DE3688712T2

DE3688712T2 - Reinigung von Proinsulinstoffen.

Info

Publication number: DE3688712T2
Application number: DE86302461T
Authority: DE
Inventors: Richard Dennis Dimarchi
Original assignee: Eli Lilly and Co
Current assignee: Eli Lilly and Co
Priority date: 1985-04-08
Filing date: 1986-04-03
Publication date: 1993-11-25
Anticipated expiration: 2006-04-04
Also published as: DE3688712D1; HUT40680A; IE860887L; ATE91690T1; CA1284249C; EP0197764A3; AU5565586A; EP0197764B1; HU205138B; EP0197764A2; IL78373A; IE60570B1; DK173414B1; KR860008277A; DK150586A; US4616078A; IL78373A0; JPS61236796A; JPH0796559B2; DK150586D0

Description

Proteine sind Biopolymere, bei denen es von der strukturellen Stabilität abhängt, ob sie ihre spezifische Funktion ausüben können. Da eine geringe Veränderung in der Lösemittelzusammensetzung, im pH, in der Temperatur und in der Salzkonzentration oft eine drastische und manchmal irreversible Veränderung in der Proteinkonformation bewirkt, wurde idealerweise eine chromatographische Proteinreinigung unter Verwendung von Harzen durchgeführt, die minimale unspezifische, denaturierende Wechselwirkung zeigen. Im klassischen Sinn waren solche Harze extrem hydrophil mit einem Wassergehalt von oft mehr als 80 %. Aufgrund ihrer hydrophilen Natur können die Harzpartikel auch schon unter moderatem Rückdruck sehr leicht kollabieren. Zusätzlich kann jede unspezifische Adsorption schwierig zu entfernen sein, da es unmöglich ist, diese hydrophilen Harze mit organischen Lösemitteln zu waschen. Aus diesem Grund ist man im ersten Schritt der präparativen Reinigung von Proteinen aus heterogenen, natürlichen Quellen mit einem Problem konfrontiert. Die aufgrund ihrer hydrophilen Natur beliebteren Träger sind zur schnellen Reinigung aus viskosen, schlammbeladenen, natürlichen Produktgemischen ungeeignet. Daher war die Verwendung nicht-chromatographischer Verfahren zur anfänglichen Reinigung mit einem beträchtlichen, zusätzlichen Aufwand notwendig.
AmberliteR XAD Harze sind polymere makroretikulare Adsorbentien, die kommerziell von der Rohm and Haas Company hergestellt werden. Diese Harze sind für die auf verschiedene Affinitäten für eine polymere hydrophobe Oberfläche basierende Trennung von Verbindungen entwickelt worden. Da Harze vom XAD Typ (1) eine große Partikelgröße (20-50 mesh) aufweisen und (2) extrem hydrophob sind, würde jede Verwendung solcher Harze zur Chromatographie von komplexen biologischen Gemischen strukturell ähnlicher Peptide und Proteine überraschen. In der Tat existieren keine Berichte, die die Verfahrensparameter dieser Träger bei der Proteinreinigung beschreiben. Überraschenderweise machen die zwei vorher beschriebenen Eigenschaften der Harze vom XAD Typ sie jedoch ausnahmsweise für die anfänglichen Reinigungsschritte von extrem unreinen, schlammbeladenen Gemischen wirkungsvoll, die sowohl strukturell unterschiedliche als auch strukturell ähnliche Proteine enthalten. Man würde korrekterweise erwarten, daß die groben und heterogenen Partikelgrößen der Harze vom XAD Typ die chromatographische Wirkung im wesentlichen wegen der langsamen und ungleichen Wechselwirkungsdynamik vermindern würden. Aus diesem Grund würde man die Verwendung solcher Harze zur Protein- und Polypeptidreinigung vermeiden. Überraschenderweise wurde gefunden, daß dieser scheinbare Mangel trotzdem für Reinigungszwecke vorteilhaft ist, falls das Harz unter präzis definierten Bedingungen bei extrem unreinen, schlammbeladenen Materialien angewendet wird, die proinsulinähnliches Material enthalten.
Darüberhinaus ist bei der Reinigung von proinsulinähnlichem Material von zusätzlicher praktischer Bedeutung, daß Harze vom XAD Typ (1) bei mäßigen Kosten leicht erhältlich sind, (2) vollkommen stabil über den pH Bereich von 1-13 sind und (3) einer Regeneration in einer Säule mit wäßrigen Detergenzien und organischen Lösemitteln unterworfen werden können.
