CN87100660A - 切向流亲合超滤法 - Google Patents

Abstract

通过在有亲合凝胶存在下使液体混合物进行切向流超滤的方法，从含有生物大分子的液体混合液中分离基本纯净的生物大分子，亲合凝胶与被分离的基本纯净的生物大分子之间是选择性结合的，该方法可以采用正亲合吸收或者负亲合吸收的方式。

Description

本发明是关于从生化大分子产品的混合物中和从含有或者生产这些生化大分子产品的介质中回收和分离生化大分子产品的提纯和分离方法。更确切地说，是一种亲合色谱和切向流超滤技术相结合、可用连续流或半连续流进行操作的用于提纯或分离生物分子的生化提纯方法。该方法特别适用于提纯血红蛋白和化学改性血红蛋白，但一般也广泛适用于提纯其它生物和生化产品。

现有技术中已有多种用于分离生物分子混合物的方法。其中最有效的方法之一是亲合色谱法，一种基于生物分子与亲合凝胶特定的选择性结合而进行分离的非常有效的分离方法。亲合凝胶通常含有固定在凝胶载体上的结合配位体部分，很多具有良好分子间相互作用之特性的凝胶可以应用于亲合色谱法。

1986年6月26日公开的英国专利UK    8，615，675号以及在其它国家公开的各个相同专利介绍了血红蛋白和经过化学改性以改善载氧和循环性能的血红蛋白衍生物的提纯方法。这些方法采用亲合色谱法并且基于天然（氧合）血红蛋白与一定的亲合凝胶多阴离子部分具有特殊的结合的原理。与以前的观点相反，根据上述英国专利申请，象血红蛋白一样，（氧合）血红蛋白可以用亲合色谱法进行分离。从实用的观点出发这一发现是极其重要的，因为除了严格控制实验室条件以外，要使血红蛋白不转化为（氧合）血红蛋白事实上是不可能的。该方法适用正、负亲合吸收方式。正亲合吸收方式可用于从各种血红蛋白来源如红血球溶胞产物中提纯血红蛋白。当象红血球溶胞产物这样的混合物，在适合于血红蛋白与凝胶结合的条件下，通过亲合凝胶时，血红蛋白被滞留而混合物中的其它组分则被洗脱。然后从凝胶中洗脱滞留的血红蛋白，即得到纯净的血红蛋白。负亲合吸收方式可用于从因改性反应不完全性而剩下的未改性血红蛋白的残余物中分离改性血红蛋白（即通过任何一种已知物质的共价键附着使多阴离子结合位置进行化学改性的血红蛋白，目的是改善血红蛋白溶液作为非细胞载氧流体的不理想特性。）用该方法，未改性血红蛋白被亲合凝胶滞留，而改性血红蛋白，由于其多阴离子结合位置上明确地要由改性剂的共价键占有而不能与凝胶结合，被洗脱而成非滞留部分。上述的方法都可采用亲合色谱柱，因它有较高的专一性，所以能生产出非常纯的产品。但是亲合色谱法较慢而且是很麻烦的间歇法。

另一种已知的分离方法是薄膜超滤，它是根据分子的大小分离化合物的。这种方法中最简单的方式是使溶液流过带有确定大小孔的过滤器，溶液中尺寸太大不能通过孔的溶质便与能够通过孔的部分分离。但是，这种过滤方法由于未滤过的溶质聚集在过滤器上，最后阻塞液体流过过滤器而受到限制。

最近，采用切向流超滤这种新方法（Gabler.F.R.ASM    News，vol.50    No.7（1984）P299）解决了这个问题。用该方法，使溶液平行流过过滤膜，液体流不断清洗过滤器表面从而防止非滤过溶质阻塞。薄膜两侧的压力差促使流体和过滤溶质流过过滤器。这种方法可以按连续流的方式进行操作，因为在溶液重复地流过膜的同时，穿过过滤器的流体则被连续地引出，进入一个独立的回路。但是，由于切向流超滤仅仅是根据分子的大小进行分离，所以缺乏象用于亲合色谱法那样基于生物专一性进行选择性分离的能力。

