JPS6250114B2

JPS6250114B2 -

Info

Publication number: JPS6250114B2
Application number: JP3439283A
Authority: JP
Inventors: Yoichi Mikami; Nobuaki Hori; Masao Karube
Original assignee: Japan Tobacco Inc
Current assignee: Japan Tobacco Inc
Priority date: 1983-03-04
Filing date: 1983-03-04
Publication date: 1987-10-22
Also published as: JPS59159782A

Description

【発明の詳細な説明】

（産業上の利用分野）本発明はオキソホロンを不斉還元して光学活性
なジヒドロオキソホロンを生成する機能を有する
好熱性菌の固定化菌体を使用したジヒドロオキソ
ホロンの製造法に関する。なお本発明においてオ
キソホロンとは構造式で示される化合物（３・
５・５−トリメチル−２−シクロヘキセン−１・
４−ジオン）であり、ジヒドロオキソホロンとは
構造式で示される化合物（〔6R〕−２・２・６
−トリメチル−１・４−シクロヘキサジオン）で
ある。

【式】

【式】また、好熱性菌とはサーモモノスポラ属に属す
る菌で50℃以上を生育適温とする、サーモモノス
ポラ・クルバータ（Thermomonospora
curvata）IFO12384及びサーモモノスポラ・フス
カ（Thermomonospora fusca）ATCC27730を指
す。なおIFOは日本微生物株保存連盟に属する機
関で財団法人・発酵研究所であり、ATCCはアメ
リカン・タイプカルチヤー・コレクシヨンであ
る。光学活性を有するジヒドロオキソホロンは葉た
ばこ等に含まれる香気成分の一つであり（タバ
コ・サイエンス、16巻、107頁。1972年など）香
料としての利用が考えられるほか、キサントフイ
ルの化学的合成の出発原料となる重要な物質であ
る（ヘルベテイカ・ケミカ・アクタ、59巻、1832
頁、1976年）。（従来の技術）従来、光学活性を有するジヒドロオキソホロン
の製造方法に関しては、オキソホロンをパン酵母
によつて微生物変換するパルタ・ボグトの方法が
知られている（特開昭51−82789号）。しかし、この方法は製造効率が低いことから、
本発明者らは好熱性菌の特異な物質変換能力とそ
れが高温条件下で変換を行なう場合の利点に着目
し、広汎なスクリーニングを行なつた結果、短時
間にオキソホロンを変換し、高収率で光学活性な
ジヒドロオキソホロンを生成する前記のサーモモ
ノスポラ属の菌株を見出し既に特許出願を行なつ
た（特願昭57−155953号（特開昭59−45893号公
報））。しかしながら、好熱性菌は一般に生育が早い反
面、溶菌も早く、菌体を再使用できないものが多
いく、本発明に用いた菌もこの欠点を免がれるこ
とはできなかつた。そこで、本発明者らは、従来
ほとんど知られていない好熱性菌の溶菌を防止
し、安定に連続的に再使用できる固定化菌体を製
造する方法について、前記の好熱性菌を用いて
種々研究を重ねた結果、オキソホロンを変換しジ
ヒドロオキソホロンを生成する機能を有する菌体
とアルギン酸を含有する水溶液をカルシウムイオ
ンを含有する水溶液とある種の条件下で培地に接
種させることにより、50℃以上の高温にも耐えう
る固定化菌体が得られることを発見し、別途特許
出願を行なつた。（発明が解決しようとする問題点）このアルギン酸を用いる固定化方法は、固定化
菌体の活性が高く、すぐれた方法と言えるが、ア
ルギン酸がカルシウム塩として存在する割合が少
