CN111918874B

CN111918874B - 包括亲和色谱法过程的获得百日咳鲍特菌来源蛋白质的方法

Info

Publication number: CN111918874B
Application number: CN201980022292.XA
Authority: CN
Inventors: 朴钟冠; 文在勋; 崔起燮; 安东浩; 全亨珍; 金惠连; 崔普渼
Original assignee: GREEN CROSS CORP
Current assignee: GREEN CROSS CORP
Priority date: 2018-03-27
Filing date: 2019-03-15
Publication date: 2024-04-12
Anticipated expiration: 2039-03-15
Also published as: KR20190112982A; JP7031814B2; KR102362777B1; WO2019190092A1; MX2020009964A; AU2019242986B2; AU2019242986A1; JP2021517154A; BR112020019758A2; CN111918874A

Abstract

本发明涉及包括亲和色谱法过程的获得百日咳鲍特菌(Bordetella Pertussis)来源之蛋白质的方法。本发明通过以使用蓝色亲和柱的纯化过程而分离百日咳鲍特菌的PT和FHA蛋白提高了PT和FHA蛋白的生产产率。另外，与使用尺寸排阻色谱法(SEC)过程的分离方法相比，当使用该过滤过程时，可显著提高靶蛋白的产出。此外，使用蓝色亲和柱用于分离PT和FHA蛋白的方法降低了树脂费用、操作时间、缓冲剂消耗和生产成本，并且显著提高了PT和FHA蛋白的生产率。

Description

包括亲和色谱法过程的获得百日咳鲍特菌来源蛋白质的方法

技术领域

本发明涉及用于获得百日咳鲍特菌来源的蛋白质的方法，其包括亲和色谱法过程。

背景技术

百日咳是主要在婴儿中发生并且以咳嗽持续2周或更长为特征的急性呼吸系统疾病。已经报道百日咳由作为革兰氏阴性、需氧的、短球杆菌的百日咳鲍特菌(BordetellaPertussis)引起。百日咳鲍特菌以人作为其唯一的宿主，并且人主要通过呼吸道被感染。另外，百日咳鲍特菌依存于呼吸道黏膜并在人体中引起疾病。在1930年代，开发了细胞百日咳疫苗并且证明对百日咳具有预防作用。另外，在1940年代，百日咳疫苗与破伤风和白喉灭活死疫苗组合使用；然而，报道了全细胞百日咳疫苗的不良作用(癫痫、水肿、发热，等)。因此，需要开发具有安全性的百日咳疫苗。

在1950年代，进行了百日咳鲍特菌的发病机制的研究，并且例如百日咳毒素(pertussis toxin，PT)、丝状血凝素(FHA)、百日咳杆菌黏附素(PRN)和菌毛(fimbriae，FIM)等组分被报道为抗原。随后，正在进行包括这些蛋白质的分离和纯化的非细胞百日咳疫苗的开发。自1980年代以来，在日本首次开发并接种了纯化的百日咳疫苗。

纯化百日咳疫苗的目的是生产富含特定蛋白质(例如PT、FHA和PRN)并且不含内毒素的产品。传统地，通过重复硫酸铵沉淀和密度梯度离心同时纯化抗原。然而，这样的方法具有生成大量杂质并且难以控制纯化过程的缺点。另一种方法是使用物理和化学方法的组合单独地纯化每种抗原。韩国公开专利文本No.2015-0124973公开了包含PT、FHA以及和2型和3型FIM的非细胞百日咳疫苗组合物。

用于纯化百日咳鲍特菌的主要蛋白PT和FHA的现有工艺是使用尺寸排阻色谱法(size exclusion chromatography，SEC)(用于普通疫苗制备的方法)来分离培养物上清液中存在的PT和FHA。然而，该方法难以扩大规模并且具有低的加工产率。另外，在包括混合三种或四种组分的百日咳疫苗生产方法中，即使一种组分的生产率降低也可导致增加整体生产周期的问题以及由生产批次数目的增加而引起的经济问题。

发明内容

技术问题

关于此，在研究解决SEC过程的问题并且以找到能够有效生产百日咳鲍特菌来源的蛋白质PT和FHA的方法的同时，本发明人已经发现在其中使用与特定化合物结合的树脂通过亲和色谱法分离PT和FHA蛋白的情况下，不仅明显降低了该过程所需的时间和成本，而且提高了靶蛋白的生产。基于该发现，本发明人完成了本发明。

