KR890001243B1 - 프로인슐린-양 물질의 정제방법 - Google Patents

Abstract

내용 없음.

Description

프로인슐린-양 물질의 정제방법

본 발명은 프로인슐린-양 물질을 함유하는 불순 혼합물로부터 불순물을 분리시켜 프로인슐린-양 물질을 실질적으로 완전히 회수하도록 하는 방법에 관한 것이다.

단백질은 이의 특수 기능을 수행함에 있어서 구조 안정성에 의존하는 생체고분자이다. 용매 조성물중 pH, 온도 및 염농도의 작은 변화때문에 유의적이고 때로는 회복할 수 없는 단백질 변형이 초래될 수 있으므로, 최소한 비특이적, 변성 상호작용을 나타내는 수지를 사용하여 크로마토그라피에 의한 단백질 정제를 이상적으로 수행해 왔다. 종래 이러한 수지는 친수성이 강하며 대부분의 경우 수함량이 80%이상이다. 이들의 친수성에 기인하여 크로마토그라피에 의해 수득되는 수지입자는 적당한 배압하에 조차 파괴되기 쉽다. 또한 이들 친수성 수지를 유기용매로 효과적으로 세척할 수 없기 때문에 치환시키기 위한 어떤 비특이적 흡착도 곤란할 수 있다. 결국 이종의 천연 공급원으로부터 단백질을 예비정제시키는 초기단계에서 난점에 직면한다. 또한 이들의 친수성으로 인해 더욱 바람직한 지지체는 점성의 오물-함입 천연 생성물의 혼합물을 급속 배출시키는데 부적절하다. 결국 초기정제를 위해서 상당한 추가 비용이 드는 크로마토그라피 이외의 방법을 사용해야 한다.

앰벌라이트 XAD(Amberlite

XAD) 수지는 롬 앤드 하스 캄파니(Rohm and Haas Company)에 의해 시판되고 있는 중합성 대형 망상조직의 흡착제이다. 이 수지는 중합체 소수성 표면의 다양한 친화력에 근거하여 화합물이 분리되도록 고안되었다. XAD-형 수지는 입자크기가 크고(20 내지 50메쉬) 매우 소수성 이므로, 구조적으로 유사한 펩타이드 및 단백질의 복합 생물학적 혼합물의 크로마토그라피에 상기 수지가 실지적으로 사용된다는 것은 놀라울 정도이다. 실로 어떤 문헌에도 단백질 정제시 이들 지지체의 운용 파라미터에 대하여 상세히 기술되어 있지 않다. 그러나 XAD-형 수지의 상기한 두 특성으로 인해 이 수지는 놀랍게도 구조적으로 다양하거나 유사한 단백질 둘다를 함유하는 매우 불순한 물-함입 혼합물의 초기 정제단계에 이례적으로 유효하다. 혹자는 XAD-형 수지의 큰 이종 입자크기가 상호작용의 완만하고 불균일 동력학으로 인해 이의 크로마토그라피 수행 능력을 실질적으로 감소시킬 것이라고 정확히 예측할 수도 있다. 결과적으로, 단백질 및 폴리펩타이드 정제시 상기 수지를 사용하지 않게 된다. 그러나 이러한 표면상의 결점은, 상기 수지를 정확히 규정된 조건하에 프로인슐린-양 물질을 함유하는 매우 불순한 오물-함입 물질에 적용한 경우에 예기치 않게도 정제목적에 유리한 것으로 입증되었다.

또한 프로인슐린-양 물질의 정제에 실제적으로 가하는 물질은, (1) 적정 가격으로 쉽게 구입할 수 있고, (2) 1내지 13의 pH범위를 통해서 매우 안정하며, (3) 수성세제 및 유기용매로 컬럼내부를 재생할 수 있는 XAD-형 수지이다.