Die Literatur schreibt den Harzen vom XAD Typ außer in einer allgemeinen Weise keine Verwendung in der Reinigung von Proteinen und Polypeptiden zu. D. J. Pietrzyk und J. D. Stodola, Anal. Chem. 53, 1822-1828 (1981) waren die ersten, die analytisch XAD-4, ein Copolymer von Polystyrol-Divinylbenzol, auf die Verwendbarkeit mit synthetischen Dipeptiden untersuchten. Eine weitere Studie D. J. Pietrzyk, W. J. Cahill und J. D. Stodola, J. Liquid Chrom. 5, 443 461 (1982) mit synthetischen Peptiden, die genauso lang waren wie fünf Reste, zeigte die Möglichkeit J eine ausreichend effiziente präparative Reinigung auf XAD-4 Harz zu erreichen, das zuerst zermahlen und auf die Größe von wesentlich kleineren Partikeln gebracht worden ist. Da diese Studien die Chromatographie von kleinen Peptiden auf großporigen hydrophoben Harzen zeigte, sprachen sie die Frage nicht an, ob Gemische von wesentlich größeren und weit komplexeren Proteinen wirksam aus extrem unreinen Gemischen unter Verwendung großpartikulärer Träger abgetrennt werden können.
Diese Schwierigkeiten der Reinigung von Proteinen aus extrem unreinen Quellen traten besonders mit dem Aufkommen der rekombinanten DNA Technologie auf und deren Verwendung bei der kommerziellen Herstellung von Peptiden und Proteinen. Jede kommerziell ausgerichtete Expression eines Produkts durch rekombinante DNA Methoden bedarf auch der Isolierung des von der rekombinanten DNA stammenden Produkts aus den Verunreinigungen, die in der ursprünglichen Fermentationsbrühe wie auch in den Gemischen enthalten sind, die von nachträglichen chemischen Behandlungen und/oder anderen Behandlungen stammen. Der Bedarf an neuen Proteinreinigungstechniken im kommerziellen Maßstab wurde daher ein entscheidendes Anliegen.
Ein zusätzlich komplizierender Faktor bei der Reinigung von Proteinen, die von rekombinanter DNA stammen, ergibt sich durch das Vorkommen von Cysteinylresten in vielen dieser Proteine. In den meisten Fällen müssen die Sulfhydrylgruppen der Cysteine nach der rekombinanten Expression von cysteinhaltigen Proteinen vor Beginn jeder Proteinreinigung reversibel geschützt werden, im allgemeinen durch Umwandlung in die S-Sulfonate. Diese Umwandlung führt notwendigerweise zur Bildung von zusätzlichen Mengen an unerwünschten schlammigen Verunreinigungen in der Gegenwart hoch viskoser, denaturierender Mittel, von denen das gewünschte Protein zuerst abgetrennt werden muß.
Als Beispiel ist Insulin aus rekombinanten DNA-Quellen allgemein über einen von zwei Wegen zugänglich. Bei einem Weg werden die Insulin A-Kette und die Insulin B-Kette getrennt exprimiert und isoliert und die Ketten dann chemisch unter Bildung von Insulin kombiniert. Beim anderen Weg wird ein geradkettiger Proinsulinvorläufer exprimiert und isoliert. Das Produkt wird dann oxidativ zu Proinsulin renaturiert und das Proinsulin wird dann enzymatisch in Insulin umgewandelt.
Beide Mittel zur Herstellung von rekombinantem Insulin beinhalten eine ähnliche Abfolge von chemischer Umwandlung und Reinigung, die entweder zum Insulin-A-Ketten-S-Sulfonat und Insulin- B-Ketten-S-Sulfonat führt, die zur Kombination zum Insulin bereit sind, oder die zu Proinsulin-S-Sulfonat führt, das zum Wechseln der Disulfidbrücken unter Bildung von Proinsulin bereit ist.
Jedes der drei S-Sulfonate, die Insulin A-Kette, die Insulin B-Kette oder das Proinsulin werden im allgemeinen durch die folgende Abfolge erhalten:
(1) Expression des die gewünschte Peptidsequenz enthaltenden Produkts, das an seinem Aminoterminus über einen Methionylrest mit einer fremden Peptidsequenz verbunden ist.
(2) Abspaltung der gewünschten Sequenz vom fremden Teil mittels Cyanogenbromid, und
(3) Sulfitolyse der Peptidcysteinthiole unter Bildung der entsprechenden S-Sulfonate.