因此，本发明的一个目的是提供用于使用亲和柱分离百日咳鲍特菌来源的蛋白质PT蛋白或FHA蛋白的方法。

本发明的另一个目的是提供用于纯化百日咳鲍特菌来源的蛋白质PT蛋白或FHA蛋白的方法。

技术方案

为了实现上述目的，本发明提供了用于在预处理的百日咳鲍特菌培养物中通过亲和色谱法过程分离PT蛋白或FHA蛋白的方法。

为了实现上述目的，本发明提供了用于纯化PT蛋白的方法，其包括通过膜色谱法(membrane chromatography，MC)过程从已经在亲和色谱法过程中分离的PT蛋白中去除内毒素的步骤。

另外，本发明提供了用于纯化FHA蛋白的方法，其包括通过膜色谱法过程从已经在亲和色谱法过程中分离的FHA蛋白中去除内毒素的步骤。

发明的有益作用

在本发明中，通过使用填充有与特定化合物结合之树脂的亲和柱的纯化过程分离百日咳鲍特菌的PT和FHA蛋白，并且因此提高了PT和FHA蛋白的生产效率。在其中当与使用SEC过程的分离方法相比，在通过该纯化过程分离PT和FHA蛋白的情况下，显著提高了PT蛋白的生产。使用亲和柱的PT蛋白或FHA蛋白的分离方法降低了树脂成本、操作时间、缓冲剂使用和生产成本，并且因此可有效地用于PT蛋白或FHA蛋白的大量生产。

附图简述

图1举例说明了PT和FHA蛋白的整个工艺的流程图。

图2a举例说明了在蓝色亲和柱过程中使用梯度洗脱的PT和FHA蛋白的分离过程的色谱图。

图2b举例说明了使用梯度洗脱分离PT和FHA蛋白的可能性，如SDS-PAGE上所示。

图3a举例说明了在蓝色亲和柱过程中使用分步洗脱(300mM、400mM、450mM、500mM和1M NaCl)的PT和FHA蛋白的分离过程的色谱图。

图3b举例说明了使用分步洗脱(300mM、400mM、450mM、500mM和1M NaCl)分离PT和FHA蛋白的可能性，如SDS-PAGE上所示。

图4a举例说明了在蓝色亲和柱过程中使用分步洗脱(300mM、400mM、850mM和1MNaCl)的PT和FHA蛋白的分离过程的色谱图。

图4b举例说明了使用分步洗脱(300mM、400mM、850mM和1M NaCl)分离PT和FHA蛋白的可能性，如SDS-PAGE上所示。

图5a举例说明了使用用于分离PT和FHA蛋白的最佳条件的分离过程的色谱图，所述最佳条件已经通过用表1中的实验设计(design of experiment，DOE)进行蓝色亲和柱过程建立。

图5b举例说明了在用于分离PT和FHA蛋白的最佳条件下通过进行该过程获得的结果，所述最佳条件已经用表1中的DOE建立，如SDS-PAGE上所示。

具体实施方式

在本发明的一个方面中，提供了用于纯化PT蛋白或FHA蛋白的方法，其包括在预处理的百日咳鲍特菌培养物中使用亲和色谱法过程分离PT和FHA蛋白的步骤。

在此，色谱法过程可包括使用与具有式1结构的化合物结合的树脂：

[式1]

所述化合物可以是汽巴蓝3G-A(Cibacron Blue 3G-A，Sigma-Aldrich)。在本发明中，其中柱填充有与化合物结合的树脂的亲和柱过程也称为“蓝色亲和柱过程”或“蓝色亲和色谱法过程”。

在本发明的一个实施方案中，代替尺寸排阻色谱法(SEC)(用于分离PT蛋白和FHA蛋白常规使用的方法)，进行使用化合物汽巴蓝3G-A作为固定相的亲和色谱法过程来分离培养物上清液中存在的PT和FHA蛋白。

