RU2327738C1 - СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММОБИЛИЗОВАННОЙ β-ФРУКТОФУРАНОЗИДАЗЫ - Google Patents
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММОБИЛИЗОВАННОЙ β-ФРУКТОФУРАНОЗИДАЗЫ Download PDFInfo
- Publication number
- RU2327738C1 RU2327738C1 RU2006141092/13A RU2006141092A RU2327738C1 RU 2327738 C1 RU2327738 C1 RU 2327738C1 RU 2006141092/13 A RU2006141092/13 A RU 2006141092/13A RU 2006141092 A RU2006141092 A RU 2006141092A RU 2327738 C1 RU2327738 C1 RU 2327738C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- sorbent
- temperature
- fructofuranosidase
- column
- enzyme
- Prior art date
Links
Landscapes
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
Abstract
Способ включает оживление чистой культуры Klyuveromyces marxianus Y-303 по методу Коха, засев ее в чашки Петри с 2%-ным сусло-агаром при температуре 48-50°С. Чашки переворачивают вверх дном и выдерживают в течение 2-3 суток в термостате при температуре 28-30°С. Выросшие колонии переносят в чашку Петри с сусло-агаром для наращивания биомассы, затем на скосы с сусло-агаром. Проводят глубинное культивирование дрожжей в колбах емкостью 500 см3, содержащих по 50 см3 пивного сусла в течение 47,5-48,5 ч при температуре 30°С. Выращенную биомассу смешивают с дистиллированной водой в соотношении 1:5, проводят автолиз при температуре 38-42°С в течение 59,5-60,5ч. Полученную ферментсодержащую смесь осаждают этиловым спиртом при рН 5,0 или ацетоном при рН 5,5. Проводят очистку β-фруктофуранозидазы в 3 стадии: удаляют низкомолекулярные примеси гель-фильтрацией на колонке с сефадексом G-25, повышают чистоту ферментного препарата ионообменной хроматографией на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой, фракционируют на колонке с сефадексом G-150. Осуществляют концентрирование на мембране Amicon РМ-30 до 5 см3, направляют на лиофильную сушку при t=-30°C. Осуществляют иммобилизацию β-фруктофуранозидазы на полимерном волокнистом сорбенте (анионите). Перед иммобилизацией сорбент обрабатывают 5%-ной соляной кислотой, дистиллированной водой, 5%-ным раствором едкого натра и снова водой. Каждая обработка длится 12 ч. Промытый сорбент дополнительно обрабатывают 95%-ным этиловым спиртом и снова водой. Готовят водный раствор β-фруктофуранозидазы с содержанием 0,018-0,098 моль/дм3 и инкубируют подготовленный сорбент. Способ позволяет получить иммобилизованный фермент в количестве 0,005-0,025 мг/г, обеспечить чистоту целевого продукта. 2 табл.
Description
Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способам получения иммобилизованной β-фруктофуранозидазы, и может быть использовано при производстве инвертного сахара.
Известен способ получения иммобилизованной β-фруктофуранозидазы (инвертазы) для гидролиза сахарозы, включающий получение очищенной β-фруктофуранозидазы из содержимого клеток дрожжей, иммобилизацию ее на модифицированных кремнеземных сорбентах, при этом в процессе порционного связывания инвертазы с сорбентами осуществляют многократную обработку инвертазы глутаровым альдегидом (а.с. СССР N 1564186, М. кл. С12Н 11/00, публ. 1990 г.).
Недостатками известного способа является достаточно трудоемкий процесс в связи с необходимостью осуществления сложной процедуры специальной очистки фермента, а обработка глутаровым альдегидом приводит к резкому снижению активности β-фруктофуранозидазы.
Наиболее близким по технической сущности и достигаемому эффекту является способ получения иммобилизованной инвертазы, включающий автолитическую деструкцию клеток дрожжей, обладающих инвертазной активностью, получение препарата инвертазы и его последующую иммобилизацию на поверхности или в массе твердого или гелеобразного носителя, причем в качестве препарата инвертазы используют изолированные стенки дрожжевых клеток, разрушенных в процессе автолиза [Патент N 2158761 RU Е.М.Рязанов, Д.И.Островский, А.В.Бубнов Способ получения иммобилизованной инвертазы для гидролиза сахарозы].