なくなると強度が弱くなる欠点があり、カルシウ
ムイオン水中での再生がしばしば必要であるこ
と、又ある一定値以上の機械的強度を有する固定
化菌体が得られず反覆使用が困難である等の欠点
もあつたので、合成ポリマーを用いる固定化法に
関して幅広く検討を行なつた。その結果、オキソホロンを変換し光学活性なジ
ヒドロオキソホロンを生成する機能を有する好熱
性菌体とアクリルアミドモノマーとしてアクリル
アミド及びＮ・N′−メチレンビスアクリルアミ
ドを含む生理食塩水を混合し、Ｎ・Ｎ・N′・
N′−テトラメチルエチレンジアミン及び過硫酸
塩等を重合開始剤として上記アクリルアミドモノ
マーを重合させて菌体を固定化することにより、
50℃以上の高温にも耐えて長期間にわたり変換活
性を有する固定化菌体が得られることを発見し、
本発明を完成するに至つた。すなわち、本発明は、オキソホロンを変換し光
学活性なジヒドロオキソホロンを生成する機能を
有する好熱性菌体の固定化菌体を用いてオキソホ
ロンから光学活性なジヒドロオキソホロンを製造
する方法において、高い変換活性が得られる50℃
以上の高温にも耐え、強度が大で長期間にわたり
変換活性を持続させることにより反覆使用を可能
とし、効率よくオキソホロンから光学活性なジヒ
ドロオキソホロンを製造する方法を提供すること
を目的とする。（問題点を解決するための手段）すなわち、本発明はオキソホロンを不斉還元し
て光学活性なジヒドロオキソホロンを生成する機
能を有する好熱性菌とアクリルアミド及びＮ・
N′−メチレンビスアクリルアミドからなるアク
リルアミドモノマーの混合液を重合開始剤の存在
下で重合させて得た固定化菌体をオキソホロンを
含む培地で培養することを特徴とするジヒドロオ
キソホロンの製造法である。以上の本発明の製造法は、大別して使用に供さ
れる固定化菌体の製造法と、得られた固定化菌体
を用いてオキソホロンを変換し、光学活性なジヒ
ドロオキソホロンを製造する方法とから構成され
る。つぎに本発明の製造法を順を追つて説明する。まず、本発明に使用される固定化菌体の製造に
ついて説明する。変換活性の高い固定化好熱性菌を得るために
は、十分な種菌の管理及び適当な培地の栄養条件
並びに培養方法により調製された湿菌体が必要で
ある。すなわち、菌の胞子を以下の様な方法で培
養して種菌とする。固形培地に46〜47℃で静置培養し、十分胞子を
形成させる。通常、接種後４日日目項より菌叢上
一面に胞子の形成が認められる。一般には、培養
６〜８日目の胞子が望ましい。この種菌をさらに液体培地に接種し、48〜53℃
望ましくは50〜52℃で振とうまたは通気かく拌培
養を行なう。これらの培養に用いる固形及び液体培地は肝臓
浸出液を含む培地が望ましい。一般に好熱性菌は
栄養要求性が厳しく培養困難なものが多いとされ
るが、本菌も例外ではない。本発明者らは、種々
検討の結果、豚等の肝臓浸出液を用いる場合に、
菌が極めて良好な生育を示すことを見出した。こ
れらの培地は121℃に加熱して無菌化した後使用
する。次に対数増殖期の初期にオキソホロンを添加
し、上記の温度でひき続き振とうまたは通気かく
拌培養を行ない十分にオキソホロン変換酵素を誘
導させる。通常、オキソホロン添加14〜16時間後
に遠心分離器を用いて集菌し、湿菌体を得る。この湿菌体に生理食塩水を加えて５〜30
（wt／vol）％、望ましくは10％程度の懸濁液を作
り、これに固定化剤であるアクリルアミドモノマ
ー溶液（アクリルアミド90〜98％、望ましくは96
％程度とＮ・N′−メチレンビスアクリルアミド
２〜10％、望ましくは４％を含む生理食塩水溶
液）及び重合開始剤として、Ｎ・Ｎ・N′・N′−
テトラメチルエチレンジアミンを0.2〜0.3％、望