另外，亲和色谱法过程可通过分步洗脱或梯度洗脱进行。特别地，可使用梯度洗脱。在本发明的一个实施方案中，分别通过分步洗脱和梯度洗脱进行PT和FHA蛋白的分离过程，以在蓝色亲和色谱法过程中建立用于分离PT和FHA蛋白的有效操作方法。作为结果，在其中通过梯度洗脱进行该过程的情况下，确定了PT蛋白和FHA蛋白在SDS-PAGE上分离良好。

在此，“梯度洗脱”是指在连续改变流动相组成的同时进行洗脱的方法。另外，如本文中使用的术语“分步洗脱”是通过不连续的变换进行洗脱的方法，其在通过改变色谱法中流过柱的溶剂的浓度或组成而实现提高洗脱能力之后进行。

梯度洗脱方法中使用的洗脱缓冲剂可以是磷酸钠溶液。另外，洗脱缓冲剂还可包含NaCl溶液，并且蓝色亲和色谱法过程可通过改变NaCl溶液的浓度来进行。

磷酸钠溶液的浓度可为10mM至500mM、20mM至350mM、50mM至200mM或100mM至150mM，并且特别地浓度可为100mM。另外，包含NaCl溶液的磷酸钠溶液的pH可为6.5至8.5、6.8至8.2、7.2至7.8或7.4至7.7，并且特别地pH可为7.6。另外，洗脱缓冲剂的量可以是15CV至35CV、20CV至33CV或23CV至30CV，并且特别地可以是25CV的量。另外，在色谱法过程中，可通过从0M至3M、从0M至2M或从0M至1M逐渐提高NaCl溶液的浓度来单独洗脱PT和FHA蛋白。

在本发明的一个实施方案中，通过使在pH 7.6下的100mM磷酸钠溶液以25CV流动同时将NaCl的浓度逐渐提高至1M来单独洗脱靶蛋白PT和FHA，其中首先洗脱PT并随后洗脱FHA。

在使用梯度洗脱的洗脱步骤之前，可对使用亲和色谱法的纯化过程进行预处理操作。预处理操作可通过以下步骤进行：i)洗涤，ii)使用平衡缓冲剂平衡柱，iii)将包含靶蛋白的溶液吸附至柱上，iv)使用再平衡缓冲剂再平衡柱，以及v)使用洗涤缓冲剂洗涤柱。

填充有树脂的柱可用NaCl溶液洗涤。另外，平衡缓冲剂、再平衡缓冲剂或洗涤缓冲剂可以是磷酸钠溶液。在本发明的一个实施方案中，用3M NaCl溶液对柱进行洗涤，并且使用磷酸钠溶液作为平衡缓冲剂和再平衡缓冲剂来平衡和再平衡柱。另外，使用磷酸钠溶液作为洗涤缓冲剂洗涤柱。

另外，在本发明中，“预处理的百日咳培养物”可通过以下步骤获得：1)对百日咳鲍特菌培养物进行离心；2)通过羟基磷灰石(hydroxyapatite，HA)色谱法纯化所获得的上清液；以及3)通过疏水相互作用色谱法(hydrophobic interaction chromatography，HIC)纯化经纯化的上清液。

首先，可进行离心百日咳鲍特菌培养物的步骤。

在本发明中，“百日咳鲍特菌”(也称为副百日咳鲍特菌(Bordetellaparapertussis))是小至约0.3至1μm的革兰氏阴性球杆菌。在百日咳鲍特菌的主要蛋白质中，PT是百日咳毒素的缩写。PT蛋白由百日咳鲍特菌产生并且是在活体或细胞中导致功能障碍或表现出致命作用的有毒物质。另外，FHA是丝状血凝素黏附素(filamentoushaemagglutinin adhesin)的缩写，并且是导致百日咳的百日咳鲍特菌的毒力因子。PT蛋白和FHA蛋白是从百日咳鲍特菌获得的黏附于气管上皮细胞的外膜蛋白，并且是百日咳疫苗的重要组分。

在本发明的一个实施方案中，在35℃的温度下在改良的Stainer Scholte(modified Stainer Scholte，MSS)培养基中培养百日咳鲍特菌菌株，并将所得细胞培养物在室温下进行离心2小时。然后，分离并由此获得去除细胞的培养物上清液。

