中SPc与香菇多糖的结合系数Ka为5.099×105 M-1；吉布斯自由能ΔG为-38.29 kJ/mol；SPc与香菇多糖之间产生非共价分子相互作用，以氢键作用为主。
3.根据权利要求1所述的复合溶液，其特征在于，
复合溶液中SPC与香菇多糖形成大小均一的球状香菇多糖/SPc复合体；香菇多糖/SPc复合体的平均粒径为141.79±1.38nm；香菇多糖/SPc复合物的接触角降低至82.67°。
4.一种如权利要求1~3中任一项所述的复合溶液的配制方法，其特征在于，包括以下步骤：溶解香菇多糖原药后，与含SPc的溶液混合，超声助溶后过滤，得到复合溶液。
5.根据权利要求4所述的配制方法，其特征在于，超声助溶处理时间为2~3 min；过滤操作采用450 nm的滤膜。
6.一种提升香菇多糖对植物诱导抗病性的方法，其特征在于，包括a~c步骤中的至少一种：
a、采用植物病毒上清液分别溶解于香菇多糖原药、SPc，将所得溶液混合后得到如权利要求1~3中任一项所述复合溶液，将所得复合溶液接种于待诱导抗性植株上；
b、以水为溶剂分别溶解香菇多糖原药、SPc，将所得溶液混合后得到如权利要求1~3中任一项所述复合溶液，将所得复合溶液接种于待诱导抗性植株上；
c、将植物病毒上清液接种于待诱导抗性植株上，6~48h后向待诱导抗性植株喷洒如权利要求1~3中任一项所述的复合溶液；
所述植物病毒为烟草花叶病毒、番茄褪绿病毒、马铃薯Y病毒、黄瓜花叶病毒中的至少一种。
7.一种植物田间防治病毒方法，其特征在于，包括a或b步骤：
a、将如权利要求1~3中任一项所述复合溶液喷洒于感染植物病毒植株的表面；
b、将如权利要求1~3中任一项所述复合溶液喷洒于未感染病毒植株的表面。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述植物病毒为烟草花叶病毒、番茄褪绿病毒、马铃薯Y病毒、黄瓜花叶病毒中的至少一种。
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