문헌에서는 매우 개괄적으로 단백질 및 폴리펩타이드 정제시의 XAD-형 수지사용에 대하여 기술하고 있다. 하기 문헌은 합성 디펩타이드에 사용되는, 폴리스티렌-디비닐 벤젠의 공중합체인 XAD-4를 분석적으로 연구한 최초의 문헌이다.[참조 : Pietrzyk, D.J.and Stodola, J.D., Anal Chem. 53, 1822-1828(1981)]. 5개의 잔기를 갖는 합성 펩타이드에 대한 또 다른 연구는 우선 분쇄시켜 상당히 작은 크기의 입자도 만든 XAD-4 수지상에서 어느정도 효율적인 예비정제를 달성할 수 있음을 보여주었다. [참조 : Pietrzyk, D.J., Cahill, W.J., and Stodola, J.D., J Liquid Chrom. 5, 443-461(1982)]. 결국 이러한 연구들은 대공극성의 소수성 수지상에서 작은 펩타이드의 크로마토그라피를 나타내지만, 이들은 실질적으로 더 크고 매우 복잡한 단백질의 혼합물이 큰 입자크기의 지지체를 사용하며 불순도가 높은 혼합물로부터 효율적으로 분리될 것인지에 대해서는 언급하지 않고 있다.

불순도가 높은 공급원으로부터 단백질을 정제함에 있어서의, 난점은 특히 재조합 DNA 기술출현 및 펩타이드 및 단백질의 공업적 제조에의 이 기술의 사용으로 명백해졌다. 재조합 DNA 기술에 의해서 생성물을 공업적으로 발현시키기 위해서는, 원래의 발효배지 및 후속 화학적 및/또는 다른 처리로부터 생성된 혼합물중에 함유된 불순물로부터 재조합 DNA-공급 생성물을 분리시켜야 한다. 따라서 생성된 대규모의 단백질 정제기술이 중요한 관심사가 되었다.

재조합 DNA-원 단백질의 정제를 더욱 복잡하게 만드는 요인은 여러 단백질중 시스테이닐 잔기의 존재로 인해 발생된다. 여러 경우에, 시스테인-함유 단백질의 재조합 발현 후, 어떤 단백질 정제도 수행하기 이전에 시스테이닐 설프히드릴을 일반적으로 S-설포네이트로 전환시킴으로써 가역적으로 보호시켜야 한다.

이와같이 전환시시키면 점성이 큰 탈성제 존재하에 추가량의 바람직하지 않은 오물양 불순물이 생성되는데 이로부터 목적하는 단백질을 먼저 분리시켜야 한다.

특정예로서, 재조합 DNA-원 인슐린은 일반적으로 2가지 방법으로 수득할 수 있다. 한 방법은 인슐린 A-쇄 및 인슐린 B-쇄를 각기 발현 시키고 분리시킨 다음 쇄를 화학적으로 결합시켜 인슐린을 생성시키는 방법이다. 다른 한 방법은 직쇄 프로인슐린 전구체를 발현시키고 분리시키는 것이다. 그런 다음 생성물을 산화적으로 프로인슐린으로 재생시키고 프로인슐린을 효소적으로 인슐린으로 전환시킨다.

재조합 인슐린을 생성시키는 두가지 방법에는 인슐린과 혼합하기 위한 인슐린 A-쇄 S-설포네이트 또는 프로인슐린으로 이황화 상호교환 시키기 위한 프로인슐린 S-설포네이트를 생성시키는 유사한 화학적 전환 및 정제 과정이 포함된다.

3개의 S-설포네이트중 특정화합물, 인슐린 A-쇄, 인슐린 B-쇄, 또는 프로인슐린은 일반적으로 다음과 같이 제조한다 : (1) 메티오닐 잔기를 통해 펩타이드의 아미노 말단에 연결된 목적하는 펩타이드 서열을 함유하는 생성물을 외인성 펩타이드 서열로 발현시키고 : (2) 시아노겐 브로마이드를 사용하여 외인성 부분으로부터 목적하는 서열을 분할하고 : (3) 펩타이드 시스테이닐 티올을 아황상 분해시켜 상응하는 S-설포네이트를 생성시킨다.

상업적으로 실행할 수 있는 이러한 유형의 방법을 행함에 있어서, 목적 생성물이 거의 또는 전혀 손실되지 않도록 하면서 이 생성물(이 생성물이 최종생성물이든 중간체이든 간에)로부터 오물, 염, 유기용매 및 기타 오염물을 제거시키는 방법을 발견할 필요가 있다.

