CN105646752A - 一种荧光星形聚合物及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及化合物制备及蛋白分子载体，具体公开了一种荧光星形聚合物及其制备方法与应用。本发明荧光星形聚合物以苝类衍生物及其类似物作为荧光核，采用“发散法”制备出了不同代数、携带氨基酸特征基团的荧光星形聚合物。该类荧光星形聚合物分子，因其外围携带特殊的氨基酸基团，易被活体培养细胞识别并吞噬。并且通过非共价键，能够分别与带有负电荷或正电荷的蛋白分子结合，各自形成稳定的复合体。本发明荧光星形聚合物可以作为载体，可以保护并运载外源蛋白分子成功进入活体培养细胞，通过食物饲喂的方法，杀虫毒性蛋白分子能够通过聚合物的运载功能高效地进入活体昆虫体内细胞，方便其发挥毒力作用，导致昆虫发育迟缓和中毒致死。

Description

一种荧光星形聚合物及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及化合物制备及蛋白载体领域，具体地说，涉及一种荧光星形聚合物及其制备方法与应用。

背景技术

由于目前大规模种植Bt转基因作物，没有科学规划地滥用Bt类化学农药，使得原先的敏感型昆虫对Bt的抗性急剧增加，成为害虫防治领域的一大难题。通过科学的方法来打破昆虫抗性变得尤为重要。目前常用的策略主要是通过科学的布局，在Bt转基因作物周围种植非转基因作物以提供昆虫的“避难所”，或通过增加Bt毒蛋白分子的多样性，避免昆虫的抗性基因频率迅速扩大，从而延缓昆虫的Bt抗性。这些方法能够在一定程度上延缓昆虫的抗性进化，但在应用过程中并不容易实施。种植者的素质、种植规模等实际问题，限制了它们的应用范围。有研究表明，昆虫对毒蛋白分子的抗性一部分原因是昆虫基因突变后，肠道细胞膜上的毒蛋白分子受体变异或表达量大幅减少，使得外源毒蛋白分子很难结合上细胞膜受体，导致毒蛋白毒力下降，害虫产生抗药性。

近几年高分子材料在蛋白分子载体系统中的发展十分迅速，其中蛋白分子载体体系主要包括可降解聚合物微球、水凝胶、多壁碳纳米管、电荷反转型胶束等。而以荧光星形聚合物作为蛋白分子载体的研究还未报道过。苝酰亚胺类化合物是一类光、热、化学稳定性非常良好的荧光化合物，荧光量子效率非常高(接近于1)。凭借其优越的染色性能，一直被广泛应用于有机光电器件、激光染料等光电领域。

近年来，此类化合物开始应用于生物领域，如蛋白分子靶向标记和细胞特异性标记等。然而水溶性差这一缺点，直接影响了其在此领域的应用。因此提高这类化合物的水溶性并增强与蛋白分子的亲和性，将对研发新型蛋白分子载体具有非常重要的意义。氨基酸是蛋白分子的基本组成单元，而聚合得到的聚氨基酸与蛋白分子拥有相似的功能基团，根据“相似相容”原理，两者具有非常好的亲和性。因此通过水溶性的氨基酸基团对苝类化合物外围进行修饰，既可提高其水溶性又可以增强对蛋白分子的亲和性。

星形聚合物是树状聚合物中最简单的一种拓扑结构，具有设计方便，合成周期短的特点。另外，星形聚合物还具有其它一些优点，如分子内部具有空腔结构、官能团密度高等。这些优点使其在设计合成苝类聚氨基酸并应用于蛋白分子载体方面拥有巨大优势。因而，发明一种简单、高效的方法用于制备氨基酸功能化的苝类荧光星形聚合物，研究这类荧光星形聚合物作为蛋白分子载体在生物医药领域和昆虫防治领域的应用，将具有非常重要的意义。