本发明包括将切向流过滤用于连续流分离的方法。采用该方法，滞留部分与非滞留部分的分离是根据分子大小通过梯度过滤实现的，另外也采用了亲合凝胶分离法，其中亲合凝胶置于溶液或含有被分离组分的混合物中，做过滤器的上流侧，由于凝胶颗粒比溶质颗粒大得多，所以可以选择既能使得未结合溶质即没有与凝胶结合的溶质通过过滤器，同时又能防止凝胶颗粒和任何与凝胶结合的物质通过的过滤器。

根据本发明，提供了一种用于从含有生物意义上的分子的混合物中分离生物分子的方法，它包括，在至少有一种大分子亲合物质存在的条件下，使所说的混合物经过切向流超滤，大分子亲合物质与所说的生物分子进行特定的结合从而防止它们滤过，而其它较小分子则被过滤除去。

根据本发明还提供了将第二种生物大分子和第一种生物大分子分离开来的方法，包括用亲合凝胶处理含有所说第一种和第二种生物大分子的混合物，亲合凝胶只是选择性地结合所说第一和第二种大分子中的一种，而对另一种大分子不结合，随后，使含有与亲合凝胶结合的大分子的混合物进行切向流超滤，从而在超滤的滤渣中得到与亲合凝胶结合的大分子，在滤液中得到不与亲合凝胶结合的大分子。

这里所说的“生物大分子”是指分子量至少约为1000道尔顿的、天然生物或生化来源的或由生物或生化方法得到的分子。

本发明优先选择的方式是将亲合凝胶分离和切向流超滤相结合的称为切向流亲合超滤的方法。采用该方法，使含有待分离组分的溶液或液体混合物在有适当亲合凝胶存在的条件下进行切向流超滤。

亲合物质包括可溶性结合配位体大分子和亲合凝胶。对于提纯天然的和经过化学改性的血红蛋白，凝胶的亲合特性的基础是天然血红蛋白能与多阴离子亲合凝胶，即腺苷三磷酸-琼脂糖（ATP-agarose）的多阴离子部分相结合。目标组分的分离是通过与它本身专一结合（通常称为“正”亲合色谱的方法）或通过与混合物中其它组分结合（通常称为“负”亲合色谱的方法）实现的。

已知有多种亲合凝胶适用于本发明的方法，而且有许多是工业上可得到的。要选择凝胶的性质，用以结合所选择的生物大分子而与凝胶附着的配位体，以及配位体基团与凝胶结合的化学方式，就必须考虑所选择的生物大分子的性质，它对于发明方法实际操作中亲合凝胶要经受的试剂和溶液的稳定性，和当进行切向流超滤后生物大分子从亲合凝胶中的化学脱除性能。因为大多数生物大分子的分离方法是在水介质中发生的，所以通常在水中的凝胶的稳定性，配位体凝胶联结基团以及价键是很重要的。所选择的配位基团对于结合到凝胶上的生物大分子应有很大的专一性。

在生物大分子是血红蛋白或（氧合）血红蛋白的情况下，优先选择的亲合凝胶应该含有按已知方法由间隔基团（交联剂）与亲合凝胶联结的多阴离子分子。多阴离子配位体如二磷酸甘油脂、核苷磷酸酯、肌醇磷酸酯和硫酸酯等。事实上，凡是能够在由血红蛋白中的二苯胍（DPG）自然占据的结合位置上或裂缝处进行结合的任何多阴离子配位体都可以采用。各种多阴离子配位体对于本技术领域里的普通技术人员来说是众所周知的并发表在相关的科学文献上。除了上述所说的以外，还包括各种有机磷酸酯、二磷酸酯和多磷酸酯，例如，磷酸吡哆醛、核酸磷酸酯如腺苷二磷酸（ADP）、腺苷三磷酸（ATP）、鸟苷磷酸酯、胞嘧啶磷酸酯、胸腺嘧啶磷酸酯、尿嘧啶磷酸酯等;肌醇磷酸酯;糖类磷酸酯和硫酸酯;糖类单羧酸酯和糖类多羧酸酯等等。