Um Verfahren dieses Typs kommerziell durchführbar zu machen, ist es notwendig Methoden zu finden, die die Entfernung von Schlamm, Salz, organischen Lösemitteln und anderen Verunreinigungen vom gewünschten Produkt erlauben (ob ein solches Produkt das Endprodukt oder ein auftretendes Zwischenprodukt ist) mit geringem oder keinem Verlust dieses Produkts.
Ein sehr vorteilhaftes Verfahren wurde zur Steigerung der Reinheit von proinsulinähnlichem Material aus extrem unreinen Quellen hiervon gefunden, insbesondere jene über rekombinante DNA Methoden erhaltenen. Das Verfahren beinhaltet, daß das unreine Ausgangsmaterial einer Umkehrphasenreinigung auf einem großporigen Träger aus Acrylatestercopolymerharz unterzogen wird.
Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zur Abtrennung von Verunreinigungen aus einem Proinsulin ähnliches Material enthaltendem unreinen Gemisch mit im wesentlichen vollständiger Gewinnung dieses proinsulinähnlichen Materials geliefert, das gekennzeichnet ist durch:
(1) Aufbringen dieses Gemisches auf einen großporigen Träger aus einem Acrylatestercopolymerharz mit Umkehrphase bei einem pH von etwa 7 bis etwa 10, und
(2) Eluieren dieses proinsulinähnlichen Materials vom Träger mit einem wäßrigen Eluenten, der einen pH von etwa 8 bis etwa 11 aufweist und etwa 10 Volumenprozent bis etwa 30 Volumenprozent eines organischen Verdünnungsmittels enthält, ausgewählt aus der Gruppe Aceton, Acetonitril und einer Kombination von Aceton und Acetonitril.
Wie erwähnt, richtet sich das erfindungsgemäße Verfahren auf die Reinigung von extrem unreinen Gemischen, die proinsulinähnliches Material enthalten. Der Ausdruck "proinsulinähnliches Material" bedeutet (1) Proinsulin selbst irgendeiner Art, beispielsweise vom Menschen, vom Rind oder vom Schwein, (2) Vorläufer von Proinsulin, wie reduziertes (-SH) Proinsulin und S-geschütztes Proinsulin, beispielsweise Proinsulin-S-Sulfonat, (3) Derivate von Proinsulin oder seinen Vorläufern, beispielsweise Strukturen, die modifiziert wurden, um die A-Kette, die B-Kette, das C-Peptid oder eine Kombination von jedem der drei zu verlängern und/oder zu verkürzen und (4) Analoga von Proinsulin oder dessen Vorläufer, beispielsweise Strukturen, in denen die Proinsulinaminosäuresequenz durch Ersetzen von einem oder mehreren Aminosäureresten modifiziert wurde.
Das erfindungsgemäße Verfahren beinhaltet die Verwendung eines großporigen Acrylatestercopolymerharzes als chromatographischen Träger. Solche Copolymerharzadsorbentien sind Fachleuten gut bekannt. Zwei dieser zum Zweck der Erfindung in hohem Male geeignete Träger sind bei der Rohm and Haas Company erhältlich und tragen die Bezeichnung XAD-7 und XAD-8. Von den beiden ist insbesondere XAD-7 für die erfindungsgemäßen Zwecke vorzuziehen.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann in drei chromatographische Schritte oder Stufen eingeteilt werden. Davon werden jedoch nur zwei benötigt. Daher muß das Verfahren einen Beladungs- und einen Desorptionsschritt beinhalten und es kann einen dazwischenliegenden Waschschritt beinhalten und dieser wird auch bevorzugt. Darüberhinaus kann das Verfahren entweder im Batch- oder Säulenverfahren ausgeführt werden, obwohl es wegen der Effizienz der Reinigung stark bevorzugt ist, das Verfahren unter Säulenbedingungen durchzuführen. Ob das erfindungsgemäße Verfahren mittels Batch- oder Säulenmodus ausgeführt wird, bleiben die Bedingungen unverändert, die zum Erfolg wesentlich sind und die die Grundlage der vorliegenden Erfindung bilden.