第二，可进行通过羟基磷灰石色谱法来纯化所获得上清液的步骤。

在对细胞裂解物或细胞培养物进行离心之后，可使用多种柱色谱法等去除不必要的细胞碎片等。所述柱色谱法可以是羟基磷灰石(HA)色谱法、离子交换色谱法、疏水相互作用色谱法、凝胶排阻色谱法、凝胶过滤色谱法、HPLC、反相HPLC、亲和色谱法(蓝色亲和色谱法)，等。在本发明的一个实施方案中，进行羟基磷灰石色谱法作为用于预处理百日咳鲍特菌培养物的首个纯化过程。

如本文中使用的术语“羟基磷灰石色谱法”是使用磷酸钙的结晶颗粒作为用于分离的支持物的柱色谱法。带负电荷的磷酸根离子和带正电荷的钙原子规律地排列在晶体表面上。具有可适当地与这些原子具有离子相互作用的分子表面的蛋白质可被吸附到柱中的树脂上。另外，可用磷酸盐缓冲剂等洗脱吸附的蛋白质。

在本发明的一个实施方案中，在羟基磷灰石色谱法中，使用磷酸钠溶液作为平衡缓冲剂、磷酸钠溶液作为洗涤缓冲剂以及包含NaCl溶液的磷酸钠溶液作为洗脱缓冲剂来洗脱PT和FHA蛋白。

第三，可进行通过疏水相互作用色谱法来纯化经纯化的上清液的步骤。

在本发明的一个实施方案中，进行疏水相互作用色谱法作为用于预处理百日咳鲍特菌培养物的第二纯化过程。

如本文中使用的术语“疏水相互作用色谱法”是指使用具有疏水性官能团的基质与分子之间的疏水性相互作用的分离方法。可通过亲水性和失活琼脂糖的修饰允许基质具有疏水性功能。可使用通过使烷基胺与CNBr活化的琼脂糖反应而获得的经修饰的琼脂糖。另外，疏水相互作用色谱法广泛用于蛋白质分离。另外，在疏水相互作用色谱法中，对于蛋白质洗脱，可降低离子强度或可提高pH。

在本发明的一个实施方案中，在疏水相互作用色谱法中使用包含NaCl溶液的磷酸钠溶液作为平衡缓冲剂、磷酸钠溶液作为洗涤缓冲剂以及磷酸钠溶液作为洗脱缓冲剂洗脱包含PT蛋白和FHA蛋白的溶液。

在本发明的另一个方面中，提供了用于纯化PT蛋白的方法，其包括通过膜色谱法(MC)过程从已经在亲和色谱法过程中分离的PT蛋白中去除内毒素的步骤。

百日咳鲍特菌来源的蛋白质PT和FHA包含内毒素(存在于细菌内部的毒素)。因此，为了纯化PT和FHA蛋白使得这些蛋白被用作疫苗，必须进行内毒素去除过程。

可通过亲和色谱法或膜色谱法过程进行内毒素去除，并且特别地可通过膜色谱法过程进行。

如本文中使用的术语“膜色谱法”是指用于纯化单克隆抗体(monoclonalantibody，MAb)和其他生物分子的过程，其中使用平面大孔膜使得在比例方面对流大于扩散并且溶液的分离效率相对较高。因此，膜色谱法允许病毒、质粒、宏蛋白复合物等容易接近膜并容易被分离。市售膜色谱可包括但不限于Mustang Q(Pall Corporation)、Sartobind Q(Sartorius Stedim Biotech GmbH)，等。

在本发明的一个实施方案中，进行Mustang Q过程作为用于从PT蛋白中去除内毒素的膜色谱法过程。Mustang-Q是基于疏水性聚醚砜(polyethersulfone，PES)膜的胶囊，其通过基于交联季胺基团的聚合物包被通过离子交换去除带负电荷的内毒素。在Mustang Q膜色谱中，可使用的孔径为0.6μm至1.0μm，特别地0.7μm至0.9μm，并且更特别地0.8μm。