配位体与生物大分子的结合不应太强，以免发生从凝胶中难以洗脱生物大分子的情况。如果生物大分子结合的太牢，那么，为洗脱当用到必要的强试剂或条件如极高的PH值时，则会发生变性反应。当用有机多磷酸酯作为配位体提取（氧合）血红蛋白时，配位体与（氧合）血红蛋白的粘合强度随着磷酸基团数的增加而增加。最适宜的粘合强度是三、四和五磷酸酯配位体，因此，优先选择形成配位体的化合物是核苷三、四和五磷酸酯，如腺苷三磷酸、肌醇四磷酸酯、肌醇五磷酸酯和类似物质，还包括上述物质的混合物等。配位体分子与凝胶侧基团是按下面的方式进行化学结合的，即磷酸酯、硫酸酯或羧酸酯官能团被分开，以与血红蛋白中多阴离子结合位置进行反应。当用腺苷三磷酸时，则可在腺苷的N-6位或8-位和凝胶结合，或通过高碘酸盐氧化的核糖部分和凝胶结合。

通常色谱凝胶提供交联剂或间隔基。在其一端有与凝胶共价键联接的非常有效的化学侧链基团，在其另一端还有反应基团用以附着配位体化合物。同时，这些间隔基不要是线性化学基团。在凝胶主链和反应基团之间应有至少约为5埃、优选至少为6埃的用于配位体附着的间距。实际应用时，它表明这些间隔基应含有最少4个成线性排列的原子。以把官能团与凝胶分开。否则，就会发生配位体基团填充色谱凝胶不完全现象。间隔基应该以共价键连接，以保证在提纯、再生和杀菌操作时不发生断裂，而且对于所分离的各种混合物组分，所采用的洗脱试剂应具有稳定性和惰性。所用可与凝胶反应以提供合适间隔基的较好试剂为己二酸、二氨基己烷及其衍生物如己二酸二酰肼和其它各种已知的二酸、二氨基化合物。

合适的色谱凝胶的选择是本领域的一般技能，它应能由各种工业上可获得的产品中制得，且遵循以下基本标准：凝胶必须是大致不溶于水的，具有可衍生性并且无毒、不受再生条件和为满足消毒，静脉注射器给药的卫生标准的要求而进行的处理工艺的影响。因此，必须是容易迅速杀菌而且不破坏凝胶的化学性质。合适的亲合凝胶载体为琼酯糖和硅胶。

一般地说，经过改性了的交联多糖色谱凝胶都可以使用，例如，由Pharmacia    A.S.公司大批生产的、商标为交联葡萄糖凝胶（Sephadex）、琼脂糖凝胶（Sepharase）、Sephacryl和Suparose。工业上大批采用的色谱硅胶和改性硅胶也适用。许多情况下，凝胶已由间隔基团附着在一起。这种作用是通过氨基、环氧基或羟基这些官能团获得的。另外，凝胶也可有一适当配位体与间隔基形成化学附着，从而使凝胶用于本发明的方法中非常有效。

当本发明的方法用于分离血红蛋白和改性血红蛋白以外的其它生物大分子时，应选择不同配位体以保证它对于所选择生物大分子的专一性。一般地说，这种选择可以根据有关科学文献和特定生物大分子的性质进行，属于现有技术。通常，配位体本身也是生物物质。例如，通过抗体吸收法对来源于胎体的α-胎蛋白进行部分提纯〔参见：“癌症研究”（Cancer    Research）30期，第2507-2513页，1970年10月，作者Nisk;“免疫学杂志”（J.Immunol    第121期，第1687-1690页，（1978），作者    Ruoslahti;“生物化学杂志”（J.Biol.Chcmistry）第253期，第7号第2114-2119，1978年4月10日，作者Parmelee等〕，但最终剩余物混杂有清蛋白。采用切向流亲合超滤法（TFAU）按下列方式可以完成从α-胎蛋白中除去清蛋白的任务。在这种特殊情况下，可以将具有特殊碳水化合物结合特性的生物大分子如伴刀豆球蛋白-A（Con-A）与合适的凝胶接合，并作为亲合凝胶，在有Con-A琼脂糖凝胶存在的条件下，用TFAU法从非糖蛋白的清蛋白中，特定地分离出糖蛋白α-胎蛋白。该过程可以作为构成从胎血清和清蛋白流体中分离有用的α-胎蛋白之方法的一个步骤（参见Can.J.Biochem    51，1973，P1213）。根据本发明的TFAU方法，采用Con-A琼脂糖亲合凝胶，一般来说，就可以从非糖蛋白中分离糖蛋白。