公开号为CN103172776A的中国专利公开了一种荧光星形聚合物作为核酸物质载体应用于活体培养细胞和昆虫的方法。以苝类衍生物及其类似物作为荧光核，采用“发散法”制备出了不同代数、携带阳离子基团的荧光星形聚合物。该类荧光星形聚合物具有很好的生物相容性和很低的细胞毒性，分子外围携有带正电荷的氨基，能够进入活体培养细胞，并且能够与带负电荷的DNA或RNA结合，形成一个稳定的复合体，作为载体携带并保护外源核酸进入活体培养细胞。通过食物饲喂或体腔注射该类载体与DNA或RNA的混合物，该类载体能够快速携带DNA或RNA进入活体昆虫体内细胞中，便于这些核酸发挥作用、干扰昆虫靶标基因的正常表达，从而导致昆虫生长发育异常直至生病或死亡。

然而，上述技术方案中的荧光星形聚合物属于氨基类聚合物，作为阳离子型的聚合物，氨基类聚合物可以利用与DNA之间的静电吸附作用，达到运载基因的目的，目前它们只能作为负电性核酸物质如DNA和dsRNA的载体，而无法作为通用型蛋白分子载体。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种能够携带蛋白分子的荧光星形聚合物及其制备方法与应用。

为了实现本发明目的，本发明首先提供一种荧光星形聚合物，其结构如式(IV)所示：

其中，R为氢原子或者含碳数为1～9的烷基，n＝1～100，k＝1～4，m＝1～3。

其中的波浪线代表某种起到连接作用的化学结构。

作为优选，所述的荧光星形聚合物中，n＝5～30，k＝1～2，m＝2～3，R为碳数在2～4之间的烷基链有更好的效果。其原因在于，当m＝2-3时中间的荧光核由两个或三个萘环相连形成共轭结构，即苝和三萘嵌二苯。它们的荧光发射波长>600nm，高于生物背景荧光的波长范围(400-550nm)，有利于其发挥生物成像的优势。当n＝5～30，k＝1～2时，聚合物的重复单元数较少，总数低于1200个，聚合物的体积相对较小，比表面积相对较大，有利于对蛋白质的吸附，并且和蛋白质形成的复合物体积也相对较小，有利于实现细胞的吞噬。而当R为碳数2～4之间的烷基时，既保证了聚合物的水溶性，又增加了与蛋白质之间的分子间作用力。

在本发明的一个具体实施例中，所述的荧光星形聚合物为聚L-异亮氨酸甲基丙烯酰胺，化学结构式如式(V)所示：

其中，n＝15。

上述聚合物具有共轭的多苯环结构，即苝，其荧光发射波长在620nm左右。聚合物含有四个聚合物链，分子结构为发散的星形结构，且每个重复单元中都含有异亮氨酸的残基，即羧基和烷基结构。

本发明还提供了所述荧光星形聚合物的制备方法，其是以化合物2为单体，以化合物3为引发剂，采用ATRP活性聚合得到荧光星形聚合物；

单体化合物2的结构如式(II)所示：

化合物3的结构如式(III)所示：

其中，R为氢原子或者含碳数为1～9的烷基，k＝1～4，m＝1～3。

式(III)中的化合物具有共轭的多苯环结构，在波长为200-700nm的光照下可发出波长为400-750nm的荧光，其外围有多个溴异丁基酯结构。这类化合物可作为ATRP引发剂，引发式(II)中的单体化合物，式中R为氢原子或者含碳数为1～9的烷基。得到的聚合物保持了荧光特性，且其外围聚合物链中含有大量氨基酸残基，整个聚合物呈发散的星形结构。

更为具体地，所述制备方法是：化合物2相对化合物3的用量为10～500倍，在60～70℃的条件下进行反应。在该条件下，所述反应能够在反应速率和分子量分布方面得到更好的控制。

