CN106519271A - 一种n‑琥珀酰壳聚糖固载溶菌酶制备抑菌膜的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种N‑琥珀酰壳聚糖固载溶菌酶制备抑菌膜的方法,特别设计一种水溶性较强的天然抑菌膜。对壳聚糖进行琥珀酰化制得NSC,通过EDC、NHS活化NSC的羧基,然后与溶菌酶进行共价结合,最后通过流涎法制得抑菌膜。该方法简单易操作,制得的膜对金黄色葡萄球菌、李斯特菌具有较强的抑菌性。
Description
技术领域
本发明设计一种N-琥珀酰壳聚糖固载溶菌酶制备抑菌膜的方法,特别设计一种改性壳聚糖固载溶菌酶制备抑菌膜的方法。属于精细化工技术领域。
背景技术
甲壳素是自然界中仅次于纤维素的第二大类生物材料,它也是地球上除蛋白质外数量最大的含氮天然有机物。自然界每年生物合成的甲壳素估计有数十亿吨之多,远远超过其它氨基多糖,是一种取之不尽用之不竭的再生资源。人们发现它们在纺织、印染、造纸、医药、食品、生物、化工、农业等众多领域具有许多应用价值。壳聚糖是甲壳质大分子脱去乙酰基后的产物,可溶解于pH<6.5的酸性介质中,但是在中性或碱性条件下易沉淀析出。
溶菌酶是一种广泛存在于各种动植物有机物中的糖苷水解酶,是由129个氨基酸残基组成的碱性球蛋白,等电点在pH值10.8左右,分子量为14000,化学性质非常稳定。当pH值在1.2~11.3的范围剧烈变化时,其结构几乎不变。在酸性环境下,溶菌酶对热的稳定性很强,pH值为4~7时,100℃处理1min仍能保持原有活性,pH值低于4时,溶菌酶可以长期在室温下存放。
溶菌酶的作用是催化水解N-乙酰胞壁酸(N-acetylmuramic acid)和N-乙酰氨基脱氧葡萄糖(N-acetylglucosamine)间的β-1,4糖苷键。因为革兰氏阳性细菌的细胞壁质主要是由胞壁质和磷酸质组成的,其中的主要成分胞壁质又是由杂多糖与多肽组成的糖蛋白,而这种多糖正是由N-乙酰胞壁酸和乙酰氨基脱氧葡萄以β-1,4糖苷键连结的,因此溶菌酶对革兰氏阳性菌表现出较好的抑菌性。
为了改善壳聚糖的溶解性能,需要对其进行化学改性,例如,引入亲水性的功能基团。壳聚糖分子链上具有活性氨基,通过将壳聚糖与琥珀酸酐反应,在氨基葡萄糖单元的N-端引入羧基,增加其在中性及碱性水溶液中的溶解性能;其次,N-琥珀酰壳聚糖分子链上的活性-NH2和-COOH基团,可与多种物质共价结合,是一种非常有价值的载体。
N-琥珀酞壳聚糖(NSC)是近年来研究出的一种新型水溶性壳聚糖衍生物,由壳聚糖与琉拍酸醉酞化反应而得。壳聚糖的N-酰化反应降低了壳聚糖分子内和分子间形成氢键的能力,破坏了壳聚糖分子链原有的规整性,导致其结晶性明显降低,所以NSC的水溶性大大提高,具有良好的生物相容性、低毒性、可以在人体内长期留滞,在琥珀酰化过程中,使得原有壳聚糖引入大量的羧基,通过EDC、NHS活化,与溶菌酶反应,实现两者的共价结合,对金黄色葡萄球菌和李斯特菌表现出良好的抑菌性。
发明内容
本发明是为解决常规壳聚糖水溶性较差的问题,因此,通过改性制备N-琥珀酞壳聚糖。为了实现溶菌酶用于食品的外包装,将溶菌酶与成膜性较强的NSC共价连接,制备抑菌膜。制得的抑菌包装抑菌性较强、无污染。
本发明的技术方案由以下部分组成。
(1)制备NSC:壳聚糖粉末按照1:18-1:22(mg/mL)溶解在DMSO中,缓慢加入琥珀酸酐,使得壳聚糖与琥珀酸酐的质量比为1~3,在50-70℃加热6-8h。过滤,将沉淀物溶解在乙醇中,用1MNaOH溶液调节溶液pH为9-12。过滤后将沉淀物按照1:50~55(mg/mL)溶解在蒸馏水中,再加入丙酮,丙酮与蒸馏水的质量比为3~5,用乙醇和丙酮冲洗沉淀,将获得的产物在50℃真空条件下干燥。
(2)NSC固载溶菌酶:取1gNSC溶解在20-50mLpH为4-7的柠檬酸磷酸缓冲液中,加入EDC、NHS,溶菌酶制得所需溶液。
(3)抑菌膜的制备:将上述制得的液体采用流涎法制膜,加入0%-9%的甘油,在30℃条件下干燥5-13h。
本发明制得的NSC水溶性好,易于实现与溶菌酶的共价结合,制得的抑菌膜对金黄色葡萄球菌、李斯特菌的抑菌性较好,易溶于水溶液。整个操作过程简便易行,制得的膜结构致密,表面光滑,无毒无害。
下面结合实例对本发明内容进行描述。
附图说明
图1为本发明制得的NSC的核磁共振图;
图2为本发明制得的NSC的X-衍射图;