用于切向流超滤法的过滤膜应该选择为亲合物质颗粒及其带有特殊粘合组分的络合物是非滤过的，而被分离的混合物组分是容易滤过的。该方法的一个特点是可以按连续流将两个或多个简单的或亲合凝胶超滤步骤串联结合以便进行复杂的分离。

一般地说，本发明的切向流超滤法中使用的薄膜就如同前面引用由F.Raymond    Gabler所作的一文中提到的那种薄膜。它们通常是微孔（MF）型，超滤（UF）型或反渗透（RO）型合成薄膜。MF型合成薄膜微孔大小一般为0.1-10微米，可以制成能阻滞所有大于额定大小的颗粒。UF型薄膜微孔较小，其特征在于它能滞留球状蛋白大小。适用于1，000-1，000，000公称分子重量（道尔顿），相当于约0.001～0.05微米大小的颗粒。RO型薄膜可用于滞留更小的组分。其有效孔隙大小约为0.0005～0.001微米。对于大部分用于分离生物大分子的薄膜来说，这些孔的尺寸太小;连无凝胶结合的大分子都不能通过。最适用于本发明方法的是超滤膜，超滤膜通常不对称，在决定其分离能力的上流表面上铺有一薄膜。超滤膜一般是用合成聚合物膜如聚矾制成的。

用于切向流超滤的薄膜过滤器可以是一个单元，根据所处理液体体积不同，具有不同的构形，也可有多种微孔尺寸。对于较大规模的生产来说，用于本发明特别有效的过滤器是已知的，工业上成批生产的Millipore    Prostack型切向流超滤器。具体地说，本发明的第一种方法是从含血红蛋白的溶液或混合物如红血球溶胞产物中分离/提纯天然血红蛋白，其步骤如下：第一，简单的切向流过滤步骤，用约为100千道尔顿微孔大小薄膜从含有血红蛋白的细胞质蛋白中分离红细胞叶绿体基质和大细胞质组织。然后，将这些蛋白质与多阴离子亲合凝胶混合，使其与血红蛋白进行特殊的结合。再用相同薄膜进行第二步切向流过滤。亲合凝胶-血红蛋白的络合物因其大小的原因被阻止通过过滤器，而非血红蛋白溶质则被过滤除去。

在第三步切向流过滤步骤中，凝胶-血红蛋白的络合物与含有阴离子或多阴离子分子如ATP，磷酸盐或氯化钠的溶液混合，原来和凝胶结合的多阴离子用以与血红蛋白结合。血红蛋白脱离凝胶，穿过过滤器，最后一步过滤产生纯血红蛋白。凝胶可以重新使用。

第二种方法是从含有化学改性血红蛋白和未改性血红蛋白的剩余物的反应混合物中分离/提纯改性血红蛋白，因化学改性反应的不完全性，在溶液可以用于浸渍之前，必须除去未改性血红蛋白如ATP-血红蛋白，或在提纯的PLP-Hb聚合的情况下进一步改性而用作为代用血液。为此，要在多阴离子亲合凝胶存在下，使反应混合物进行切向流过滤，多阴离子结合位置未被占据的未改性血红蛋白可与凝胶结合。因而由于其分子较大，不能通过过滤器，而改性血红蛋白因其多阴离子结合位置由改性剂以确定的共价键形式占据了，所以不能与凝胶结合，分子较小足以通过过滤器。这样便得到纯改性血红蛋白，可以直接用作非细胞氧载体或经过进一步改性如聚合或交联生成各种各样的生物聚合物。重要的是以后改性反应的不完全性不是本质问题，因为，经上述方法提纯的产物中不含天然血红蛋白。而天然血红蛋白在血管内的溶液造成的问题最严重。随后通过加入适当阴离子可以从凝胶中回收未改性血红蛋白。象在第一种方法中一样，再循环回到改性步骤中去，凝胶可以重新使用。