作为优选，将化合物3溶于有机溶剂中，使得化合物3的浓度在2～5g/L范围内，加入与化合物3等物质的量的CuBr后，进行3～4次冷冻-抽排循环；之后在氮气保护下，加入5～15倍于化合物3物质的量的配体PMDETA(N，N，N'，N，'N”-五甲基二亚乙基三胺)及10～500倍于化合物3物质的量的单体化合物2；再次冷冻抽排后，搅拌10～15分钟，使CuBr与配体完全络合，在60～70℃下反应30-120分钟；反应结束后，除去溶剂，透析，冷冻干燥。

作为优选，所述有机溶剂为丁酮和甲醇的混合物，丁酮和甲醇的体积比为2:1。本申请用到的ATRP聚合属于溶液聚合，采用丁酮和甲醇的混合物可以实现油溶性的引发剂和水溶性的单体溶解在同一体系中，从而有利于聚合反应的进行。

进一步地，所述单体化合物2的制备方法为：将化合物1溶解在氢氧化钠水溶液中，使得溶液的pH值在10以上，随后在0℃附近，逐滴加入甲基丙烯酰氯，并补充相应的氢氧化钠溶液以维持pH值在9～11之间；滴加完毕后，在室温下搅拌1～3个小时，之后用稀盐酸对溶液进行酸化，使得pH值降至1～3之间；用乙酸乙酯萃取，用旋转蒸发仪除去大部分溶剂，通过热饱和溶液法重结晶，得到化合物2；

化合物1的结构如式(I)所示：

其中，R为氢原子或者含碳数为1～9的烷基。

本发明还进一步提供了所述荧光星形聚合物作为蛋白分子载体的应用。

所述应用具体为，将荧光星形聚合物与外源蛋白分子混合形成复合体，然后与细胞共孵育，通过细胞内吞作用使携带有外源蛋白分子的荧光星形聚合物载体进入细胞内，或通过注射或喂饲昆虫的方法，使携带有外源蛋白分子的荧光星形聚合物载体进入昆虫体内。

可选的，将所述荧光星形聚合物应用于活体细胞：

把此类荧光星形聚合物以一定的浓度加入到细胞培养液中，培养活体细胞一段时间后，该类化合物迅速通过细胞内吞作用进入细胞内，通过荧光显微镜拍照分析，清晰观察该类化合物分子在细胞内的分布状况。将该类化合物外源蛋白分子在试管内混合形成复合体，然后同上述方法与细胞一起孵育一段时间后，该类化合物发挥蛋白分子载体功能，携带外源蛋白分子快速进入细胞，以便外源功能性蛋白分子在细胞内发挥功能。

可选的，将所述荧光星形聚合物应用于活体昆虫：

把此类荧光星形聚合物与功能性外源杀虫Bt毒蛋白分子混合形成复合体，以一定的浓度加入到昆虫饲料中，供昆虫取食一段时间后，该类化合物发挥蛋白分子载体功能，在昆虫肠道内保护外源毒蛋白分子迅速穿透围食膜屏障，进入肠细胞内，大幅增加了进入靶标细胞的蛋白分子数量，以极少的用量，实现该蛋白分子对昆虫的毒杀作用，使得昆虫发育迟缓和中毒死亡。该过程在即使在缺乏该毒蛋白分子受体的抗性昆虫中仍然适用，打破了昆虫对Bt毒蛋白分子的抗性，扩大了Bt毒蛋白分子的杀虫谱。

作为一种新型的可被荧光追踪的蛋白分子载体，此类聚合物在药物蛋白分子运载的生物医学领域及害虫防治领域具有很好的应用价值。

本发明在提供了荧光星形聚合物的基础上，进一步提供一种毒杀昆虫的方法，其是以前述荧光星形聚合物作为蛋白分子载体，携带外源毒蛋白分子进入细胞内或昆虫体内，从而毒杀昆虫。