在本发明的另一个方面中，提供了用于纯化FHA蛋白的方法，其包括通过膜色谱法过程从已经在蓝色亲和色谱法过程中分离的FHA蛋白中去除内毒素的步骤。

在本发明的一个实施方案中，进行Mustang Q过程作为用于从FHA蛋白中去除内毒素的膜色谱法过程。

在Mustang Q膜色谱法中，可使用的孔径为0.6μm至1.0μm，特别为0.7μm至0.9μm，并且更特别地为0.8μm。

用于分离和纯化PT和FHA蛋白的过程在图1中举例说明。

发明模式

在下文中，将通过实施例的方式更详细地描述本发明。然而，以下实施例仅用于举例说明本发明，并且本发明的范围不限于此。

实施例1.百日咳鲍特菌的培养

将百日咳鲍特菌(国立卫生研究院，National Institute of Health)在35℃的温度下在MSS培养基中培养4天。对于培养期，特别地，对于接种培养花费1天、对于原代富集培养花费1天、对于次生富集培养花费1天，以及对于主要培养花费1天。

实施例2.离心过程

通过在9,500rpm的条件下以100 1/小时的输入流速在室温下连续离心2小时，将细胞培养物分离成培养物上清液和浆液。

实施例3.HA纯化

使用蒸馏水去除羟基磷灰石(HA)树脂的储存溶液，并随后通过与1M NaOH溶液反应1小时进行洗涤。使用磷酸钠溶液作为平衡缓冲剂以实现平衡。然后，将通过离心过程获得的培养物上清液吸附到HA树脂上，并使用平衡缓冲剂去除剩余的培养物上清液。其后，使用磷酸钠溶液作为洗涤缓冲剂以完成洗涤，并随后使用包含NaCl溶液的磷酸钠溶液作为洗脱缓冲剂洗脱PT和FHA蛋白。

实施例4.在HIC柱上的纯化

使蒸馏水以3CV以120cm/小时流过填充有HIC树脂的柱以去除储存溶液。然后，使1M NaOH溶液以4CV以40cm/小时流过那里以进行洗涤。使作为平衡缓冲剂的包含NaCl溶液的磷酸钠溶液以5CV流过那里以实现平衡。在完成平衡之后，使通过HA纯化过程获得的洗脱物流过用于吸附的HIC柱。使平衡缓冲剂以5CV流过那里以去除残留在柱中的溶液。其后，使作为洗涤缓冲剂的磷酸钠溶液以5CV流过那里以进行洗涤。在完成洗涤之后，使磷酸钠溶液以10CV流过那里以洗脱PT和FHA蛋白。

实施例5.在蓝色亲和柱上的纯化

实施例5.1.通过梯度洗脱的纯化

使蒸馏水以3CV以60cm/小时流过填充有汽巴蓝3G-A树脂的柱以去除储存溶液。然后，使3M NaCl溶液以3CV以60cm/小时流过那里以在使用之前进行洗涤。使作为平衡缓冲剂的磷酸钠溶液以5CV流动以实现平衡。在完成平衡之后，使通过将实施例1.4的HIC洗脱物与蒸馏水以1∶1混合而获得的溶液流过用于吸附的柱。使平衡缓冲剂以5CV流过那里以去除残留在柱中的溶液。其后，使作为洗涤缓冲剂的磷酸钠溶液以5CV流过那里以进行洗涤。

在完成洗涤之后，进行梯度洗脱，其中包含NaCl溶液的磷酸钠溶液用作洗脱缓冲剂。在此，使NaCl溶液在从100mM至500mM的递增浓度的情况下以10CV流动来分离PT蛋白和FHA蛋白。在此，根据其与树脂的结合能力的差异，首先洗脱PT蛋白，并随后洗脱FHA蛋白。结果在图2a和2b中举例说明。

实施例5.2.通过分步洗脱的纯化

在完成洗涤之后，进行包括5个步骤的分步洗脱。作为用于每个步骤的洗脱缓冲剂，使用包含NaCl溶液的在pH 7.6下的100mM磷酸钠溶液。在此，在各个步骤中NaCl溶液以300mM、400mM、450mM、500mM和1M的浓度使用，并将该溶液以10CV流动以分离PT蛋白和FHA蛋白。结果在图3a和3b中举例说明。如在图3a和3b中举例说明的，根据其结合能力的差异，确定了PT蛋白以300mM NaCl浓度洗脱，并且FHA蛋白从400mM开始洗脱。

为了确定洗脱FHA蛋白的确切时间点，通过改变NaCl溶液的浓度进行包括4个步骤的分步洗脱。在各个步骤中，NaCl溶液以300mM、400mM、850mM和1M的浓度使用，并且后续操作与上述相同。结果在图4a和4b中举例说明。如在图4a和4b中举例说明的，PT蛋白仍以300mM NaCl浓度洗脱，并且FHA蛋白以850mM NaCl浓度洗脱。