ましくはこれを0.23％程度含む生理食塩水溶液
と、過硫酸カリウムを0.2〜0.3％、望ましくは
0.28％含む生理食塩水溶液をそれぞれ溶液中の酸
素を窒素で充分に置換した後、それぞれの溶液を
上記の順に３：１：２（vol）程度の割合で十分
に混合する。この混合の間も窒素を通気し、酸素
との接触を防ぐことが大切である。なお温度は室
温かそれ以下が望ましい。混合後、数分程で強固
なゲルが得られるので、これをメツシユを用いて
１〜２mmの立方体に成形し、固定化菌体とする。通常、中温菌を合成高分子で固定化すると重合
開始剤等の影響により、その酵素活性を著しく減
少する。しかし、一般に高温菌は薬品に対する障
害に強いといわれており、本高温菌に関しても重
合開始剤やアクリルアミドモノマーによる障害は
あらわれず、固定化の収率（残存活性、固定化前
の菌体単位重量当りの変換比活性）は45〜90％と
高い。又、このようにして得られる固定化菌体は弾力
性に豊み、耐熱性にすぐれ50〜60℃で連続的に使
用しても少なくとも15回（30日）以上は安定に使
用できる。なお、重合開始剤としてのＮ・Ｎ・
Ｎ・N′−テトラメチルエチレンジアミンの代り
にリボフラビンとβ−ジメチルアミノプロピオニ
トリル等を用いてもほぼ同様の結果が得られる。固定化の条件として重要な要因にゲル中の菌体
濃度がある。本固定化法により菌体を固定化した
場合、菌体濃度の増加とともに再使用１回目の活
性は上昇するが、菌体湿重量とゲル重量の比が
0.10以上では比活性はあまり上昇せず、0.15で頭
うちとなる。さらに２回目以降の再使用では0.12
以上はほとんど一定となる。このことより、上記
の培地（肝浸出液）内で存在できる菌体量は再使
用条件が一定な場合は一定値に保たれることが分
る。従つて、最適菌体濃度はゲル100ｇ当り湿菌
重で10〜15ｇ程度である。次に、この固定化菌体を用いてオキソホロンの
変換を行なわせる。この場合使用される培地とし
ては一定濃度の肝臓浸出液をPH6.5〜8.0に調整し
て用いるのが適当である。この培地を使用した場
合には菌体は最初固定化された以上に増殖するこ
とがなく、活性を一定値以上に保持したまま再利
用することが可能となる。増殖が活ぱつに行なわ
れる培地を用いた場合には固定化菌体の形状が崩
れやすくなることがあり、またゲルより漏出する
菌が増殖して生成物の抽出及び単離が困難になる
ことから、本発明者らは培地の栄養分と活性の維
持との関係について鋭意検討し、上記の栄養源を
見出したものである。次いで上記の培地に固定化菌体とオキソホロン
を混合し、45〜53℃望ましくは50〜51℃で振とう
培養を行なう。14〜25時間培養を継続するとオキ
ソホロン変換反応が行なわれて光学活性を有する
ジヒドロオキソホロンが生成する。生成したジヒドロオキソホロンはろ過により固
定化菌体を分離し、培養液を塩酸でPH3.0〜3.5に
調整した後、酢酸エチル等で抽出して得ることが
できる。又、分離した固定化個菌体は、そのまま
反覆使用に供することができる。（実施例）以下、実施例にて本発明を具体的に説明する。実施例１まず、次の方法で固定化菌体を調整した。すなわち、水道水１に豚肝浸出液150ml（豚
肝湿重25ｇに相当）、酵母エキス５ｇ、トリプト
ン10ｇ、グルコース３ｇ、グリセロール18.9ｇ、
塩化ナトリウム３ｇを含む培地（１）を３容
三角フラスコに入れ、PHを7.0に調製した後、121
℃で15分間滅菌した。この培地にサーモモノスポ
ラ・クルバータ（Thermomonospora curvata）
IFO12384の胞子を、培地１ml当り５×10⁵個にな
るように接種した。なお、接種用の胞子形成培号としては、上記の
培地に３（wt／vol）％の寒天を加えた斜面培地