本发明的方法很适合于工业和中试生产规模，这在以下还将详细描述，该方法可以按半连续方法运行，即按连续流方式使含有与亲合凝胶结合的所要的生物大分子溶液通过切向流过滤器，在一大批溶液经过这样的过滤后，接着从所要的生物大分子中连续地分离凝胶。清洗步骤可以插在过滤步骤之间进行，然后再处理一批新溶液。按这种方式，即形成一连续循环工艺，生产的产品产量高，纯度好，周期短。亲合凝胶所具有的极高的选择性分离生物大分子的特性，以前仅仅把它用于色谱分析，而切向流超滤则具有能够连续过滤含有固体的溶液而不阻塞过滤器的特性。现在将亲合凝胶与切向流超滤结合后便形成了独特、先进、连续并能工业化地分离和提纯生物大分子反应产物的方法。该方法的用途是极其广泛的，除了特别适用于血红蛋白和血红蛋白的衍生物外，还可广泛用于其它生物大分子如用天然和遗传工程微生物发酵的蛋白质产物、高分子量的抗菌素、细胞分泌物等等。

附图

图1A表示在有琼脂糖-ATP（AGATP）凝胶存在下无叶绿体基质的血红蛋白（SFH）切向流超滤（TAFU）分布图，由下面的实施例1得出;

图1B表示在有AGATP凝胶存在下含有磷酸吡哆醛改性SFH反应混合物的TAFU分布图，由下面的实施例1得出;

图2A-2D是一系列表示用高效液体色谱法（HPLC）提纯的血红蛋白组分特性的示意图，由下面的实施例1得出;

图3表示TFAU法对根据本发明提纯的血红蛋白组分的氧结合亲合性的效果，由下面的实施例1得出;

图4表示根据本发明的方法进行工业化或半工业化生产装置的流程图。

实施例1

用切向流亲合超滤（TFAU）技术提纯无叶绿体基质血红蛋白（SFH）。

按照Rosenbery等人提出的改进方法〔“J·生物化学，生物物理学法”（J.Biochem.Biophys.Methods）1981年第4期，第39-48页，作者：T.L.Rosenbery，J.F.Cheu，M.M.L.Lee，T.A.Moulton和P.Onigman〕制备SFH;再用Lamed和Oplatka提出的改进方法来〔“生物化学”（Biochemistry）1974年，第13期，第3137～3142页，作者：R.Lamed和A.Oplatka〕制备AGATP凝胶。

采用的过滤装置为Amicon搅拌室，带有截止分子量为100千道尔顿的DIAFLO超滤薄膜。该装置通常为圆柱体，有供加入流体试剂用的上阀入口，供增加气压用的上阀气体入口，与圆柱体底壁大致呈水平设置的超滤膜，流体收集室以及膜下面、对收集室言的径向流体出口。在圆柱体内装有旋转搅拌器，形状为带有水平面垂直叶片的平桨，就装在薄膜的上面，靠室外的磁力控制。这样，在搅拌器旋转时，就使液体物料在室内以切向流的方式连续地通过薄膜表面。气体压力为正压，通常为氮气。气体通过上气口就会产生通过薄膜的非常有效的切向流超滤。

本实施例中，采用的过滤速度为2毫升/分，温度为4℃以及氮气（正）压力为50帕斯卡。开始，在50毫摩尔的Bis-Tris水溶液缓冲剂，PH7下，将AGATP和SFH装入过滤室内，SFH与凝胶结合生成红色凝胶。连续收集过滤室底部的滤液，分离组分，再用光谱分析血红蛋白存在的红颜色特性，（吸光度为576纳米），分析结果如图1A所示。图中（a）部分表明血红蛋白基本上都被凝胶滞留，较早出现的小峰是由于含有未结合的血红蛋白的杂质造成的，在到分段15为止，实际上滤液完全不含其它峰，这说明血红蛋白全部被滞留在亲合凝胶上或通过切向流超滤已被从凝胶周围除去。

当收集15分段组分后，过滤物便呈无色，通过上液体入口将一竞争的亲合配位体（缓冲剂B），如10毫摩尔ATP或150毫摩尔Nacl随着50毫摩尔Bis-Tris、PH7.0的缓冲剂一起加到过滤室内。这样就取代了凝胶中的血红蛋白，从而使得通过切向流超滤从过滤室过滤出去的滤液保持纯态。如图1A的（b）部分。