可选的，该荧光星形聚合物载体可通过注射或喂饲昆虫的方式，进入昆虫体内，从而毒杀昆虫。

作为优选，所述外源蛋白分子的代表为正电荷的组蛋白或负电荷的Bt毒蛋白，该类蛋白与本发明提供的荧光星形聚合物能够更好的结合，被高效地运载进入细胞。

本发明的有益效果在于：

本发明提供了一类新型高效蛋白载体，可运送杀虫毒蛋白分子，打破外源毒蛋白分子的进入昆虫肠细胞的屏障，大幅提高毒蛋白特别是Bt毒蛋白的杀虫效率，扩大Bt毒蛋白的杀虫谱。

本发明通过分子设计合成了以有机荧光发色团为核心并携带有氨基酸基团的功能性荧光星形聚合物。该类聚合物具有良好的光、热、化学稳定性、结构可设计性、优异的生物相容性等特性。

本发明步骤简单易行，可迅速制备结构可设计的星形聚合物：一方面可通过改变引发剂的代数，控制聚合物的臂数；另一方面可通过调整加料比例或反应时间调控聚合物链长。

本发明制备得到的荧光星形聚合物的结构特征中有大量氨基酸残基，其中的羧基和烷基为蛋白质的吸附提供了条件，使得无论是负电性的还是正电性的蛋白质都可以通过静电吸附或氢键与范德华力与聚合物形成稳定结合。更重要的是，吸附了蛋白质后所形成的复合物可以顺利地进入细胞，这与氨基酸残基有很大的联系。具体的说，本发明提供的荧光星形聚合物分子外围携有氨基酸基团，能够进入活细胞，并且能够通过离子键与带正电荷的蛋白分子如组蛋白分子结合，形成一个稳定的复合物，可以作为蛋白分子载体，保护并携带外源蛋白分子进入活细胞。该类载体分子也能通过范德华力或氢键作用，结合带负电的Bt毒蛋白分子，运载Bt蛋白分子进入昆虫肠细胞，引发致死过程，使昆虫生长发育迟缓和中毒死亡。因此，该类载体作为一种新型的荧光高分子蛋白分子载体在生物医药领域和农业昆虫防治领域具有很好的应用价值。

附图说明

图1为合成L-异亮氨酸甲基丙烯酰胺的路线图

图2为4Br-PDI的合成路线图

图3为聚L-异亮氨酸甲基丙烯酰胺的合成路线图

图4为聚L-异亮氨酸甲基丙烯酰胺的核磁谱图

图5为不同浓度聚L-异亮氨酸甲基丙烯酰胺水溶液的紫外吸收和荧光光谱图

图6为聚L-异亮氨酸甲基丙烯酰胺和组蛋白分子(HS)发生作用的紫外吸收和荧光光谱图

图7为载体分子携带外源蛋白分子进入细胞。A’.载体携带外源蛋白分子进入细胞的荧光成像图。B’.被携带进入细胞的蛋白分子荧光图。B”.进入细胞的载体荧光图。D.不同孵育时间载体分子所携带进入细胞的外源蛋白分子荧光强度。

图8为载体/Bt毒蛋白分子防治抗Bt昆虫。A.饲喂单独载体的昆虫幼虫。B.饲喂单独毒蛋白分子的昆虫幼虫生长发育正常。C.饲喂载体/Bt毒蛋白分子复合体后幼虫生长发育受阻。D.饲喂载体/Bt毒蛋白分子复合体后幼虫死亡。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

实施例1

实施例1以星形聚L-异亮氨酸甲基丙烯酰胺为例，用于说明本发明所述荧光星形聚合物的制备方法。

(1)单体的合成：如附图1所示，将L-异亮氨酸(1.0g，7.5mmol)溶解在氢氧化钠水溶液中(1mol/L，7.5mL)并搅拌均匀。在0℃下逐滴滴加甲基丙烯酰氯(1.17g，11.2mmol)，在30分钟的滴加过程中用浓度为2mol/L的氢氧化钠水溶液调节pH值，使其维持在10附近。回到室温(25℃)开始反应时，pH值维持在7.5附近。1个小时之后，用盐酸水溶液(2mol/L)进行酸化，然后用乙酸乙酯进行萃取(4×30mL)。有机相经过无水硫酸钠干燥后，用旋转蒸发仪除去大部分溶剂，之后通过重结晶的方法得到产物最终得到产物1.4g，即L-异亮氨酸甲基丙烯酰胺，产率90％。