Недостатком известного способа является сложность осуществления способа, возможность загрязнения целевого продукта (инвертного сахара) ионами металлов и большим количеством балластных веществ, выходящих из иммобилизованным клеток микроорганизмов.
Технической задачей настоящего изобретения является упрощение и повышение эффективности способа получения иммобилизованной β-фруктофуранозидазы при сохранении ее высокой ферментативной активности и обеспечение чистоты целевого продукта.
Техническая задача достигается тем, что способ получения иммобилизованной β-фруктофуранозидазы характеризуется тем, что оживляют чистую культуру Klyuveromyces marxianus Y-303 по методу Коха, затем засевают ее в чашки Петри с 2%-ным сусло-агаром при температуре 48-50°С, чашки переворачивают вверх дном и выдерживают в течение 2-3 суток в термостате при температуре 28-30°С, затем выросшие колонии переносят в чашку Петри с сусло-агаром для наращивания биомассы, после чего дрожжи переносят на скосы с сусло-агаром, далее проводят глубинное культивирование дрожжей Klyuveromyces marxianus Y-303 в колбах емкостью 500 см3, содержащих по 50 см3 питательной среды, в качестве которой используют пивное сусло, в течение 47,5-48,5 ч при температуре 30°С, затем выращенную биомассу дрожжей смешивают с дистиллированной водой в соотношении 1:5 и проводят автолиз при температуре 38-42°С в течение 59,5-60,5 ч, полученную после автолиза ферментсодержащую смесь осаждают этиловым спиртом при рН 5,0 или ацетоном при рН 5,5, затем проводят очистку β-фруктофуранозидазы в 3 стадии: удаляют низкомолекулярные примеси гель-фильтрацией на колонке с сефадексом G-25 (Fine, 1,4×20 см), повышают чистоту ферментного препарата ионообменной хроматографией на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой (0,8×13 см), фракционируют на колонке с сефадексом G-150, после очистки фермента осуществляют концентрирование на мембране Amicon РМ-30 до 5 см3 и направляют на лиофильную сушку при t=-30°С, после чего осуществляют иммобилизацию β-фруктофуранозидазы на полимерном волокнистом сорбенте (анионите) марки ФИБАН® (Беларусь), причем перед процессом иммобилизации сорбент обрабатывают 5%-ной соляной кислотой, дистиллированной водой, 5%-ным раствором едкого натра и снова водой, каждая обработка длится 12 ч, промытый сорбент дополнительно обрабатывают 95%-ным этиловым спиртом и снова водой, далее готовят водный раствор β-фруктофуранозидазы с содержанием 0,018-0,098 моль/дм3 и инкубируют подготовленный сорбент.
Технический результат заключается в упрощении и повышении эффективности способа получения иммобилизованной β-фруктофуранозидазы при сохранении ее высокой ферментативной активности и обеспечении чистоты целевого продукта.
Способ получения иммобилизованной β-фруктофуранозидазы осуществляется следующим образом.
Используемые в работе дрожжи Klyuveromyces marxianus Y-303 хранят в запаянных ампулах. Оживление чистой культуры Klyuveromyces marxianus Y-303 проводят по методу Коха. Культуру дрожжей засевают в чашки Петри с 2%-ным сусло-агаром при температуре 48-50°С, чашки переворачивают вверх дном и выдерживают в течение 2-3 суток в термостате при температуре 28-30°С. Выросшие колонии переносят в чашку Петри с сусло-агаром, по истечении 2-3 суток дрожжи переносят на скосы с сусло-агаром. Далее проводят глубинное культивирование дрожжей Klyuveromyces marxianus Y-303 в колбах емкостью 500 см3 в термостате, содержащих по 50 см3 питательной среды, в качестве которой используют пивное сусло, в течение 47,5-48,5 ч при температуре 30°С. Затем выращенную биомассу дрожжей смешивают с дистиллированной водой в соотношении 1:5 и проводят автолиз при температуре 38-42°С в течение 59,5-60,5 ч. Полученную после автолиза ферментсодержащую смесь осаждают этиловым спиртом при рН 5,0 или ацетоном при рН 5,5, затем проводят очистку β-фруктофуранозидазы в 3 стадии: гель-фильтрация на колонке с сефадексом G-25 (Fine, 1,4×20 см) с целью освобождения от низкомолекулярных примесей, ионообменная хроматография на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой (0,8×13 см) для повышения чистоты ферментного препарата, фракционирование на колонке с сефадексом G-150, после очистки фермента осуществляют концентрирование на мембране Amicon РМ-30 до 5 см3 и направляют на лиофильную сушку при t=-30°С.