Das komplexe Proinsulin enthaltende Material, das im erfindungsgemäßen Beladungsschritt verwendet wird, wird im allgemeinen als Ergebnis einer Abfolge von vorangehenden Schritten erhalten und resultiert letztlich aus einer Expression durch rekombinante DNA Methodik. Üblicherweise wird ein Produkt exprimiert, das eine Aminosäuresequenz enthält, die zumindest teilweise der von Proinsulin oder eines Derivats oder Analogons hiervon entspricht. Das Expressionsprodukt wird normalerweise eine selektive Spaltstelle enthalten, die es erlaubt, proinsulinähnliches Material chemisch oder enzymatisch aus dem längerkettigen Expressionsprodukt zu erzeugen. Im allgemeinen besteht die spezifische Spaltstelle aus einem Methioninrest und die Spaltung am Carboxyterminus eines solchen Rests wird effizient unter Verwendung von Cyanogenbromid und gut bekannten Bedingungen ausgeführt. Das resultierende unreine Gemisch aus der Fermentation wird nach der CNBr-Spaltung eine große Vielzahl an Peptiden zusammen mit einem begleitenden komplexen Gemisch aus Schlamm und anderen Materialien und, relativ gesehen, geringen Mengen von reduziertem proinsulinähnlichem Material enthalten.
Das Gemisch wird dann üblicherweise unter bekannten Bedingungen in Gegenwart von großen Mengen Harnstoff (im allgemeinen etwa 7 M) behandelt, um eine schützende Sulfitolyse der freien Sulfhydrylgruppen des reduzierten proinsulinähnlichen Materials zu bewirken. Das entstehende schlammbeladene, Harnstoff enthaltende Gemisch, das bemerkenswerte Mengen an organischen Lösemitteln enthält und eine hohe Leitfähigkeit zeigt, stellt das typische Material dar ("unreines Gemisch"), das auf das großporige Acrylatestercopolymer im Batch- oder Säulenmodus gemäß dem Verfahren der Erfindung aufgetragen wird.
Wenn man das Material der oben beschriebenen Art aufträgt, wird der pH des schlammbeladenen, harnstoffenthaltenden Gemisches in einen Bereich von etwa 7 bis etwa 10 , vorzugsweise von etwa 8 bis etwa 9 eingestellt und die entstehende Lösung wird mit dem großporigen Acrylatestercopolymerharz zusammengebracht.
Nach Vervollständigung des Beladungsschritts wird das Harz vorzugsweise mit wäßrigem Puffer mit einem pH von etwa 7 bis etwa 8, 5, vorzugsweise etwa 8, gewaschen. Jedes einer großen Vielzahl von puffernden Mitteln kann verwendet werden, einschließlich beispielsweise Tris, Ethylendiamin und dergleichen. Ein pufferndes Mittel der Wahl ist Ethylendiamin.
Nach Vervollständigung der Beladung des Harzes oder des Waschens, falls ein solcher Schritt einbezogen ist, wird das proinsulinähnliche Material wirksam und vollständig schlammfrei und in wesentlich gesteigerter Reinheit und Konzentration von der Säule eluiert. Eine im wesentlichen vollständige Wiedergewinnung bedeutet einen Erhalt von etwa 30 % bis etwa 100 % des im unreinen Ausgangsgemisch vorhandenen, proinsulinähnlichen Materials. Die obligatorischen Bedingungen der Elution des adsorbierten proinsulinähnlichen Materials in der Praxis sind der vorgeschriebene pH Bereich und die Zusammensetzung des Eluenten. Der pH muß im Bereich von etwa 8 bis etwa 11 und vorzugsweise von etwa 9,5 bis etwa 10, 5 liegen. Der wäßrige Eluent muß auf Volumenbasis etwa 10 % bis etwa 30 % Aceton, Acetonitril oder eine Kombination der beiden enthalten. Vorzugsweise beträgt der im Eluenten vorhandene Gehalt von Aceton oder Acetonitril etwa 15 % bis etwa 25 %.
Das gesamte erfindungsgemäße Verfahren kann über einen weiten Bereich von Temperaturen, beispielsweise irgendwo von etwa 4ºC bis etwa 45ºC ausgeführt werden. Jedoch wird der Prozeß vorzugsweise und der Einfachheit halber bei Umgebungstemperaturen durchgeführt.
Die als Eluat aus dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltene wäßrig-organische Lösung enthält proinsulinähnliches Material frei von kontaminierendem Schlamm, Harnstoff und Salz und von wesentlich höherer Reinheit, als das, auf das großporige Acrylatestercopolymerharz aufgetragene, ursprüngliche Gemisch. Das entstehende proinsulinähnliche Material kann aus dem Eluat durch Routinetechniken gewonnen werden, oder die Lösung an sich kann zur weiteren Umwandlung des Materials verwendet werden.
Die folgenden nicht-beschränkend wirkenden Beispiele dienen der weiteren Verdeutlichung der Erfindung.

