JP3220839B2 - 酵母プロトプラストによる細胞表層物質の生産方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は酵母の細胞壁を除去して
得られたプロトプラストを必要に応じゲル包括法により
固定化した後、又は酵母をゲル包括法で固定化し、固定
化酵母をプロトプラスト化した後、培養溶液中で培養す
ることにより、該培養溶液中に細胞表層物質を連続的に
産出させる効率的な生産方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】微生物による有用物質生産方法におい
て、細胞壁がその生産物の分泌阻害物になるような場
合、細胞壁を取り除いたプロトプラストを利用すること
は、細胞外への効率的な種々の物質生産が期待され個々
の試みがなされている。細胞培養法を応用し特定の物質
生産能を有する微生物菌体又はプロトプラストを固定化
して、連続的且つ効率的な生産方法が知らされている。
例えばグルタミン酸生産能を有する微生物ブレビバクテ
リウム・フラブスの生細胞をプロトプラスト化した後、
アセチルセルロース及び寒天を用いて固定し、該固定化
プロトプラストと反応液を接触させて該グルタミン酸の
生成蓄積せしめ、これを採取するアミノ酸生産方法に関
する研究（特開昭５７ー１４４９８９公報）、実用化が
行われてきた。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら細胞表層
物質を含む菌体内蓄積物質を恒常的に量産するには、ま
だいくつかの問題点が残されている。すなわち、固定化
酵素あるいは固定化微生物を利用する生産技術の開発を
目的とした研究は非常に多いが、大量製造技術を目的と
する開発は少ない。又プロトプラストは、培養溶液、反
応溶液の浸透圧等の外部環境の変化や攪拌などの物理的
ストレスに弱いため長時間培養し、物質生産を効率的且
つ連続的に行うことが困難であるという問題点があるば
かりか、固定化プロトプラストを用いた細胞壁あるい
は、ペリプラズムに局在するインベルターゼ等を含む高
分子物質の簡便且つ連続生産は皆無である。

【０００４】本発明はこれらの問題点を改良し、固定化
プロトプラストの高密度、大量培養且つ長時間培養によ
る酵素蛋白等の大量製造を可能とする細胞表層物質の生
産技術を提供することを目的とする。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明は上記従来の問題
点を解決することを目的とするものであり、細胞表層物
質生産技術の工業的に有利な方法を開発すべく種々検討
の結果、本発明を完成するに至ったものである。すなわ
ち、本発明は酵母の細胞壁を除去して得られたスフェロ
プラスト細胞を含むプロトプラスト細胞（以降プロトプ
ラストと称す。）を必要に応じて包括法により固定化
し、又はその逆の手順により酵母を固定化した後プロト
プラスト化する。この様にして、得られたプロトプラス
トを細胞壁合成阻害剤を添加した培養溶液中で培養し、
その培養溶液中に細胞表層物質を生産蓄積せしめること
を特徴とするプロトプラストによる細胞表層物質の生産
方法に関する。