대단히 불순한 원료, 특히 재조합 DNA 법으로 수득한 원료로부터 프로인슐린-양 물질의 순도를 증진시키는 매우 바람직한 방법이 발견되었다. 이 방법에는 불순한 원료를 대공극성 아크릴레이트 에스테르 공중합체수지 지지체상에서 역상 정제시키는 과정이 포함 된다. 본 발명에 따르면, (1) 프로인슐린-양 물질을 함유하는 혼합물을 pH 약 7 내지 약 10에서 역상 대공극성 아크릴레이트 에스테르 공중합체 수지 지지체에 적용시키고, (2) 아세톤, 아세토니트릴, 및 아세톤 및 아세토니트릴 혼합물중에서 선택된 유기 희석제 약 10용적% 내지 약 30용적%를 함유하는 pH 약 8 내지 약 11의 수성용출제를 사용하여 프로인슐린-양 물질을 상기 지지체로부터 용출시킴을 특징으로 하여, 프로인슐린-양 물질이 거의 완전히 회수되도록 상기 프로인슐린-양 함유 불순 혼합물로부터 불순물을 분리시키는 방법이 제공된다.

상술한 바와같이, 본 발명 방법은 불순도가 높은 프로인슐린-양 물질 함유 혼합물의 정제에 관한 것이다. 용어“프로인슐린-양 물질”은 (1) 특정종, 예를들어, 인체, 소, 또는 돼지의 프로인슐린 : (2) 환원된 (-SH) 프로인슐린 및 S-보호된 프로인슐린 (예, 프로인슐린 S-설포네이트)과 같은 프로인슐린의 전구체 : (3) 프로인슐린의 유도체 또는 이의 전구체 예를들어 A-쇄 B-쇄, C-펩타이드가 길어지고/길어지거나 단축되도록 변형시킨 구조물, 또는 이들 셋중 특정물의 혼합물 : 및 (4) 프로인슐린의 동족체 또는 이의 전구체, 예를들어 프로인슐린 아미노산 서열이 하나 이상의 아미노산 잔기로 치환되어 변형된 구조물을 의미한다.

본 발명 방법에는 대공극성 아크릴레이트에스테르 공중합체의 크로마토그래프 지지체로서의 용도가 포함된다. 이러한 공중합체 수지 흡착제는 당해 분야의 전문가에게 공지되어 있다. 본 발명 목적에 대단히 적합한 두가지 지지체는 XAD-7 및 XAD-8이란 상표로 롬 및 하스 캄파니가 시판하고 있다. 둘중에서 XAD-7이 본 발명에 특히 바람직하다.

본 발명 공정은 3개의 크로마토그래프 단계로 나눌 수 있다. 그러나 3단계중 Ⅰ단계만이 필요하다. 다라서 흡착(loading)단계 및 탈착단계는 공정에 필수적이며, 바람직하게는 중간 세척단계가 포함될 수 있다. 더우기, 정제 효율을 위하여 공정을 칼럼 조건하에서 수행하는 것이 훨신 바람직하나, 뱃치 또는 칼럼법으로 수행할 수 있다. 본 발명 방법을 뱃치법으로 수행하든 칼럼법으로 수행하든 간에, 본 발명 달성에 근본적이고 본 발명의 기본을 이루는 특정조건은 일정하게 유지시킨다.

본 발명의 흡작단계에 사용되는 프로인슐린-양 물질을 함유하는 복합혼합물은 일반적으로 전술한 처리단계의 서열화의 결과로서, 그리고 궁극적으로 재조합 DNA방법학에 의한 발현의 결화로서 수득된다. 관례적으로 생성물은 최소한 그 일부가 프로인슐린 또는 이의 유도체 또는 동족체의 아미노산 서열에 해당하는 아미노산 서열을 포함하도록 발현시킨다. 발현 생성물은 일반적으로 프로인슐린-양 물질이 장쇄 발현 생성물로부터 화학적으로 또는 효소적으로 발생되도록 하는 선택적 절단부위를 가진다. 일반적으로 선택적 절단부위는 메티오닌 잔기로 나타낼 수 있으며, 이 잔기의 카복실 말단에서의 분해는 공지된 조건하에 시아노겐 브로마이드를 사용하여 효과적으로 수행한다. CNBr-분해한 후 발효시킨 결과 생성된 불순한 혼합물은 오물 및 다른 물질의 부수적인 복합혼합물 및 소량의 환원된 프로인슐린-양 물질뿐 아니라 광범위한 펩타이드를 함유한다.