Иммобилизацию β-фруктофуранозидазы проводят на полимерном волокнистом сорбенте марки ФИБАН® (Беларусь). Подготовка сорбента проводится в соответствии с ГОСТ 10896-72. Кондиционирование анионита осуществляют обработкой 5%-ной соляной кислотой, дистиллированной водой, 5%-ным раствором едкого натра и снова водой. Каждая обработка длится 12 ч. Каждый реагент берут в 2-кратном избытке по сравнению с содержанием обменных групп в обрабатываемом образце. Кондиционирование проводят на воронке с пористым фильтром. Промытый сорбент с целью очистки дополнительно обрабатывают 95%-ным этиловым спиртом и снова водой. Далее готовят водный раствор β-фруктофуранозидазы с содержанием 0,018-0,098 моль/дм3 и инкубируют подготовленный сорбент.
Способ поясняется следующими примерами.
Пример 1. Культивирование дрожжей Klyuveromyces marxianus Y-303 проводят в чашках Петри с 2%-ным сусло-агаром при температуре 29°С в течение 2 суток, выросшие колонии переносят на скосы с сусло-агаром, после чего проводят глубинное культивирование в колбах емкостью 500 см3 в термостате, содержащих по 50 см3 питательной среды, в качестве которой используют пивное сусло, в течение 48 ч при температуре 30°С. Затем выращенную биомассу дрожжей смешивают с дистиллированной водой в соотношении 1:5 и проводят автолиз при температуре 40°С в течение 60 ч. Полученную после автолиза ферментсодержащую смесь осаждают этиловым спиртом при рН 5,0 или ацетоном при рН 5,5, затем проводят очистку (β-фруктофуранозидазы в 3 стадии: гель-фильтрация на колонке с сефадексом G-25 (Fine, 1,4×20 см), ионообменная хроматография на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой (0,8×13 см), фракционирование на колонке с сефадексом G-150, после очистки фермента осуществляют концентрирование на мембране Amicon РМ-30 до 5 см3 и направляют на лиофильную сушку при t=-30°С.
Готовят водный раствор, содержащий β-фруктофуранозидазу в количестве 0,098 моль/дм3. Раствор пропускают через слой ионообменного волокнистого материала марки ФИБАН® (Беларусь). Подготовка сорбента проводится в соответствии с ГОСТ 10896-72. Кондиционирование анионита осуществляют обработкой 5%-ной соляной кислотой, дистиллированной водой, 5%-ным раствором едкого натра и снова водой. Каждая обработка длится 12 ч. Промытый сорбент с целью очистки дополнительно обрабатывают 95%-ным этиловым спиртом и снова водой.
Далее смолу инкубируют с раствором β-фруктофуранозидазы. Способ осуществим. Результаты осуществления способа приведены в табл.1; результаты сравнения предлагаемого способа и способа-прототипа представлены в табл.2.
Пример 2. Готовят водный раствор, содержащий β-фруктофуранозидазу в количестве 0,044 моль/дм3. Получение ферментного препарата и подготовку ионообменного волокнистого материала марки ФИБАН® проводят по методике, описанной в примере 1. Способ осуществим. Результаты осуществления способа приведены в табл.1.