Beispiel 1 - Reinigung von humanem Proinsulin-S-Sulfonat

XAD-7 Harz mit einer Größe von 20-50 mesh (erhältlich von der Rohm and Haas Company) wird mit Aceton bei 10 ml/g für 6 Stunden bei Raumtemperatur eingeweicht. Das Harz wird dann extensiv und nacheinander mit Aceton, 0, 1 N NaOH, Wasser, 0, 1 N HCl, Wasser und 100 mM Ethylendiamin/7 M Harnstoff pH 8,0 gewaschen. Das Harz wird während des letzten Harnstoffwaschschritts in eine 2,2 · 100 cm Chromatographiesäule bei einem konstanten Druck von 15 psi gepackt. Nach dem Packen zeigt die Säule eine homogene Mischung der verschieden großen Harzpartikel.
Ein Zellysat wird hergestellt, das ein von einer rekombinanten DNA exprimiertes chimeres Protein enthält. Das chimäre Protein enthält eine vorangehende Sequenz von Aminosäuren, die über einen Methioninrest mit einer Aminosäuresequenz verbunden ist, die der von humanem Proinsulin entspricht. Das Lysat wird zuerst mit Cyanogenbromid behandelt, um eine Spaltung des chimären Proteins an jedem Methioninrest zu bewirken und dabei ein die Sequenz von humanem Proinsulin tragendes Molekül freizusetzen und dann wird das Lysat unter sulfitolysierenden Bedingungen behandelt, um jeden im Lysatgemisch vorkommenden Cysteinylrest zu sulfitolysieren.
Eine Lösung von 75 mg des aus den obigen Schritten resultierenden komplexen Feststoffgemisches wird in 7 M Harnstoff bei pH 8,5 gelöst. Die Lösung wird auf die vorher beschriebene Chromatographiesäule bei Raumtemperatur mit eine Flußrate von 30 cm/Stunde aufgetragen. Die Säule wird mit einer Materialmenge beladen, die 1-2 g Proinsulin-S-Sulfonat pro Liter Säulenvolumen entspricht.
Die Säule wird mit einem Säulenvolumen 10 mM Ethylendiamin pH 8,5 gewaschen und danach wird das Proinsulin-S-Sulfonat mit 20 mM Ethylendiamin pH 9,5 mit 20 % Aceton eluiert. Das Proinsulin-S- Sulfonat wird in einer Ausbeute größer als 90 % gewonnen, vollständig vom Schlamm befreit, von organischen Kontaminationen aus der CNBr Spaltung befreit, von den Sulfitolysereagenzien, einschließlich Harnstoff, befreit, und der Reinheitsgrad ist ungefähr zehnfach höher.