혼합물을 공지된 조건하에 다량의 요소(일반적으로 약 7M)존재하에서 처리하여 환원된 프로인슐린-양 물질의 유리 설프히드릴을 보호성 아황산 분해시킨다. 약간의 유기용매를 함유하고 전도성이 높은 생성된 오물-함입 요소-함유 혼합물은 본 발명 방법에 따라 뱃치 또는 칼럼법으로 대공극성 아크릴레이트 에스테르 공중합체에 흡착된 대표적인 물질(“불순혼합물”)이다.

상술한 바와같은 물질을 흡착시킬 때 오물-함유, 요소-함입 혼합물의 pH를 약 7 내지 약 10, 바람직하게는 약 8 내지 9로 조정하고, 생성용액을 대공극 아크릴레이트 에스테르 공중합체 수지와 접촉시킨다.

흡착 단계가 완결되면, 수지를 바람직하게 pH가 약 7 내지 8.5, 바람직하게는 약 8인 수성완충액으로 세척한다. 여러가지 완충제. 예를들어 트리스, 에틸렌디아민 등중의 어느것이든 사용할 수 있다. 선택한 완충제는 에털렌디아민이다.

수지 흡작이 완결되거나, 세척단계가 포함되는 경우 세척이 완결되면 프로인슐린-양 물질을 오물이 없는 칼럼으로부터 거의 완전히 용출시켜 순도 및 농도를 증가 시킨다. 거의 완전한 외수란 불순한 출발혼합물에 존재하는 프로인슐린-양 물질의 약 30% 내지 약 100%가 회수된 것을 의미한다. 흡착된 프로인슐린-양 물질의 용출에 필수적인 조건은 전술한 바와 같은 pH범위 및 용출 조성물이다. pH는 약 8 내지 약11, 바람직하게는 약 9.5 내지 10.5이어야 한다. 수성 용출제는 약 10% 내지 약 30%(용적비)의 아세톤, 아세토니트릴 또는 이들의 혼합물을 함유하여야 한다. 바람직하게는, 용출제중에 존재하는 아세톤 또는 아세토니트릴의 범위는 약 15% 내지 25%이다.

본 발명의 전 공정은 광범위한 온도, 예를들어 약 4℃ 내지 약 45℃에서 수행할 수 있다. 그러나, 바람직하게는 공정을 주위온도에서 수행하는 것이 편리하다.

본 발명 방법에 의해 용출물로서 수득된 유기 수용액은 오염물질, 요소 및 염이 없는 프로인슐린-양 물질을 함유하며, 대체로 대공극성 아크릴레이트 에스테르 공중합체 수지에 적용시킨 처음의 혼합물보다 순도가 높다. 생성된 프로인슐린-양 물질은 통상적인 방법으로 용출물로부터 회수할 수 있거나, 용액 그 자체를 후속공정에 사용할 수 있다.

하기 실시예로 본 발명을 제한하는 것은 아니며 더 설명하기 위한 것이다.

실시예 1--인체프로인슐린 S-설포네이트의 정제.

메쉬크기 20 내지 50인 XAD-7 수지(Rohm 및 Haas Company로부터 입수 가능)를 실온에서 6시간 아세톤 10ml/gm으로 습윤화시킨다. 수지를 차례로 0.1N NaOH 물, 0.1HCl, 물 및 100mM 에틸렌디아민(7M)요소(pH 8)로 충분히 세척한다. 마지막으로 요소세척시에 수지를 15psi의 일정 압력에 2.2×100cm의 크로마트그래프 칼럼에 충진시킨다. 충진시 칼럼에는 여러가지 크기의 수지 입자의 불균질 혼합물이 존재한다.