【０００６】酵母の細胞壁を除去して得られたプロトプ
ラストは、極短期間において細胞表層である細胞壁ある
いは、ペリプラズム（細胞膜と細胞壁の間）に本来局在
している酵素蛋白、脂質及び多糖類を培養溶液中に生産
されることは知られている。すなわちプロトプラストを
用いるため、細胞壁構成成分である多糖類、脂質は合成
されるが細胞表層へのアセンブリーが阻害されるため培
養溶液中に分泌、濾洩される。又細胞表層に局在してい
る酵素蛋白としてインベルターゼ、酸性ホスファター
ゼ、Ｌ−アスパラギナーゼ、グルカナーゼ、α−ガラク
トシダーゼ、アミノペプチダーゼ、アリル−β−グルコ
シダーゼ、プロテインジスルフィドリダクターゼ、エン
ドキチナーゼ等が知られている。これら酵素蛋白のう
ち、ペリプラズムに局在しているとされているインベル
ターゼ、酸性ホスファターゼは、８量体を形成し、さら
には酵母特有の高分子量の糖鎖が付加されるため本来の
蛋白質部分の１６倍以上の分子量を持つことから、細胞
壁を通過できずペリプラズムに蓄積され一部が培養溶液
中に濾洩するが、この濾洩酵素蛋白は小分子化された２
量体のみであるとされている。通常の増殖酵母を用いて
の、これらペリプラズム局在酵素蛋白生産方法では、高
分子物質の菌体外への濾洩は細胞壁が障壁となるため培
養溶液中には極微量でしかなく、又ペリプラズムの細胞
当りの容積が限られているため局在する酵素蛋白の総量
が限られる。又上記酵素蛋白中インベルターゼ、酸性ホ
スファターゼ以外は、細胞壁に局在しているとされ、こ
れらのうちいくつかは細胞壁に非常に強固に結合してい
るため、一般的に自己消化、ザイモリエース等の溶菌酵
素による細胞壁の分解、強アルカリ処理等によってしか
通常の増殖細胞の細胞壁より分離することができない。
これらの処理は通常の蛋白の分離方法とは異なり過激な
方法であり、分離過程での酵素活性の維持が困難であ
る。しかし、プロトプラストを用いる本方法により、上
記酵素蛋白の大量生産、分離操作過程中の酵素蛋白活性
維持が可能となる。すなわち分泌の障壁となり、蓄積を
限定する細胞壁の除去によりペリプラズム局在物質の蓄
積場所を制限のない細胞外培養溶液とし、大量生産を可
能にせしめ、さらには細胞壁局在物質の局在場所である
細胞壁を除去しているため、該細胞表層物質は培養溶液
中に濾洩するため、特殊な分離方法を用いずに容易にし
かも活性を維持したまま分離することが可能となる。

【０００７】本発明に係る細胞表層物質を生産する酵母
については、Ｓａｃｃａｈａｒｏｍｙｃｅｓ属であり、
パン用酵母、ワイン用酵母、ビール酵母、酒用酵母等が
任意に用いられる。

【０００８】本発明に係る細胞表層物質とは細胞壁にあ
るいは、細胞壁と細胞膜の間に存在するいわゆるペリプ
ラズム部分に存在する物質である。この細胞表層には例
えばインベルターゼ、酸性ホスファターゼ、Ｌ−アスパ
ラギナーゼ、グルカナーゼ、アミノペプチダーゼ、アリ
ル−β−グルコシダーゼ、プロテインジスルフィドリダ
クターゼ、エンドキチナーゼ、グルカナーゼ、α−ガラ
クトシダーゼ等の有用な酵素蛋白群が、多糖類としてグ
ルカン、マンナン等が、他にキチン質、脂質類等が局在
しており、これを効率的に産出することが望まれる。例
えば酵素蛋白群の一つであるインベルターゼは一般に食
品分野、化学分野で主に使用され、スクロース及びその
他のβ−Ｄ−フルクトフラノシドを加水分解して、スク
ロースをα−Ｄ−グルコースとβ−Ｄ−フルクトース
に、β−Ｄ−フルクトフラノシドを遊離β−Ｄ−フルク
トースに変換する。また酵母、糸状菌、細菌、植物等の
細胞中に広く存在ている。

【０００９】本発明に係る酵母の細胞壁を除去してプロ
トプラスト化する方法は公知の情報に従えばよく、例を
挙げるなら酵母を高張力の希釈液に懸濁した後、溶菌酵
素であるグルスラーゼ又はザイモリエース等を添加して
反応させ、プロトプラスト化の進行を顕微鏡で確認す
る。

【００１０】このようにして得られたプロトプラスト
を、一旦遠心分離等によって集めた後、緩衝液に懸濁し
必用に応じ固定化する。該固定化方法は本発明の特徴で
ある細胞表層物質中でインベルターゼ等の高分子物質の
生産に適した固定化用ゲルの検索・研究の結果、Ｌ−グ
ルロン酸ブロックの割合の高いアルギン酸ゲルを低濃度
で用いることにより高分子物質のゲル内透過及び培地へ
の生産が可能となった。又、インベルターゼ等の高分子
物質ではな〈、比較的低分子の物質の生産を目的とする
場合には、常法により活性のあるプロトプラストをＰＶ
Ｃ片、多孔性ガラスビーズ等を用いる担体結合法、又は
アルギン酸カルシウム、ｋ−カラギーナン等を用いる操
作の包括法等により保持固定化する。すなわち連続的に
細胞表層物質を生産する工程を担う操作で工業的に耐え
得れば良く任意に用いることが可能である。