实施例2

采用切向流亲合超滤法从未改性无叶绿体基质的血红蛋白中分离经过化学改性的磷酸吡哆醛改性血红蛋白（PLP-Hb）。

用F.Devenuto和A.Zegna提出的方法（J.Surg.Res.34，205～212，1983）制备PLP-Hb。用前面提到的方法制备无叶绿体基质的血红蛋白和AGATP凝胶。使用的装置和过滤条件与实施例1的相同。将含有SFH（或未改性Hb剩余物）的PLP-Hb（产率约为75%）反应混合物加进过滤室，并在有AGATP存在下进行切向流超滤。参见图1B，提纯该混合物则生成两种主要组分、即峰a和峰b。反应产物PLP-Hb因其二磷酸甘油酯结合位置已被占据。不再与AGATP凝胶结合，因此，用切向流亲合超滤使其立刻通过薄膜，即得到峰a，而未改性的Hb和SFH，即未反应的血红蛋白的原料，与凝胶结合，故不能通过过滤器，当PLP-Hb全部通过过滤器时，意味着将得到无色的滤液，如实施例1所述。将缓冲剂B加到过滤室内，这样就从凝胶中有效地脱去SFH和未改性的血红蛋白，从而在它们通过过滤器时，即得到峰b。注意，与图1A中的SFH峰相类似。

该实施例说明，当血红蛋白被改性成替代血液或非细胞载氧化合物时，采用本发明的方法可以从未改性的血红蛋白中有效地分离改性的血红蛋白产物。

图2表示高压液相色谱（HPLC）对SFH.PLP-Hb反应混合物，反应混合物的AGATP滞留的和非滞留组分的分析结果。图2A-2D为试样（A）SFH（50微克）、（B）PLP-Hb反应混合物（100微克），（C）滞留组分（50微克）即图1B中峰b部分和（D）用HR5/5Mono.S离子交换柱（Pharmacia）洗脱的未滞留组分（50微克）（如图1B中的峰a部分）的色谱图，这里，实线表示用缓冲剂A（10毫摩尔丙二酸，PH5.7）洗脱血红蛋白溶液。接下来是用一线性梯度的缓冲剂B（缓冲剂A加上0.3摩尔氯化锂PH5.7、用虚线表示）洗脱。实验条件为：流速0.5毫升/分，温度22℃，采用带有LCC-500型控制器的Pharmacia高压液相色谱系统。

纯SFH主要表现为单独的峰，如图2A所示，SFH    PLP-Hb反应混合物则表现为两簇峰。如图2B所示。在高盐梯度处出现的第二簇峰正好与图2A中的SFH相对照，在缓冲剂B最低浓度处洗脱的第一簇峰（S）也许是含有各种各样的PLP-Hb，〔“J·生物化学”（J.Biol.Chem）第275期，第1320-1324页，1982年，作者：R.Benesch.R.E.Benesch和Suzanna    Kwong〕，造成的。以下反应混合物的切向流亲合过滤同上所述，用高压液相色谱法对滞留的和未滞留的组分进行同样分析，图2C是关于滞留组分的，图1B中的峰b，与图2A中的SFH相似，主要是SFH，图2D是未滞留组分的，设有SFH存在，主要含有PLP-Hb类，注意这些峰与图2B中第一簇峰的相似之处。因此，本实施例中描述的切向流亲合超滤法能够生产出高纯度的PLP-Hb。

图3表示在50毫摩尔Bis-Tris缓冲剂，37℃下，PLP-Hb反应混合物（-·-·-）和TFAU-分离组分，a，PLP-Hb，（-），b，未改性的Hb，（-）和SFH（……）的氧离解曲线，这些曲线由Hem-O-Scan氧离解分析器得出。

这些氧离解曲线说明氧的分压（P₅₀）（指有50%血红蛋白被氧化）受TFAU提纯的影响。TFAU法提纯的PLP-Hb的P₅₀（21毫米汞柱）比反应混合物的P₅₀（15毫米汞柱）低，滞留组分（P₅₀＝7毫米汞柱）和SFH（P₅₀＝6毫米汞柱）很接近。这样，就可以从反应混合物的SFH中用TFAU法有效地分离PLP-Hb，如HPLC分析和氧释放效率（即较低的P₅₀）特性所示。另外，除去未改性的SFH可以产生其它有益的效果，如增大血管内半衰期或减小血红蛋白基替代血液的血管收缩活性。