재조합 DNA-발현 키메라성 단백질을 함유하는 세포 용해질을 제조한다. 키메라성 단백질은 메티오닌 잔기를 통해 인체 프로인슐린의 아미노산 서열에 상응하는 서열에 결합된 아미노산의 리더 서열을 함유한다. 용해질을 우선 브롬화 시아노겐으로 처리하여 각 메티오닌 잔기에서 키메라성 단백질을 분해시킴으로써 인체 프로인슐린 서열을 가진 분자를 유리시킨 다음 아황산 분해 조건하에서 처리하여 용해질 반응 혼합물에 존재하는 각 시스테이닐 잔기를 아황산 분해시킨다.

상기에서 생성된 고체의 복합 혼합물 75mg 용액을 pH 8.5에서 7M 요소에 용해시킨다. 용액을 실온에서 유출 속도 약 30cm/시간으로 전술한 바와같은 크로마토그래프 칼럼에 적용시킨다. 칼럼에 칼럼용적 리터당 프로인슐린 S-설포네이트 1 내지 2그람에 해당되는 양의 물질을 충진시킨다.

그런 다음 pH 8.5의 10mM 에틸렌디아민 1칼럼 용적으로 세척한 후, 프로인슐린 S-설포네이트 20%의 아세톤을 함유하는 pH9.5의 20mM 에틸렌디아민으로 용출한다. 프로인슐린 S-설포네이트 90%이상의 수율로 회수되고 오물이 완전히 제거되었으며 CNBr 분해로부터 유기 오염물이 없고 요소를 포함하는 아황산 분해 시약이 없으며, 순도가 약 10배 이상이다.

실시예2--발효고체로부터 인체 프로인슐린 S-설포네이트를 정제함에 있어서의 중요한 파라메터.

실시예 1에서 기술한 바와 같이 제조한 발효 고체를 사용하여 일련의 뱃치식 정제를 수행한다. 뱃치식 정제과정에는 XAD-7 수지를 유기용매, 수성산 및 수성염기로 세척하는 단계, 및 수지를 실시예 1에 기술된 방법으로 100mM 에틸렌디아민(pH 8.5)에 습윤화시킨 슬러리로서 저장하는 단계가 포함된다. 흡차시키기전에 수지를 외부 용매가 없도록 쏟아내고 습윤성 입자로서 무게를 단다. 선정된 양의 수지에, 교반하면서 알려진 농도 및 순도의 프로인슐린 S-설포네이트를 함유하는 발효 고체를 이루어진 흡착용액을 가한다. 흡착용액의 pH, 온도, 전도도 및 용매 조성은 체계적으로 변화시킨다. 단백질 흡착의 운동학은 흡착용액을 원심분리 시킨 후 이의 부분 표본을 분석적 역상 크로마토그래피시켜 모니터 한다. 일단 목적하는 흡착을 수행한 다음 외부 흡착 용매를 따루어 낸다. 흡착된 단백질의 탈착(umloading) 흡착된 수지 각 그람당 10ml의 10mM수성 에틸렌디아민(pH 8.5)으로 세척하여 개시한다. 일단 외부 세척용매를 따루어낸 수지를 현탁시키고 탈착 용액과 함께 진탕시킨다. 탈착 용액의 용매조성 및 이의 수지에 대한 중량비를 체계적으로 변화시켜 목적하는 생성물의 순도 및 탈착 수율이 극대화 되도록 한다. 단백질의 탈착운동학은 흡착단계에서와 마찬가지로 분석적 역상 크로마토그래피로서 측정한다.

백치식 방법학을 사용하면 하기 표1 내지 5로써 특정 수지의 특성, 흡착조건 및 용출상태를 포함하는 본 발명의 방법의 여러가지 파라메터의 중요성이 입증된다.

표 1은 XAD-7, 아크릴레이트 공중합체가 폴리스티렌 수지와 비교하여 흡착속도 및 효율면에서 월등함을 나타내준다.

[표 1]

^a프로인슐린 S-설포네이트 흡착은 상층액을 역상 크로마토그래피 분석하여 측정한다.^b디비닐벤젠-폴리스티렌 공중합체.^c디비닐벤젠-아크릴레이트 에스테르 공중합체.

상기에서 알수 있는 바와같이, XAD-7-상에서는 1.5시간 후 또는 그 전에 실제적으로 모든 프로인슐린 S-설포네이트가 흡착되지만 대부분의 폴리스티렌 수지의 경우 상응하는 수준에 달하려면 3배의 시간이 걸린다.