(2)4Br-PDI的合成：如附图2所示，将四羟基苝酰亚胺(4OH-PDI，400mg，0.32mmol)溶于40mLTHF，转移至250mL三口烧瓶，通氮气15分钟，排除空气，将烧瓶加入冰浴中，直至降温并保持在0℃附近，先加入三乙胺(1.80mL，12.8mmol)，然后逐滴滴加2-溴异丁酰溴(1.60mL，12.8mmol)。搅拌10分钟之后，逐渐升温至室温开始反应。使用薄层色谱检测反应程度，48小时候结束反应。用水洗的方法除去反应物中的盐类，得到粗产物。使用二氯甲烷做淋洗剂，柱色谱分离得到纯产物，即四溴苝酰亚胺(4Br-PDI)450mg，产率76％。

(3)聚L-异亮氨酸甲基丙烯酰胺的合成：如附图3所示，将引发剂4Br-PDI(10.0mg，5.4μmol)和催化剂CuBr(3.1mg，21.6μmol)加入25mL反应管中，用2mL2-丁酮和甲醇的混合物(体积比2:1)溶解，经过三次冷冻抽排过程达到除氧的目的，在惰性气体的保护下加入配体PMDETA(N，N，N'，N，'N”-五甲基二亚乙基三胺，77.8mg，450μmol)和L-异亮氨酸甲基丙烯酰胺(430mg，2.16mmol)，随后用橡胶塞密封，经过搅拌CuBr和配体完全络合后，将反应管加入65℃油浴中开始反应。经过特定的时间可得到相应链长的聚合物：如30分钟可得15个链长的聚合物。反应结束后，通过旋转蒸发除去溶剂，将剩余物透析三天，每5小时换一次去离子水，最后经过冷冻干燥得到最终产物聚L-异亮氨酸甲基丙烯酰胺，简称P1，其核磁谱图见附图4。

实验例1聚L-异亮氨酸甲基丙烯酰胺的光学特性

将1.2mg聚L-异亮氨酸甲基丙烯酰胺(P1)溶解在8mL纯水中，制成浓度为1.25×10^-5mol/L的水溶液，分别将其稀释成浓度为6.25×10^-6mol/L，4.16×10^-6mol/L，2.76×10^-6mol/L和1.84×10^-6mol/L的水溶液，并分别测试它们的紫外吸收和荧光发射谱图，见附图5。

为了观察蛋白质对P1荧光性质的影响，取浓度为5.00×10^-5mol/L的Histone(HS)水溶液20μL滴加到浓度为1.84×10^-6mol/L的P1水溶液中，即在P1水溶液中加入一份HS，测试并记录其荧光光谱，并按照相同的方法陆续加入总计8份HS，得到的荧光光谱比较见附图6。实验例2外源蛋白分子运载进入活细胞

将合成的氨基星形聚合物载体分子与外源碱性蛋白分子形成载体/蛋白分子复合物，与活体培养细胞一起孵育，考察了蛋白分子和载体络合的比例，即载体分子所带阴离子的电荷量与蛋白分子所带阳离子的电荷量比(N/P)对细胞转染的影响。如附图7所示，通过研究以不同N/P比(4：1，2：1，1:1；2：1，4：1)形成的载体分子和蛋白分子复合物转染细胞的结果发现，载体分子在所有N/P比条件下均显示良好的运载能力。以4：1的N/P合成载体/蛋白分子复合物孵育细胞时，0.5h时细胞内可检测出外源蛋白分子信号，表明载体分子能够快速高效地携带外源蛋白分子进入活细胞。