Beispiel 2 - Wichtige Parameter in der Reinigung von humanem Proinsulin-S-Sulfonat aus Fermetationsfeststoffen

Unter Verwendung von wie im Beispiel 1 beschriebenen Fermentationsfeststoffen wird eine Serie von Batch-Reinigungen ausgeführt. Das Verfahren für die Batch-Reinigung beinhaltet das Waschen des XAD-7 Harzes mit organischen Lösemitteln, wäßriger Säure und wäßriger Base und dessen Aufbewahrung als befeuchteter Brei in 10 mM Ethylendiamin pH 8, 5 in einer in Beispiel 1 beschrieben Weise. Vor der Beladung wird überschüssiges Lösemittel vom Harz abgegossen und dieses als nasses Teil gewogen. Zu einer vorbestimmten Harzmenge wird unter sanftem Schütteln eine Beladungslösung gegeben, die aus Proinsulin-S-Sulfonat in bekannter Konzentration und Reinheit enthaltenden Fermentationsfeststoffen besteht. Der pH, die Temperatur, die Leitfähigkeit und die Lösemittelzusammensetzung der Beladungslösung werden systematisch verändert. Die Kinetiken der Proteinadsorption werden durch analytische Umkehrphasenchromatographie nach Zentrifugation eines Aliquots der Beladungslösung verfolgt. Wenn einmal die gewünschte Beladung erreicht wurde, wird vom Harz überschüssiges Beladungslösemittel abgegossen. Das Ablösen des adsorbierten Proteins wird durch Waschen jedes Gramms des beladenen Harzes mit 10 ml 10 mM wäßrigem Ethylendiamin bei pH 8, 5 eingeleitet. Das durch einmaliges Abgießen von überschüssigem Waschlösemittel befreite Harz wird mit der Ablöselösung suspendiert und geschüttelt. Die Lösemittelzusammensetzung der Ablöselösung und deren Verhältnis zum Harzgewicht wird systematisch verändert, um die Entladungsausbeute und die Reinheit des gewünschten Produkts zu maximieren. Die Ablösungskinetiken des Proteins werden wie bei der Beladung durch analytische Umkehrphasenchromatographie bestimmt.
Unter Verwendung der Batch-Methode zeigen die folgenden Tabellen 1 bis 5 die Bedeutung einer Vielzahl von erfindungsgemäßen Verfahrensparametern, einschließlich der Merkmale des bestimmten Harzes, die Beladungsbedingungen und die Elutionsbedingungen.
Die Tabelle 1 zeigt, daß XAD-7, ein Acrylatcopolymer, in der Beladungsrate und Beladungseffizienz günstiger ist, wenn es mit verwandten Polystyrolharzen verglichen wird. Tabelle 1 Harzauswahl Zeit Stunden Prozent adsorbiertes a Proinsulin-S-sulfonat a Proinsulin-S-Sulfonatadsorption, bestimmt durch umkehrphasenchromatographische Analyse des Überstands b Divinylbenzol-Polystyrolcopolymer c Divinylbenzol-Acrylatestercopolymer
Wie oben erwähnt, wird nach 1,5 Stunden oder weniger im wesentlichen das ganze Proinsulin-S-Sulfonat an XAD-7 adsorbiert, während das beste der Polystyrolharze dreimal so lang braucht, um eine vergleichbare Menge zu erreichen.
Die Tabelle 2 zeigt einige der zur erfindungsgemäßen Säulenbeladung brauchbaren pH und Temperaturbedingungen. Tabelle 2 Menge an auf XAD-7 geladenes Proinsulin-S-Sulfonat: Temperatur und pH Effekt Zeit Stunden Prozent adsorbiertes Proinsulin-S-sulfonat pH (bei 25ºC) Temp. ºC (bei pH 8)
Obwohl eine offensichtliche Beladung bei einem pH kleiner als etwa 7 auftritt, führt das Phänomen unerwarteterweise zu einem Zustand, der es extrem erschwert, wenn nicht unmöglich macht, das Produkt von der Säule zu eluieren.
Die Tabelle 3 zeigt, wie kritisch die pH Wahl und die pH Kontrolle zur Elution des Produkts von der ordnungsgemäß beladenen Säule ist. Tabelle 3 Menge des abgelösten Proinsulin-S-Sulfonats: pH Effekt Zeit Stunden a Desorptionsbedingungen: Zu einem Gramm Harz, das mit einer maximalen Menge von Proinsulin-S-Sulfonat unter Verwendung der Sulfitolysereaktionslösung beladen wurde, die durch Sulfitolyse eines CNBr-behandelten, rekombinanten DNA Fermentationslysats erhalten wird, werden bei 4ºC 5 ml des wäßrigen, 30 % Aceton enthaltenden, Puffers mit verschiedenem pH gegeben. b 10 mM wäßriger Ammoniumphosphat-Aceton Puffer c 10 mM wäßriger Ethylendiamin-Aceton Puffer
Die Tabelle 4 zeigt die Bedeutung der richtigen Auswahl des bei der Produktablösung verwendeten organischen Lösemittels. Tabelle 4 Menge des abgelösten Proinsulin-S-Sulfonats: Effekt des organischen Lösemittels Zeit Stunden Prozent desorbiertes a Proinsulin-S-sulfonat Organisches Lösemittel im Elutionspuffer Acetonitril Aceton 1-Propanol Ethanol a Desorptionsbedingungen: Zu einem Gramm Harz, das mit einer maximalen Menge von Proinsulin-S-Sulfonat unter Verwendung der Sulfitolysereaktionslösung beladen wurde, die durch Sulfitolyse eines CNBr-behandelten, rekombinanten DNA Fermentationslysats erhalten wird, werden bei 4ºC 6 ml 10 mM Ethylendiamin pH 9,0 gegeben, das 30 % Aceton in einem wäßrigen Lösemittel enthält.
Die Tabelle 5 zeigt die entscheidende Bedeutung des organischen Lösemittelkonzentrationsbereichs. Tabelle 5 Menge an abgelöstem Proinsulin-S-Sulfonat: Effekt der organischen Lösemittelkonzentration Zeit Stunden Prozent desorbiertes a Proinsulin-S-sulfonat Prozent Aceton im Elutionspuffer a Desorptionsbedingungen: Dieselben, wie für Tabelle 4 angegeben, außer, daß der pH des Puffers auf 10,5 erhöht wird. Die oben angegebenen Werte für die prozentuale Desorption stellen in etwa das erreichbare Maximum der nicht-Säulen Methode (Batch) dar.