표 2는 본 발명에 따른 칼럼 흡착에 유용한 pH 및 온도조건을 기술한 것이다.

[표 2]

확실한 흡착이 약 7이하의 pH에서 일어날 수 있으나, 이런 현상은 예상외로 경우에 따라 칼럼으로부터의 생성물 용출을 어렵게 하는 상태를 초래한다.

표 3은 적절히 흡착된 칼럼으로부터 생성물을 용출하기 위한 임계 pH의 선택 및 조정에 관한 것이다.

[표 3]

^a탈착조건 : CNBr-처리한 재조합 DNA발효 용해질을 아황산분해시켜 수득한 아황산 분해 반응용액을 사용하여 최대량의 프로인슐린 S-설로테이트를 흡착시킨 수지 1g에 아세토 30%를 함유하는 여러가지 pH의 수성 완충액 5ml를 4℃에서 가한다.^b10mM 암모늄 포스페이트 수성-아세톤 완충액.^c10mM 에틸렌디아민 수성-아세톤 완충액.

표 4는 생성물 탈착에 사용되는 유기용매의 선택의 중요성을 기술한 것이다.

[표 4]

^a탈착조건 : CNBr-처리한 재조합 DNA발효 용해질을 아황산분해시켜 수득한 아황산 분해 반응용액을 사용하여 최대량의 프로인슐린 S-설포네이트를 흡착시킨 수지 1g에 수성용매중의 유기성이 30%인 10mM에틸렌디아민(pH 9.0)6ml를 4℃에서 가한다.

표 5는 유기용매 농도 범위의 중요성을 기술한 것이다.

[표 5]

^a탈착조건 : 표4에 기술한 바와 동일하나, 단, 완충액의 pH를 10.5로 증가시킨다. 상술한 탈착율은 비-칼럼식(뱃치식)방법론으로 수득할 수 있는 최대치를 나타낸다.

Claims (10)

1. 프로인슐린-양 물질을 함유하는 불순 혼합물을 pH 약 7 내지 약 10에서 역상 대공극성 아크릴레이트 에스테르 공중합체 수지 지지체에 적용시킨 다음 : 이 지지체로부터 아세톤, 아세토니트릴, 및 아세톤과 아세토니트릴의 혼합물중에서 선태한 유기 희석제 약 10용적% 내지 약 30용적%를 함유하는 pH 약 8 내지 11의 수성 용출제를 사용하여 프로인슐린-양 물질을 용출시킴을 특징으로 하여, 프로인슐린-양 물질을 함유하는 불순 혼합물로부터 불순물을 분리시키는 방법.
2. 제1항에 있어서, 프로인슐린-양 물질이 인체 프로인슐린의 아미노산 서열에 상응하는 서열을 갖는 방법.
3. 제2항에 있어서, 프로인슐린-양 물질이 프로인슐린에 대한 전구체인 방법.
4. 제3항에 있어서, 프로인슐린-양 물질이 프로인슐린 S-설포네이트인 방법.
5. 제1 내지 4항중 어느 한 항에 있어서, 대공극성 아크릴레이트 에스테르 공중합체 지지체가 XAD-7 또는 XAD-8인 방법.
6. 제5항에 있어서, 프로인슐린-양 물질을 함유하는 불순 혼합물을 뱃치 조건하에서 처리하는 방법.
7. 제5항에 있어서, 프로인슐린-양 물질을 함유하는 불순 혼합물을 크로마토그래피 칼럼 조건하에서 처리하는 방법.
8. 제5항에 있어서, 프로인슐린-양 물질을 함유하는 불순 혼합물을 pH 약 8 내지 9에서 대공극성 아크릴레이트 에스테르공중합체 지지체에 적용시키는 방법.
9. 제8항에 있어서, 불순 혼합물을 지지체에 적용시킨 후, 용출시키기 전에 지지체를 pH 약 7 내지 8.5의 수성 완충액으로 세척하는 방법.
10. 제9항에 있어서, 프로인슐린-양 물질을 pH 약 9.5 내지 약 10.5의 수성용출제를 사용하여 지지체로부터 용출시키는 방법.