を用い、46〜47℃で培養し胞子を形成させた。ついで、51℃、160rmpで回転振とう培養し
た。培養開始４時間後に、酵素を誘導するために
オキソホロン１ｇを培地１に添加し、引き続き
15時間培養を行なつた。生成した菌体を遠心分離
機を用いて、毎分8500回転で15分間遠心分離し集
菌した。生理食塩水で洗浄後、7.5ｇの湿菌を生
理食塩水５mlに懸濁した。一方、18.7（wt／vol）％アクリルアミドモノ
マー（アクリルアミド96部に対し、Ｎ・N′−メ
チレンビスアクリルアミド４部を含む）生理食塩
水溶液の18.75mlと、0.23（wt／vol）％Ｎ・Ｎ・
N′・N′−テトラメチルエチレンジアミンの6.25ml
と、0.28（wt／vol）％過硫酸カリウム溶液の
12.5mlとを調製し、それぞれに窒素ガスを吹きこ
み酸素を除いた。同時に前述の菌体懸濁液へも窒素を吹きこみ脱
酸素した。次に、これら４種の液を同様に脱酸素
しつつ混合し、ついで窒素気流下に置くと、５分
後に強固なゲル50ｇが得られた。これをメツシユ
を用いて１〜２mmの立方体に成形し、固定化菌体
を得た。ついで、この固定化菌体を用い、以下の方法で
オキソホロンの転換反応を行なわせた。すなわ
ち、固定化菌体を用いて変換を行なう際の培地とし
て、豚肝浸出液（湿重で15ｇの肝臓を水100mlを
用いて50℃で１時間抽出した液）を用いた。湿重
で7.5ｇの菌体を含むゲル50ｇと100mgのオキソホ
ロンを含む100mlの培地を500ml容の三角フラスコ
に入れ、51度、160rpmで20時間回転振とうし、
変換反応を行なわせた。その結果、85mgの光学活
性な（６−Ｒ）−ジヒドロオキソホロンが生成し
た。この培地中ではゲルより漏出する菌は増殖し
ないので、生成物の抽出及び単離が極めて容易に
行なうことができた。ついで、このゲルを回収して、上述した方法と
まつたく同様にして、くり返し変換反応を行なわ
せたところ、２回目以降の変換において、変換率
は１回目に比べ少なくとも常に60％以上であり、
少なくとも15回（30日）以上のくり返し使用に耐
えうることがわかつた。実施例２好熱性菌としてサーモモノスポラ・クルバータ
ーのかわりにサーモモノスポラ・フスカ
（Thermomonospora fusca）ATCC27730を用い
て実施例１とまつたく同様に菌を培養し、強固な
固定化菌体を調製した。このようにして調製した固定化菌体を用い、実
施例１とまつたく同様にして変換反応を行なわせ
たところ、変換１回目において80mgの（６−Ｒ）
−ジヒドロオキソホロンが生成した。固定化菌体
のくり返し使用による２回目以降の変換におい
て、この固定化菌体は１回目に比べ少なくとも55
％以上の変換を常に行ない、少なくとも15回のく
り返し使用に耐えることがわかつた。（発明の効果）本発明によれば、使用される固定化菌体ゲルは
物理的強度が大で溶菌も少なく、反覆使用が可能
であるため、オキソホロンの不斉還元による光学
活性なジヒドロオキソホロンの生成を高い変換率
で行なわせることができる。

Claims

【特許請求の範囲】１オキソホロンを不斉還元して光学活性なジヒ
ドロオキソホロンを生成する機能を有するサーモ
モノスポラ属に属する微生物とアクリルアミド及
びＮ・N′−メチレンビスアクリルアミドからな
るアクリルアミドモノマーの混合液を重合開始剤
の存在下で重合させて得た固定化菌体をオキソホ
ロンを含む培地で培養することを特徴とするジヒ
ドロオキソホロンの製造法。２サーモモノスポラ属に属する微生物がサーモ
モノスポラ・クルバータである特許請求の範囲第
１項記載のジヒドロオキソホロンの製造法。３サーモモノスポラ属に属する微生物がサーモ
モノスポラ・フスカである特許請求の範囲第１項
記載のジヒドロオキソホロンの製造法。