必须指出，采用该项技术，可以提纯任何改性的血红蛋白如ATP血红蛋白或乙醛酸血红蛋白。另外，也可以用作一般的提纯方法，即可以用于其它意义的生物大分子的提纯。

该提纯方法的另一方面，它可以采用100千道尔顿截止膜过滤器，使血红蛋白（直径5纳米）通过过滤器，从而排出传染性试剂如乙型肝炎病毒（直径42纳米）和爱滋病毒，HTLv-Ⅲ（直径100纳米），这样，用TFAU法提纯的血红蛋白制备的替代血液就有不产生血液滋生的病毒性疾病的可能。

参见图4，为一流程图。说明了根据本发明的方法。用于提纯生物产品如血红蛋白的中试生产或工业化生产装置。该方法包括第一工段40，在这一工段红血球要经过洗涤。溶解和过滤以除去红血球残余物并生成无叶绿体基质的血红蛋白（SFH），该方法还包括与第一工段连续操作的第二工段50，在这一工段，将SFH提纯以获得纯净的血红蛋白（Hb）。

在第一工段40中，将能够从中提纯出血红蛋白的红血球原料置于储罐内，用来自容器42内适当的溶液按已知的方法洗涤和溶解，接着用泵43通过出口管44将物料打入Millipore    Prostack切向流过滤装置45的入口侧，接着将滤液即SFH从过滤装置45的出口侧通过管46送到贮罐47，同时将没有通过过滤装置45之过滤膜的物料部分（即滤渣）经管48循环回到储罐41中、即完成过滤装置45循环操作。当一批红血球空胞经洗涤，溶解物也送到贮罐47后，容器42中的洗涤溶液可用来洗涤储罐41和过滤装置45。

在第二工段50中，采用亲合色谱和切向流超滤（TFAU）相结合的方法。生产纯净的血红蛋白。将第一工段40中得到的一批SFH从贮罐47经管51送到反应容器52中，在这里还有洗涤溶液容器53，在以下所述洗涤阶段当需要的时候，可以将洗涤溶液通过管54送到反应容器52中。反应容器52内装有亲合凝胶，就是1986年6月26日公开的U.K.8，615，675号专利说明书所描述的琼脂糖-ATP亲合凝胶。第二工段（50）的方法中，首先进行的是凝胶与血红蛋白在反应容器52内选择性结合。接着将含有血红蛋白-凝胶络合物的液体混合物用泵56经出口管55送到    Millipore    Prostack切向流过滤装置57的入口侧，这基本上与第一工段40中采用的方法相似。这里，含有改性的血红蛋白和类似的没有与凝胶进行选择性结合的物质的杂质通过过滤器作为滤液并经滤液管道58送出过滤装置57外。进入收集器59内，排掉或进一步利用。同时，Hb-凝胶络合物不通过过滤器并经滤渣管道60返回作为滤渣。接着，在第二个恒容洗涤阶段，用容器53中的溶液洗涤反应容器52和过滤装置57中的凝胶-Hb络合物，选择的溶液要保证不使Hb从反应器52的凝胶中有化学脱除现象，通过过滤器的洗涤溶液可以加到第一收集器59的滤液中去。

当反应容器52中全部SFH经过过滤和洗涤后。反应容器52含有或许混合有某些未反应凝胶的凝胶-血红蛋白络合物，但基本上无其它杂质存在。现在需要从凝胶中除去Hb并回收凝胶再供另一批SFH使用。接着，在第三阶段，将盐溶液即氯化钠溶液经由设置在旁通管道62和滤渣管道60之间的入口61送到反应容器52中，在反应容器52内，用钠离子来取代ATP凝胶上的血红蛋白，溶液中的血红蛋白与凝胶一道经出口管道55到过滤装置57，再通过过滤装置57则成滤液，又经过滤液管道58送到第二收集器63，同时，凝胶从过滤装置57中出来经滤渣管道60返回到反应容器52内，准备再供第一工段40中下批SFH使用。在下一批SFH进行反应以前，必须用容器53中的溶液进行进一步的恒容洗涤循环。以恢复凝胶的结合能力，并使管道、过滤器等的污染减小到最低限度。当然，按照惯例，可以采用适当的阀控制，以保证在最少的手动调节的情况下该方法在不同阶段和回路的正常运转。旁通管道62可配有适当的控制装置，分析仪表、传感装置、取样器、脱气装置等等，以保证全部生产过程的良好调节和控制。