实验例3与杀虫蛋白分子联合作用防治昆虫

载体分子结合Bt毒蛋白分子杀灭对Bt具有抗性的昆虫

在25℃条件下，将4μg载体分子和1μg杀虫Bt蛋白分子混合形成载体/Bt毒蛋白分子复合物，半小时后，加入2mg昆虫饲料中，与饲料混匀后单独饲喂刚孵化出的一龄幼虫。每隔24h观察拍照，并量其体长和体重。在此设置2个对照组，分别是：单独Bt毒蛋白分子，单独载体分子。72h后，载体分子/Bt毒蛋白分子饲喂的幼虫中毒死亡。12d后，观察存活下来的幼虫，我们还发现载体分子/Bt毒蛋白分子复合物饲喂的幼虫发育迟缓，体长和体重相比其余对照均有下降。以上结果见附图8。因此，载体分子结合Bt毒蛋白分子进入幼虫的肠细胞内，充分发挥Bt毒蛋白分子的作用，抑制昆虫正常的生长发育，使昆虫中毒致死。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种荧光星形聚合物，其特征在于，其结构如式(IV)所示：

其中，R为氢原子或者含碳数为1～9的烷基，n＝1～100，k＝1～4，m＝1～3。

2.根据权利要求1所述的荧光星形聚合物，其特征在于，n＝5～30，k＝1～2，m＝2～3，R为碳数在2～4之间的烷基链。

3.根据权利要求1或2所述的荧光星形聚合物，其特征在于，所述的荧光星形聚合物为聚L-异亮氨酸甲基丙烯酰胺，化学结构式如式(V)所示：

其中，n＝15。

4.权利要求1所述荧光星形聚合物的制备方法，其特征在于，单体化合物2在引发剂化合物3的作用下，采用ATRP活性聚合得到荧光星形聚合物；

单体化合物2的结构如式(II)所示：

化合物3的结构如式(III)所示：

其中，R为氢原子或者含碳数为1～9的烷基，k＝1～4，m＝1～3。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，化合物2相对化合物3的用量为10～500倍，在60～70℃的条件下进行反应；

优选地，将化合物3溶于有机溶剂中，使得化合物3的浓度在2～5g/L范围内，加入与化合物3等物质的量的CuBr后，进行3～4次冷冻-抽排循环；之后在氮气保护下，加入5～15倍于化合物3物质的量的配体PMDETA及10～500倍于化合物3物质的量的单体化合物2；再次冷冻抽排后，搅拌10～15分钟，使CuBr与配体完全络合，在60～70℃下反应30～120分钟；反应结束后，除去溶剂，透析，冷冻干燥。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述有机溶剂为丁酮和甲醇的混合物，丁酮和甲醇的体积比为2:1。

7.根据权利要求4～6任一项所述的制备方法，其特征在于，所述单体化合物2的制备方法为：将化合物1溶解在氢氧化钠水溶液中，使得溶液的pH值在10以上，随后在0℃附近，逐滴加入甲基丙烯酰氯，并补充相应的氢氧化钠溶液以维持pH值在9～11之间；滴加完毕后，在室温下搅拌1～3个小时，之后用稀盐酸对溶液进行酸化，使得pH值降至1～3之间；用乙酸乙酯萃取，用旋转蒸发仪除去大部分溶剂，通过热饱和溶液法重结晶，得到化合物2；

化合物1的结构如式(I)所示：

其中，R为氢原子或者含碳数为1～9的烷基。

8.权利要求1～3任一项所述的荧光星形聚合物作为蛋白分子载体的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，将荧光星形聚合物作为蛋白分子载体，携带外源毒蛋白分子进入细胞内或昆虫体内；

作为优选，所述荧光星形聚合物与外源蛋白分子混合形成复合体，然后与细胞共孵育，通过细胞内吞作用使携带有外源蛋白分子的荧光星形聚合物载体进入细胞内，或通过注射或喂饲昆虫的方法，使携带有外源蛋白分子的荧光星形聚合物载体进入昆虫体内。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述外源蛋白分子为正电荷的组蛋白或负电荷的Bt毒蛋白。