CS260642B1 - Způsob výroby etbylamidu lO desGly, 6-D-Tle LH-RH - Google Patents

Abstract

Řešení se týká způsobu výroby ethylamidu 10-desGly,6-D-Tle LH-RH vzorce I Glu—His—Trp—Ser—Tyr—D—Tle—Leu— —Arg—Pro—iNHEt (I) metodou v pevné fázi na polystyrénovém nosiči zesífovaném 1% divinylbenzenu. Podstata spočívá v tom, že se na chlormethylovaný nosič funkcionalizovaný ethylaminem zakotví karboxyterminální aminokyselina prolin a postupnou kondenzací se vystaví peptidový řetězec. Peptid se odštěpí z pryskyřice dvoufázovým působením kapalného» fluorovodíku v» přítomnosti organických sloučenin typů p-kresol, p-thiokresol a dimethylsulfid, které omezují nežádoucí vedlejší reakce. Zároveň se z peptidu odštěpí všechny chránící skupiny. Surový peptid se přečistí vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií. Získáme tak ve vysokém výtěžku velmi čistý produkt, přímo použitelný jako regulátor řízené reprodukce Skotu.

Description

Vynález se týká způsobu výroby ethylamidu 10-desGly,6-D-Tle LH-RH vzorce I

Glu—His—Trp—Ser—Tyr—D—Tle—Leu— —Arg—Pro—NHEt (I)

Látka slouží ve veterinární medicíně při řízené reprodukci skotu. V současné době se výroba ethylamidu 10-desGly,6-D-Tle LH-RH provádí metodou syntézy peptidu v roztoku podle čs. AO č. 230 614 z 25. 4. 1984. Tato- výroba má všechny nevýhody klasické metody syntézy v roztoku, a to vysokou pracnost, vyšší nároky na suroviny a energii a je značně zdlouhavá.

(Nevýhody této metody odstraňuje způsob výroby 10-desGly,6-D-Tle LH-RH vzorce I metodou v pevné fázi na polystyrénovém nosiči zesíťovaném 1% divinylbenzenu, jehož podstata spočívá v tom, že se na chlormethylovaný nosič fukcionalizovaný ethylaminem zakotví karboxyterminální aminokyselina prolin a postupnou kondenzací se vystaví peptidový řetězec, načež se v jednom stupni odštěpí současně peptid z nosiče a všechny chánicí skupiny z peptidu fluorovodíkem v přítomnosti organických látek typu p-kresol, p-thiokresol a dimethylsulfid, získaný produkt se přečistí vysokoúčinnóu kapalinovou chromatografií.

Jako polymerní nosič byl použit polystyrén síťovaný 1 % DVB s funkčním} chlormethylovými skupinami. Chlormethylové skupiny byly transformovány ethylaminem na NEAM skupiny. Postupnou kondenzací byly připojeny chráněné aminokyseliny. a-aminoskupiny aminokyselin byly přechodně chráněny Boc skupinou a v každém cyklu byla Boc skupina odštěpena acldolyticky roztokem TFA. Po připojení poslední aminokyseliny byl odštěpen současně peptid z pryskyřice a chránící skupiny postranních řetězců působením dvoufázového štěpení kapalným HF.

V první fázi bylo použito 25 % obj. kapalného HF, 65 °/o obj. DMS, 2,5 % obj. p-thiokresolu a 7,5 % obj. p-kresolu, v druhé fázi bylo použito 90 % obj. HF, 2,5 % obj. p-thlokresolu a 7,5 % p-kresolu.

Přítomnost látek p-thiokresolu, p-kresolu a DMS je nezbytně nutná, protože při odštěpování chránících skupin postranních řetězců omezují nežádoucí vedlejší reakce. Lyofilizovaný surový produkt byl přečištěn vysckoúčinnou kapalinovou chromatografií. Čistý produkt byl charakterizován aminokyselinovou analýzou a srovnávací chromatografií.

Způsob podle vynálezu přináší oproti dosavadnímu postupu úsporu surovin, času a zjednodušuje syntézu žádaného produktu.

Způsob podle vynálezu byl s úspěchem ověřen v praxi. Následující příklady provedení způsob podle vynálezu dokumentují, ale nijak neomezují.

Příklad 1

Polystyrénová pryskyřice (2 g, 0,8 mmolu Cl/g, sítěná 1 % DVB) se smísí s 10 ml ethylaminu a ponechá se dva dny reagovat při teplotě 4 °C·

Po odstranění ethylaminu se pryskyřice promyje MeOH, DCM a znovu MeOH. Získaná NEAM pryskyřice byla vysušena a byl stanoven obsah volných aminoskupin pikrovým testem a elementární analýzou na 0,7 mmolu N/g. Pryskyřice byla umístěna do reaktoru a byly provedeny jednotlivé kondenzace těchto chráněných aminokyselin:

Boc—Pro,

Boc—Arg(TOS),

Boc—Leu,

Boc—D—Tle,

Boc—Tyr (Z J,

Boc—Ser(Bzl),

Boc—Trp(For),

Boc—His(Boc) a kyseliny pyroglutamové, cykly s následujícími syntetickými kroky:

min

1. štěpení Boc-skupiny 1X5

50% obj. TFA v DCM a

X 30

2. promývání DCM 3X1

3. neutralizace 5% obj. DIE A v CHCb 1X2

4. promývání DCM 2X1

5. neutralizace 5% obj. DIEA v CHCb 1X2

6. promývání DCM 3X1

7. promývání DMF 2X1

8. připojení aktivované chráněné aminokyseliny roztok 4,5 mmolu HOBt esteru v 30 ml DMF 1 X 45

9. promytí MeOH 2X1

10. promytí DCM 3X1

Po připojení aminokyseliny (krok 8) byl proveden test na přítomnost volných aminoskupin. V případě pozitivního výsledku byla prodloužena reakční doba, příp. byly opakovány kroky 8 až 10. Pro připojení první aminokyseliny Boc—Pro není nutné štěpit Bcc-skupinu z pryskyřice a proto cyklus začínal krokem 2.

Po ukončení syntézy byla promyta pryskyřice MeOH a bylo získáno 3,5 g suché peptidyl-pryskyřice. Jeden gram této pryskyřice byl podroben dvoufázovému štěpení HF. V první fázi bylo použito: 0,75 g p-kresolu, 0,25 g p-thiokresolu, 6,5 ml DMS a 2,5 mililitru HF. Štěpící směs byla 2 h míchána při teplotě 0 °C, HF a DMS byl odpařen a bylo· přikondenzováno 9 ml HF. V této druhé fázi byla směs míchána 4 h při teplotě

0 5 °C. Po oddestilování HF byly kresoly extrahovány suchým ethylacetátem a peptid byl rozpuštěn v 50% obj. kyselině octové. Lyofilizací roztoku bylo získáno 200 mg surového peptidu. Tento -byl čištěn vysokoúčinnou kapalinovou chromatografii na silikagelovém sorbentu s navázanými hydrofóhními uhlíkatými zbytky (kolona 130 X 26 milimetrů, složení mobilní fáze 55 % obj. MeOH ve vodě s 0,1 % obj. TFAj. Aminokyselinová analýza:

Pro 0,99,

Arg 1,03,

Leu 0,97,

D—Tle 0,92,

Tyr 0,99,

Ser 0,86,

Trp 1,03,

His 0,94,

Glu 1,09.

Obsah stanovený kvantitativní aminokyselinovou analýzou 76,3% peptidu (přepočteno na Leu). Čistota stanovena vysokoúčinnou kapalinovou chromatografii byla 96%. Výtěžek byl 110 mg Glu—His—Trp— —Ser—Tyr—D—Tle—Leu—Arg—Pro—NHEt.

Příklad 2

NEAM pryskyřice (250 mg; 0,7 mmolu N/ /g) byla umístěna do průtočného polypropylenového reaktoru (40 X 8 mm, vnitřní objem 1,4 ml). Reaktorem byly protlačovány činidla a promývací rozpouštědla mírným přetlakem dusíku následujícími promývacími cykly:

1. štěpení Boc-skupiny

10% obj. kyselinou sírovou v dioxanu 60 min

2. promývání DCM do neutrálního pH eluentu 5 min

3. neutralizace 5% obj. roztokem

DIEA v CHC13 3 min

4. promývání DCM do· neutrálního pH eluentu 5 min

5. připojení aktivované chráněné aminokyseliny trojnásobným přebytkem

HOBt esteru v DMF 30 min

Byly připojeny aminokyseliny:

Boc—Pro,

Boc—Arg(TOS),

Boc—Leu,

Boc—D—Tle,

Boc—Tyr (Z),

Boc—Ser(Bzl),

Boc—Trp(For),

Boc—His (Boc j a kyselina pyroglutamová.

Po skončení každého cyklu byl proveden test na volné aminoskupiny. V případě pozitivního testu bylo přidáno do aktivní komponenty katalytické množství DMAP a bylo pokračováno v protlačování reaktorem až do negativního testu. Peptid byl odštěpen z pryskyřice a přečištěn, jak je popsáno v příkladu 1.

Příklad 3

Postupem podle příkladu 1 byl přípraven žádaný produkt ve vyhovující čistotě. Pouze v prvním kroku bylo vyměněno štěpící činidlo. Místo 50% obj. roztoku TFA v DCM byl použit nasycený roztok chlorovodíku v

Claims (1)

1. PŘEDMĚT

   Způsob výroby ethylamidu 10-desGly,6-D-Tle LH-RH vzorce I

   Glu—His—Trp—Ser—Tyr—D—Tle—Leu— —Arg—Pro—iNHEt (I) metodou v pevné fázi na polystyrénovém nosiči síťovaném 1 % divinylbenzenu vyznačující se tím, že se na chlormethylovaný nosič fukcionalizovaný ethylaminem zakotví karboxytermlnální aminokyselina prolin a postupnou kondenzací se vystaví peptidový řetězec, načež se v jednom stupni odštěpí současně peptid z nosiče a všechny chránící skupiny z peptidu fluorovodíkem v přítomnosti organických sloučenin typu p-thiokresol, p-kresol a dimethylsulfid a získaný produkt se přečistí vysokoúčinnou kapalinovou chromatografii.