图3为本发明制得的NSC的红外光谱图;
图4、5为本发明制得的抑菌膜电镜扫描照片;
图6为本发明制得的抑菌膜红外光谱图;
图7为本发明制得的抑菌膜圆二色谱图;
图8为发明制得的抑菌膜对李斯特的抑菌性照片;
图9为发明制得的抑菌膜对金黄色葡萄球菌的抑菌性照片;
具体实施例
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1
称取3g壳聚糖粉末加入到63mL的DMSO中混合,缓慢加入7.5g琥珀酸酐,在60℃条件下反应7h,过滤溶液,在室温下将沉淀物溶解在乙醇中,在室温下反应2h。用1M NaOH调节溶液的pH为10,过滤,将沉淀物溶解在140mL的蒸馏水中。再加入420mL丙酮,分别用乙醇和丙酮冲洗沉淀3次,将获得的产物在50℃真空条件下干燥24h。
称取1.0gNSC溶解在20mL的pH=5的柠檬酸磷酸缓冲液中,分别加入0.02gEDC、NHS,在室温下搅拌2h,然后加入0.05g溶菌酶,搅拌2h,然后加入质量分数7%的甘油,采用流涎法制膜,在30℃条件下干燥7h,掀膜。通过抑菌试验检测其抑菌性。
测得所对应添加溶菌酶量为2500ug/mL、1250ug/mL的膜液对李斯特的抑菌圈分别为15mm、11mm,对金黄色葡萄球菌的抑菌圈分别为20mm、14mm。
实施例2
称取3g壳聚糖粉末加入到63mL的DMSO中混合,缓慢加入7.5g琥珀酸酐,在60℃条件下反应7h,过滤溶液,在室温下将沉淀物溶解在乙醇中,在室温下反应2h。用1M NaOH调节溶液的pH为10,过滤,将沉淀物溶解在140mL的蒸馏水中。再加入420mL丙酮,分别用乙醇和丙酮冲洗沉淀3次,将获得的产物在50℃真空条件下干燥24h。
称取1.0gNSC溶解在20mL的pH=6的柠檬酸磷酸缓冲液中,分别加入0.02gEDC、NHS,在室温下搅拌2h,然后加入0.05g溶菌酶,搅拌2h,然后加入质量分数7%的甘油,采用流涎法制膜,在30℃条件下干燥7h,掀膜。通过抑菌试验检测其抑菌性。
测得所对应添加溶菌酶量为2500ug/mL、1250ug/mL的膜液对李斯特不表现出抑菌性,对金黄色葡萄球菌的抑菌圈分别为14mm、11mm。
实施例3
称取3g壳聚糖粉末加入到63mL的DMSO中混合,缓慢加入7.5g琥珀酸酐,在60℃条件下反应7h,过滤溶液,在室温下将沉淀物溶解在乙醇中,在室温下反应2h。用1M NaOH调节溶液的pH为10,过滤,将沉淀物溶解在140mL的蒸馏水中。再加入420mL丙酮,分别用乙醇和丙酮冲洗沉淀3次,将获得的产物在50℃真空条件下干燥24h。
称取1.0gNSC溶解在20mL的pH=7的柠檬酸磷酸缓冲液中,分别加入0.02gEDC、NHS,在室温下搅拌2h,然后加入0.05g溶菌酶,搅拌2h,然后加入质量分数7%的甘油,采用流涎法制膜,在30℃条件下干燥7h,掀膜。通过抑菌试验检测其抑菌性。
测得所对应添加溶菌酶量为2500ug/mL、1250ug/mL的膜液对李斯特、金黄色葡萄球菌不表现出抑菌性。
Claims (3)
1.一种N-琥珀酰壳聚糖固载溶菌酶制备抑菌膜的方法,其特征是,包括步骤如下:
(1)制备NSC:壳聚糖粉末按照1:18~1:22(mg/mL)溶解在DMSO中,缓慢加入琥珀酸酐,使得壳聚糖与琥珀酸酐的质量比为1~3,在50~70℃加热6~8h,过滤,将沉淀物溶解在乙醇中,用1M NaOH溶液调节溶液pH为9~12,过滤后将沉淀物按照1:50~1:55(mg/mL)溶解在蒸馏水中,再加入丙酮,丙酮与蒸馏水的质量比为3~5,用乙醇和丙酮冲洗沉淀,将获得的产物在50℃真空条件下干燥;
(2)NSC固载溶菌酶:取1g NSC溶解在20~50mLpH为4~7的柠檬酸磷酸缓冲液中,加入EDC、NHS,溶菌酶制得所需溶液;
(3)抑菌膜的制备:将上述制得的液体采用流涎法制膜,加入0%~9%的甘油,在30℃条件下干燥5~13h。
2.根据权利要求1所述的NSC固载溶菌酶制备抑菌膜的方法,其特征是NSC与缓冲液的比例为1:20(mg/mL),柠檬酸磷酸缓冲液的pH为5,EDC与NHS的质量比为1:1,NSC与EDC的质量比为1:0.02。
3.根据权利要求1所述,制膜时加入质量比为7%的甘油,在30℃的条件下干燥7h。
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