【００１１】又上記方法の酵母を溶菌酵素を用いてプロ
トプラスト化した後、ゲル包括法等により固定化して細
胞表層物質の生産も可能であるが、固定化への操作中に
おいてプロトプラストへの浸透圧、温度による外部環境
からのストレスにより細胞の破壊、生理活性の失活の恐
れがある。それらストレス、ダメージの問題なく安定に
固定化プロトプラストの作成を行う必要性がある。そこ
で、本発明では懸濁酵母をアルギン酸ナトリウム又はｋ
−カラギーナンにより先ず固定化した後、プロトプラス
ト化する方法が望ましい。

【００１２】次に、本発明では上記方法で得られたプロ
トプラストを、浸透圧調整物質として例えばマンニトー
ル、ソルビトール又は塩化カリウムを最終溶液濃度０．
６〜１．２Ｍの量で又、細胞壁合成阻害剤として抗生物
質が挙げられるが、細胞壁合成を阻害し、細胞表層物質
のアセンブリー又は局在化を妨げるのみで他の生合成系
を阻害しない物質であれば良く、例えばａｃｕｌｅａｃ
ｉｎＡ、ｐａｐｕｌａｃａｎｄｉｎＢ、ｅｃｈｉｎｏｅ
ａｎｄｉｎＢが挙げられ任意の物質を添加した培養溶液
にて培養して細胞表層蛋白を生産しこれを採取する。培
養方法は静置にて行うことも可能であるが、本発明の特
徴である固定化プロトプラストを用いることにより、特
にプロトプラストで困難であった通気攪拌培養を行うこ
とで静置培養に比べ酸素の供給量及び培地からの栄養物
質の取り込み量が上昇し細胞表層物質の生産が活性化す
る。又通常の培養操作において培養溶液中に、簡便に効
率的に且つ連続的にインベルターゼを含む細胞表層物質
を生産、蓄積せしめ得る。

【００１３】培地中に蓄積せしめた細胞表層物質の分離
精製方法は、常法により例えばカラム精製方法に従えば
良く、酵素蛋白の分子種が少数なので簡便に使用でき
る。

【００１４】以下、本発明の実施例を示すが、それによ
って本発明が限定されるものではない。

【００１５】

【実施例１】（１）菌体の調整 酒用酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓ
ｉａｅ ＩＦＯ ０３０９株を、ＹＰＤ培地（イースト
エキス１．０％、ポリペプトン２．０％、グルコース
２．０％）を用いて以下の培養条件で培養した。

【００１６】（培養条件） i）三角フラスコ（５００ｍｌ容）に培地２００ｍｌで
培養 ii）培養温度：２７〜３２℃ 好適温度３０℃ iii）攪拌速度：回転振盪機で８０〜１３０回転／分、
好適値１２０回転／分 iv）培養時間：１７時間

【００１７】（２）プロトプラスト作成条件 培養終了後、培養溶液を７０００ｇで１０分間遠心分離
して集菌した。その菌体を、０．９Ｍマンニトールを含
む０．０６７Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）で２回洗浄
した。０．９Ｍマンニトールを含む０．０６７Ｍリン酸
緩衝液（ｐＨ７．５）でＯ．Ｄ．（６６０ｎｍ）が０．
５になるように酵母懸濁溶液を調製した。次に溶菌酵素
のザイモリエース２０Ｔ（最終溶液濃度３ｕｎｉｔ／ｍ
ｌ）と２−メルカプトエタノール（最終溶液濃度１００
ｍＭ）を加え、３０℃で９０分間ゆっくりと振盪しなが
ら反応した。次に反応溶液を遠心分離（４５０ｇ，１５
ｍｉｎ）して集菌した。プロトプラストを１．０Ｍマン
ニトール溶液にて２回洗浄後、同溶液に懸濁した。