实施例6.用于分离PT和FHA的最佳条件的建立

为了建立使用梯度洗脱用于分离PT和FHA的最佳条件，通过设置表1中的实验设计(DOE)以小规模进行纯化过程。

[表1]

	C1	C2	C3	C4	C5	C6	C7
									标准序	运行序	中心点	区组	SP	pH	CV
1	1	3	1	1	50	7.4	20
								2	2	10	1	1	150	7.4	20
3	3	9	1	1	50	7.8	20
								4	4	11	1	1	150	7.8	20
5	5	1	1	1	50	7.4	30
								6	6	8	1	1	150	7.4	30
7	7	7	1	1	50	7.8	30
								8	8	4	1	1	150	7.8	30
9	9	5	0	1	100	7.6	25
								10	10	6	0	1	100	7.6	25
11	11	2	0	1	100	7.6	25

在完成洗涤之后，使用以25CV的包含1M NaCl溶液的在pH 7.6下的100mM磷酸钠溶液作为洗脱缓冲剂通过进行梯度洗脱来分离PT和FHA。在此，根据其与树脂的结合能力的差异，首先洗脱PT并随后洗脱FHA。结果在图5a和5b中举例说明。

根据各个条件进行分离过程。作为结果，PT和FHA在9、10和11的条件下最有效地分离。由此，确定了条件9、10和11是使用梯度洗脱用于分离PT和FHA的最佳条件。

实验例1.建立的分离条件的扩大规模的可能性确定

为了确定已经在实施例6中以小规模建立的用于分离PT和FHA的最佳条件是否即使在扩大规模的情况下适用，通过以大规模应用该条件来进行分离过程。结果示于表2和3中。

[表2]

[表3]

如表2和3中所示，在其中已经以小规模建立的用于分离PT和FHA的条件以大规模应用的情况下，与其中通过SEC过程分离PT和FHA的情况相比，PT产量提高了约80％。这表明已经以小规模建立的用于分离PT和FHA的条件也适用于大规模，并且意味着根据本发明的蓝色亲和柱过程在扩大规模和加工产率方面比SEC过程(已经常规使用的用于分离PT和FHA的方法)更有效。

Claims

1.用于获得PT(百日咳毒素)蛋白或FHA(丝状血凝素黏附素)蛋白的方法，其包括：

使用亲和色谱法过程从包含百日咳鲍特菌(Bordetella Pertussis)培养物的样品中分离PT和FHA蛋白的步骤，

其中用于所述过程的洗脱缓冲剂包含磷酸钠溶液，

其中所述洗脱缓冲剂还包含NaCl溶液，

其中所述NaCl溶液的浓度从100mM逐渐提高至1M，并且

其中所述色谱法过程包括使用与具有式1结构的化合物结合的树脂：

[式1]

2.权利要求1所述的方法，其中所述磷酸钠溶液的pH为6.5至8.5。

3.权利要求1所述的方法，其中所述磷酸钠溶液的浓度为50mM至200mM。

4.权利要求1所述的方法，其中所述洗脱缓冲剂的量为15CV至35CV。

5.权利要求1所述的方法，其中在所述亲和色谱法过程之前还包括以下步骤：

1)对百日咳鲍特菌培养物进行离心的步骤；

2)通过羟基磷灰石(HA)色谱法对在步骤1)中获得的上清液进行纯化的步骤；以及

3)通过疏水相互作用色谱法(HIC)对在步骤2)所纯化的上清液进行纯化的步骤。

6.用于纯化PT蛋白的方法，其包括：

经由膜色谱法(MC)过程从通过权利要求1至5中任一项所述的方法获得的所述PT蛋白中去除内毒素的步骤。

7.权利要求6所述的方法，其中在所述色谱法过程中使用的孔径为0.6μm至1.0μm。

8.用于纯化FHA蛋白的方法，其包括：

经由膜色谱法(MC)过程从通过权利要求1至5中任一项所述的方法获得的所述FHA蛋白中去除内毒素的步骤。

9.权利要求8所述的方法，其中在所述色谱法过程中使用的孔径为0.6μm至1.0μm。