Claims

1. Verfahren zur Abtrennung von Verunreinigungen aus einem extrem unreinen, schlammbeladenen Gemisch, das proinsulinähnliches Material enthält, ausgewählt aus Proinsulin, Vorläufern von Proinsulin, Derivaten von Proinsulin oder deren Vorläufern und Analoga von Proinsulin oder deren Vorläufern, gekennzeichnet durch:

(1) Aufbringen dieses Gemisches auf einen großporigen Träger aus einem Acrylatestercopolymerharz mit Umkehrphase bei einem pH von etwa 7 bis etwa 10, und

(2) Eluieren dieses proinsulinähnlichen Materials vom Träger mit einem wäßrigen Eluenten, der einen pH von etwa 8 bis etwa 11 aufweist und etwa 10 Volumenprozent bis etwa 30 Volumenprozent eines organischen Verdünnungsmittels enthält, ausgewählt aus der Gruppe Aceton, Acetonitril und einer Kombination von Aceton und Acetonitril.

2. Verfahren nach Anspruch 1, worin das proinsulinähnliche Material eine Aminosäuresequenz aufweist, die der von humanem Proinsulin entspricht.

3. Verfahren nach den Ansprüchen 1 oder 2, worin das proinsulinähnliche Material ein Vorläufer von Proinsulin ist.

4. Verfahren nach Anspruch 3, worin das proinsulinähnliche Material Proinsulin-S-Sulfonat ist.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, worin der großporige Acrylatestercopolymerträger XAD-7 oder XAD-8 ist.

6. Verfahren nach Anspruch 5, worin das proinsulinähnliches Material enthaltende, unreine Gemisch unter Batch-Bedingungen behandelt wird.

7. Verfahren nach Anspruch 5, worin das proinsulinähnliches Material enthaltende, unreine Gemisch unter Säulenchromatographie- Bedingungen behandelt wird.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 oder 7, worin das proinsulinähnliches Material enthaltende, unreine Gemisch auf einen großporigen Acrylatestercopolymerträger bei einem pH von etwa 8 bis etwa 9 aufgetragen wird.

9. Verfahren nach Anspruch 8, worin das unreine Gemisch nach dem Auftragen auf den Träger und vor der Elution mit einem wäßrigen Puffer gewaschen wird, der einen pH von etwa 7 bis etwa 8,5 aufweist.

10. Verfahren nach Anspruch 9, worin das proinsulinähnliche Material vom Träger mit einem wäßrigen Eluenten eluiert wird, der einen pH von etwa 9,5 bis etwa 10,5 aufweist.