【００１８】（３）滅菌済み培養溶液（イーストエキス
１．０％、ポリペプトン２．０％、グルコース０．１
％、マンニトール０．８５Ｍ（プロトプラストの培養溶
液のみに添加）、ｐＨ５．７）を用いて２００ｍｌの入
った５００ｍｌ容三角フラスコを２個用意し、各々に上
記方法で調整したプロトプラストと未処理の懸濁酵母を
各々５．１×１０⁸細胞量植菌した。該懸濁酵母とプロ
トプラストを各々３０℃で２４時間静置培養した。培養
に当りいずれもインベルターゼ生成抑制のかからない程
度にグルコースを低く維持するよう６時間おきに最終溶
液濃度１ｇ／Ｌ以下の量を添加した。

【００１９】（４）細胞表層物質の分離 各々培養後の培養溶液中の細胞表層物質の分離は、遠心
分離装置を用いてプロトプラスト、懸濁酵母とを除いた
細胞表層物質を含む培養溶液として分離した。

【００２０】細胞表層物質の生産量の指標として、イン
ベルターゼ活性を用いて評価することとした。菌体内イ
ンベルターゼ活性は、懸濁細胞についてはザイモリエー
ス２０Ｔを用いた上記（２）の手順によりプロトプラス
トを作成した。該プロトプラストと、培養に用いたプロ
トプラストとを各々ソニックにて菌体破壊を行った後、
遠心分離し上澄みの溶液を下記インベルターゼ活性測定
方法により測定した。

【００２１】（５）インベルターゼ測定方法 測定方法は以後断わらない限り本方法で行った。Ｇｏｌ
ｄｓｔｅｉｎ，Ａ．，Ｌａｍｐｅｎ，Ｊ，Ｏ．Ｍｅｔ
ｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．４２：５０４−５１１（１９７
５）の文献の方法に準じて行った。０．５Ｍシュークロ
ース溶液２５μｌ、０．２Ｍ酢酸ナトリウム緩衝溶液
（ｐＨ４．９）５０μｌ、酵素溶液２０μｌ、を３０℃
で１０分間反応した。０．５Ｍリン酸緩衝溶液（ｐＨ
７．０）を加え、沸騰湯浴中で３分間加熱し酵素反応を
停止した後、室温まで冷却する。測定試薬グルコースＣ
ＩＩ−テストワコー（和光純薬製）により遊離したグル
コース量を定量する。

【００２２】コントロールとして上記の酵素溶液を蒸留
水と置き換えたものと、シュークロース溶液を蒸留水と
置き換えたものを用いた。

【００２３】１ｕｎｉｔは上記の反応条件で、シューク
ロースから１分間に１μｍｏｌのグルコースを遊離する
酵素の量と定義した。

【００２４】第１図（イ）及び（ロ）は、懸濁酵母
（イ）とプロトプラスト（ロ）を各々固定化せず静置培
養し、培養経時変化における細胞量及び培地中のインベ
ルターゼ生成量の差異を示す。

【００２５】第１図（イ）及び（ロ）で明確な通り、
（ロ）のプロトプラストは増殖を見せないにも関わらず
培養溶液中のインベルターゼ活性は培養終了２４時間目
で約３倍の又培養中も明らかな差異を示した。

【００２６】

【表１】

【００２７】又、上記第１表は培養終了後における各々
細胞内外のインベルターゼ比活性を示す。培養条件は図
１とほぼ同様であるが、グルコースの添加を４時間毎に
行った。

【００２８】第１表によりインベルターゼ比活性は細胞
外量で約５０倍、総生産量で約１０倍と多い。この事に
より、菌体内蓄積物の細胞表層物質生産方法について、
本発明のプロトプラストの使用が優れていることが確認
された。

【００２９】

【実施例２】 （６）固定化 次にプロトプラストをゲル包括法により固定化し培養し
た。実施例１の条件にて調整した１．０Ｍマンニトール
に懸濁したプロトプラストを１．０Ｍマンニトールを含
む１％アルギン酸ナトリウム溶液に適量加え、緩やかに
攪拌した。次に該溶液をペリスタポンプにより０．８Ｍ
マンニトールを含む０．１Ｍ塩化カルシウム溶液に滴下
してゲル化させた後、１時間放置しゲルを硬化した。該
固定化プロトプラストを培養溶液にて１回洗浄した。