Пример 3. Готовят водный раствор, содержащий β-фруктофуранозидазу в количестве 0,018 моль/дм3. Получение ферментного препарата и подготовку ионообменного волокнистого материала марки ФИБАН® проводят по методике, описанной в примере 1. Способ осуществим. Результаты осуществления способа приведены в табл.1.
Как видно из примеров, предложенный способ получения иммобилизованной β-фруктофуранозидазы осуществим при культивировании дрожжей Klyuveromyces marxianus Y-303 при температуре 28-30°С в течение 2-3 суток, глубинном культивировании в колбах емкостью 500 см3 в термостате, содержащих по 50 см3 питательной среды, в качестве которой используют пивное сусло, в течение 47,5-48,5 ч при температуре 30°С, проведении автолиза при температуре 38-40°С в течение 59,5-60,5 ч, осаждении ферментсодержащей смеси спиртом при рН 5,0 или ацетоном при рН 5,5 и очистке β-фруктофуранозидазы в 3 стадии: гель-фильтрация на колонке с сефадексом G-25 (Fine, 1,4×20 см), ионообменная хроматография на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой (0,8×13 см), фракционирование на колонке с сефадексом G-150. Как видно из табл.1, предложенный способ иммобилизации осуществим при содержаниях данного фермента в количествах 0,018-0,098 моль/дм3 (способ 1-3), при увеличении концентрации β-фруктофуранозидазы свыше 0,098 моль/дм3 приводит к переходу процесса иммобилизации к фильтрованию ферментного препарата ионообменным волокнистым материалом, снижение концентрации β-фруктофуранозидазы ниже 0,018 моль/дм3 приводит к невозможности определения содержания иммобилизованного фермента.
Предлагаемый способ получения иммобилизованной β-фруктофуранозидазы позволяет:
получить иммобилизованный препарат, отличающийся хорошей операционной стабильностью и активностью,
обеспечить чистоту продукта,
упростить способ иммобилизации β-фруктофуранозидазы,
снизить себестоимость осуществляемого способа.
Таблица 1 | |||
Примеры осуществления способа | |||
Номер примера | Концентрация раствора фермента, моль/дм3 | Содержание иммобилизованного фермента, мг/г | Результат анализа |
1 | 0,098 | 0,025 | Способ осуществим |
2 | 0,057 | 0,0125 | Способ осуществим |
3 | 0,044 | 0,0075 | Способ осуществим |
4 | 0,031 | 0,005 | Способ осуществим |
Claims (1)
- Способ получения иммобилизованной β-фруктофуранозидазы, характеризующийся тем, что оживляют чистую культуру Klyuveromyces marxianus Y-303 по методу Коха, затем засевают ее в чашки Петри с 2%-м сусло-агаром при температуре 48-50°С, чашки переворачивают вверх дном и выдерживают в течение 2-3 суток в термостате при температуре 28-30°С, затем выросшие колонии переносят в чашку Петри с сусло-агаром для наращивания биомассы, после чего дрожжи переносят на скосы с сусло-агаром, далее проводят глубинное культивирование дрожжей Klyuveromyces marxianus Y-303 в колбах емкостью 500 см3, содержащих по 50 см3 питательной среды, в качестве которой используют пивное сусло, в течение 47,5-48,5 ч при температуре 30°С, затем выращенную биомассу дрожжей смешивают с дистиллированной водой в соотношении 1:5 и проводят автолиз при температуре 38-42°С в течение 59,5-60,5 ч, полученную после автолиза ферментсодержащую смесь осаждают этиловым спиртом при рН 5,0 или ацетоном при рН 5,5, затем проводят очистку β-фруктофуранозидазы в 3 стадии: удаляют низкомолекулярные примеси гель-фильтрацией на колонке с сефадексом G-25, повышают чистоту ферментного препарата ионообменной хроматографией на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой, фракционируют на колонке с сефадексом