采用该装置每8小时可生产2，400单位血红蛋白，不过该装置的建造和操作容易且廉价，在即刻需要造血的地方，可按该方法建一套预制的或轻便的装置。

所说的这套装置可用于从含有有意义的生物分子的溶液如发酵溶液（溶液浓度或高或低）中萃取和提纯各种有意义的生物分子。在第一工段40内。所有来自发酵方法混合物中的有机废物，酵母残余物等都可以经分离生成含有所需产物的滤液，但还有杂质，然后将滤液送到第二段处理，使混合物与经适当选择的亲合凝胶接触，所需产物与亲合凝胶进行选择性结合。接着，使混合物经过切向流亲合超滤（TFAU）以便除去未结合的杂质，再将凝胶返回到反应容器内，用盐洗脱使所需产物从凝胶中分离出来、混合物再经过切向流超滤，从凝胶中分离出纯净的产品。

通常，通过适当的操作阶段和循环，这套装置也可用于处理用所谓“负亲合吸收法”制备的产物，“负亲合吸收法”就是用与不需要的物质进行选择性结合的亲合凝胶从不需要的物质中分离所需要的生物分子。接着，在第二工段第一步中，从切向流超滤装置57中，作为滤液回收所需的物质，送到第一收集器59中。第二步，利用切向流亲合过滤装置57，将不需要的物质或杂质从凝胶中洗脱和分离出去。分离的凝胶可再使用。上述实施例2中的从未改性的血红蛋白中分离吡哆醛血红蛋白的PLP-Hb是本发明利用负亲合吸收法的一个特殊实施例。

Claims (14)

1、从含有具有生物意义之分子的混合物中分离所说的具有生物意义之分子的方法，包括在至少有一种大分子亲合物质存在下使所说的混合物经过切向流超滤，大分子亲合物质与所说的具有生物意义之分子进行特殊结合从而阻止其滤过，而其它较小分子则通过所述的过滤除去。

2、根据权利要求1的方法，其中所说的具有生物意义之分子为生物大分子。

3、根据权利要求2的方法，其中继所说的切向流超滤过滤除去较小分子之后，取代与大分子亲合物质结合的所说的生物大分子，所形成的混合物经过切向流超滤使生物大分子与大分子亲合物质分离。

4、根据权利要求3的方法，其中所说的具有生物意义之大分子为血红蛋白或其衍生物。

5、使第一种生物大分子和第二种生物大分子分离的方法包括，用与这两种大分子中的一种大分子选择性结合而与另一种大分子不结合的大分子亲合物质处理含有这两种生物大分子的混合物，接着，使含有已结合亲合物质之大分子的混合物进行切向流超滤，从而在超滤的滤渣中得到结合亲合物质的大分子，在超滤滤液中得到未结合亲合物质的大分子。

6、根据权利要求5的方法，继切向流超滤之后，用化学法取代滤渣中与大分子亲合物质结合的，结合亲合物质大分子，使大分子亲合物质和所形成的大分子的混合物进行切向流超滤，以便从中分离大分子亲合物质。

7、根据权利要求6的方法，使大分子亲合物质再循环，以便与下一批混合物中两种大分子中的一种大分子进行选择性结合。

8、根据权利要求5、6或7的方法，其中所说的大分子亲合物质为亲合凝胶。

9、根据权利要求5-8中任何一个权利要求的方法，其中所说的亲合凝胶为琼脂糖凝胶或硅胶。

10、根据权利要求9的方法，其中所说的第一种和第二种生物大分子是血红蛋白和血红蛋白衍生物。

11、根据权利要求10的方法，其中所说的亲合凝胶为琼脂糖凝胶，它含有一个通过至少5埃间隔化学基团与其附着的选择性亲合结合阴离子。

12、根据权利要求11的方法，其中所说的选择性亲合结合阴离子为磷酸酯、核酸磷酸酯、肌醇磷酸酯、糖类磷酸酯、糖类硫酸酯、糖类单羧酸酯、糖类聚羧酸酯或糖类二磷酸甘油酯。

13、根据权利要求5-9的任何一个方法，其中所说的第一种和第二种生物大分子为糖蛋白和非糖蛋白。

14、根据权利要求13的方法，其中所说的亲合凝胶为与伴刀豆球蛋白-A结合的琼脂糖。

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