【００３０】（７）固定化後の培養方法 上記方法にて得られた固定化プロトプラスト（５．１×
１０⁸細胞量）を滅菌済み２００ｍｌ培養溶液（実施例
１（３）の培地組成）の入った５００ｍｌ容の三角フラ
スコに植菌し、３０℃で２４時間振盪培養を行った。イ
ンベルターゼ生成抑制のかからない程度にグルコースを
低く維持するよう３時間おきに最終溶液濃度１ｇ／Ｌを
添加した。培養経時変化を測定するため培養溶液を取り
出して生成したインベルターゼ活性を測定した。

【００３１】固定化したプロトプラストによるインベル
ターゼの生産量を第２図に示す。

【００３２】プロトプラストの植菌濃度の違いによるイ
ンベルターゼ生産量の差異を第３図に示す。

【００３３】

【実施例３】 （８）長時間培養法 上記実施例１及び２の方法にて得られた固定化プロトプ
ラスト（５．５×１０ ⁸細胞量）を、実施例１（３）の
培地組成にアクレアシンＡを最終溶液濃度０．５μｇ／
Ｌになるよう添加した滅菌済み２００ｍｌ培養溶液の入
った５００ｍｌ容の三角フラスコに植菌した。インベル
ターゼ生成抑制のかからない程度にグルコースを低く維
持するよう４時間おきに又３６時間以降は６時間おきに
最終溶液濃度１ｇ／Ｌを添加した。更に細胞壁合成阻害
剤（アクレアシンＡ）を反応開始２４時間毎に最終溶液
濃度が０．５μｇ／Ｌになるよう添加し、３０℃で５４
時間振盪培養した。培養経時変化を測定するため培養溶
液を取り出して生成したインベルターゼ活性を測定し
た。

【００３４】長時間培養によるインベルターゼ生産量の
傾向を第４図に示す。培養時間経過に伴いインベルター
ゼは直線的に生産され、更に細胞壁合成阻害酵素を添加
することにより長時間培養に堪えうることが確認され
た。

【００３５】

【実施例４】上記実施例１方法にて得られたプロトプラ
ストと懸濁酵母（５．０×１０⁸細胞量）を滅菌済み２
００ｍｌ培養溶液（実施例１（３）の培地組成）の入っ
た５００ｍｌ容の三角フラスコを２個用意し各々植菌し
た。インベルターゼ生成抑制のかからない程度にグルコ
ースを低く維持するよう４時間おきに最終溶液濃度１ｇ
／Ｌを添加した。３０℃で２４時間振盪培養した。培養
終了後、培養溶液を取り出して各酵素蛋白活性を測定し
た。

【００３６】（９）酸性フォスファターゼ測定方法 Ｔｏｈ−ｅらの方法に準じて行った。適当量の酵母培養
溶液を遠心分離（３０００ｒｐｍ，５分間；久保田Ｍｏ
ｄｅｌ ＫＮ−８０）して菌体を除き、無菌水で一度洗
浄後、培養溶液を適当量の無菌水に懸濁して酵素溶液と
した。１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）０．０５ｍｌ、無
菌水０．５５ｍｌ、ｐ−ニトロフェニルリン酸ナトリウ
ム液（３．２ｍｇ／ｍｌ）０．２ｍｌ、酵素溶液０．２
ｍｌを混合し、３５℃で１０分間反応させた。１０％Ｔ
ＣＡを１ｍｌ加えて反応を停止させた後、飽和炭酸ナト
リウム（２０ｇ／７０ｍｌ）２ｍｌ加えて良く混合し、
遠心分離（３０００ｒｐｍ，５分間）し、上清溶液のＡ
₄₂₀値を測定した。１分間に１μｍｏｌのｐ−ニトロフ
ェノールを遊離させる酵素量を１ｕｎｉｔとし、ｐ−ニ
トロフェノールのモル吸光係数を１．６×１０^-2として
計算した。

【００３７】

【表２】

【００３８】第２表は培養終了後における培養溶液中の
細胞表層物質の一部の酵素蛋白活性を測定した結果を示
す。

【００３９】プロトプラストにより酸性フォスファター
ゼの培養溶液中への生産は、懸濁酵母と比較し約１４倍
の差異があり、インベルターゼだけでなく本方法を用い
ることにより簡便に培養溶液中への生産が可能であるこ
とが確認された。