G-150, после очистки фермента осуществляют концентрирование на мембране Amicon РМ-30 до 5 см3 и направляют на лиофильную сушку при t=-30°C, после чего осуществляют иммобилизацию β-фруктофуранозидазы на полимерном волокнистом сорбенте (анионите), причем перед процессом иммобилизации сорбент обрабатывают 5%-ной соляной кислотой, дистиллированной водой, 5%-ным раствором едкого натра и снова водой, каждая обработка длится 12 ч, промытый сорбент дополнительно обрабатывают 95%-ным этиловым спиртом и снова водой, далее готовят водный раствор β-фруктофуранозидазы с содержанием 0,018-0,098 моль/дм3 и инкубируют подготовленный сорбент.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2006141092/13A RU2327738C1 (ru) | 2006-11-20 | 2006-11-20 | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММОБИЛИЗОВАННОЙ β-ФРУКТОФУРАНОЗИДАЗЫ |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2006141092/13A RU2327738C1 (ru) | 2006-11-20 | 2006-11-20 | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММОБИЛИЗОВАННОЙ β-ФРУКТОФУРАНОЗИДАЗЫ |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2327738C1 true RU2327738C1 (ru) | 2008-06-27 |
Family
ID=39680063
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2006141092/13A RU2327738C1 (ru) | 2006-11-20 | 2006-11-20 | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММОБИЛИЗОВАННОЙ β-ФРУКТОФУРАНОЗИДАЗЫ |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2327738C1 (ru) |
-
2006
- 2006-11-20 RU RU2006141092/13A patent/RU2327738C1/ru not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
Анионит волокнистый ФИБАН А-6К. 2006 [найдено 30.07.2007]. Найдено в Интернет: http://belisa.org.by/other/catalog12/projectdt74.html. ФИБАН АК-22. Волокнистый слабоосновный анионит (аминокарбоксильный). [найдено 30.07.2007]. Найдено в Интернет: http://idoch.bas-net.by/AK22_rusI.htm. * |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Hertzberg et al. | Studies of alginate-immobilized marine microalgae | |
CN116731933B (zh) | 一种谷氨酸棒杆菌及其在生产缬氨酸中的应用 | |
US4169761A (en) | Process for the cultivation of viruses | |
CN106754486B (zh) | 一株高产海藻糖合酶的假单胞菌及其发酵产酶方法 | |
RU2327738C1 (ru) | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММОБИЛИЗОВАННОЙ β-ФРУКТОФУРАНОЗИДАЗЫ | |
Roukas | Production of citric acid from beet molasses by immobilized cells of Aspergillus niger | |
Chibata et al. | Immobilized cells: Historical background | |
RU2397247C1 (ru) | Способ биосинтеза липазы | |
RU2085212C1 (ru) | Способ изготовления единого бруцеллезного антигена для ра, рск и рдск | |
JP3220839B2 (ja) | 酵母プロトプラストによる細胞表層物質の生産方法 | |
RU2101354C1 (ru) | Способ получения нуклеиновых кислот bacillus anthracis | |
RU2092552C1 (ru) | Способ приготовления плотной питательной среды для выращивания микроорганизмов | |
Karube et al. | Bacteriolysis by immobilized enzymes | |
SU675986A1 (ru) | Штамм SтарнуLососсUS SарRорнутIсUSн 1-продуцент уреазы | |
JP2717225B2 (ja) | セルラーゼによる酢酸増収法 | |
JP3057219B2 (ja) | セルラーゼの固定化方法 | |
RU2340356C2 (ru) | Способ получения сибиреязвенного протективного антигена | |
JPH0998779A (ja) | トレハロース合成酵素、その製法及びそれを用いたトレハロースの製造法 | |
RU2230119C1 (ru) | Способ получения дисахарида | |
JP2524287B2 (ja) | 微生物固定化担体の再生方法 | |
RU2627182C1 (ru) | Штамм Aneurinibacillus migulanus и его применение для получения грамицидина С | |
RU2233882C2 (ru) | Способ получения лимонной кислоты | |
SU1270172A1 (ru) | Штамм @ @ @ продуцент уреазы | |
JPH0468912B2 (ru) | ||
CN115678788A (zh) | 一种生物法生产高含量天然小分子rna的方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20081121 |