【００４０】

【実施例５】パン酵母（オリエンタル酵母工業株式会社
製）を用い、実施例１の（２）〜（５）に準じ細胞表層
物質の生産を行ったところ、第５図に示す通り培養溶液
中に多量のインベルターゼの産出が確認された。

【００４１】

【発明の効果】以上説明したように特定の菌株に限定す
ることなく、固定化プロトプラストを培養することによ
り、本来ストレス、物理的刺激に弱いはずのプロトプラ
ストから、細胞表層物質を培養溶液中へ連続的に且つ効
率的に生産することを可能とした。

【図面の簡単な説明】

【図１】第１図（イ）は懸濁酵母細胞の静置培養におけ
る培養溶液中のインベルターゼ活性と該酵母の増殖関係
を示し、（ロ）はプロトプラストの静置培養における培
養溶液中のインベルターゼ活性と該細胞の増殖関係を示
す。

【図２】固定化プロトプラストの振盪培養による培養溶
液中のインベルターゼ活性を示す。

【図３】固定化プロトプラストの振盪培養による培養溶
液中のインベルターゼ生産におよぼす植菌濃度の影響を
示す。

【図４】固定化プロトプラストの長時間培養によるイン
ベルターゼ生産を示す。

【図５】パン酵母プロトプラストの静置培養における培
養溶液中のインベルターゼ活性を示す。 整理番号ＯＹＣ０２０

【表１】 第１表 懸濁細胞及びプロトプラストの 静置培養におけるインベルターゼ比活性 ────────────────────────────────── インベルターゼ比活性 （units / cell） ───────────────────────── 所在 懸濁細胞 プロトプラスト ────────────────────────────────── 細胞外 3.37×10^-8 1.51×10^-6 細胞内 1.30×10^-7 7.77×10^-8 合計 1.34×10^-7 1.59×10^-6 ──────────────────────────────────

【表２】 第２表 懸濁細胞及びプロトプラストの 静置培養における酵素蛋白の比活性 ──────────────────────────────────── 酵素蛋白 懸濁細胞 プロトプラスト ──────────────────────────────────── 蛋白濃度（mg/cell） 4.7×10^-11 1.3×10^-9 インベルターゼ（unit/cell） 2.5×10^-10 8.9×10^-9 酸性フォスファターゼ（unit/cell） 3.7×10^-9 5.2×10^-8 ────────────────────────────────────

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 1/16 (Ｃ１２Ｎ 1/16 Ｃ１２Ｒ 1:85） Ｃ１２Ｒ 1:85） (56)参考文献 特開 昭57−144989（ＪＰ，Ａ) 特開 昭61−104781（ＪＰ，Ａ) 特開 昭62−181775（ＪＰ，Ａ) 特開 平５−68554（ＪＰ，Ａ) Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ. （1987），Ｖｏｌ．133，ｐｐ．2315− 2325 Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ. （1986），Ｖｏｌ．146，Ｎｏ．３，ｐ ｐ．214−220 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 1/00 - 15/90 ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ)

Claims (4)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 Saccharomyces属の酵母の細胞壁を除去
   して得られたプロトプラストを、アルギン酸ナトリウム
   を低濃度で用いた包括法により固定化した後、得られた
   固定化プロトプラストを細胞壁合成阻害剤を添加した培
   養溶液中で培養し、培養溶液中に細胞表層物質である酵
   素蛋白を産出することを特徴とする酵母細胞表層物質の
   生産方法。
2. 【請求項２】 Saccharomyces属の酵母をアルギン酸ナ
   トリウムを低濃度で用いて包括法で固定化した後、該固
   定化酵母の細胞壁を除去して得られた固定化プロトプラ
   ストを、細胞壁合成阻害剤を添加した培養溶液中で培養
   し、培養溶液中に細胞表層物質である酵素蛋白を産出す
   ることを特徴とする酵母細胞表層物質の生産方法。
3. 【請求項３】 前記細胞壁合成阻害剤がaculeacinA，pa
   pulacandinB，echinoeandinBの１種又は２種以上である
   ことを特徴とする請求項１〜２に記載の酵母細胞表層物
   質の生産方法。
4. 【請求項４】 前記酵素蛋白がインベルターゼ又は酸性
   フォスファターゼであることを特徴とする請求項１〜３
   のいずれかに記載の酵母細胞表層物質の生産方法。