KR880002607B1 - 인슐린, 인슐린 유도체 및 불순물의 혼합물을 분리하는 방법 - Google Patents

인슐린, 인슐린 유도체 및 불순물의 혼합물을 분리하는 방법 Download PDF

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Abstract

내용 없음.

Description

[발명의 명칭]
인슐린, 인슐린 유도체 및 불순물의 혼합물을 분리하는 방법
[발명의 상세한 설명]
본 발명은 인슐린, 인슐린 유도체 및 경우에 따라, 불순물의 혼합물을 실리카겔로 충진된 컬럼상에서 크로마토그라피함을 특징으로 하여, 이 혼합물을 분리하는 방법에 관한 것이다. 피그의 천연 인슐린의 반-함성법에서 B30위치의 알라닌을 화학적 또는 효소적으로 트레오닌으로 교체시킴으로써 인체 인슐린으로 전환시키는 방법은 문헌 [Obermeier, R., Geiger, R. Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chemie 357, 759-767(1976), Ruttenberg, M.A. Science 177 623-626(1972), Morihara, K., Oka, T., Tsuzuki, H. Nature 280, 412-413(1979), Inouye, K.J. Am. Chem. Soc. 101, 751-752(1979), Schmitt, E., Gattner, H.G. Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem. 359, 799-802(1978) and Bromer, W.W., Chance, R.E. Biochem. Biophys. Acta 133, 219-233(1967)]에 기술되어 있다. 상기와 같은 전환의 목적은 상기와 동일한 종으로부터 수득한 인슐린을 면역학적인 이유로 당뇨병 치료에 사용할 수 있게 하는 것이다.
반-합성법으로부터 수득한 조(粗)물질중의 인체 인슐린으로부터 인슐린 유도체 및 불순물을 확실히 분리할 수 있는 경우에만 이 치료의 장점을 얻을 수 있다. 공지된 분리방법은 피그 인슐린 성분으로부터 인체 인슐린을 확실히 분리하기에는 적합하지 않다. 반-합성 인체 인슐린중에 25%정도까지의 피그 인슐린이 오염될 수 있음은 문헌에 공개된 아미노산 분석 결과로부터 추론할 수 있다. 재생시킬 수 있는 크로마토그라피 컬럼 충진물질을 반복 사용하여 크로마토그라피함으로써 인체 인슐린이 피그 인슐린 또는 효소에 의해 미량으로라도 오염되는 것을 방지하기 위해서는, 최적 분리능을 갖는 값싼 1회용 물질이 컬럼 충진물질로서 바람직하다. 분석용 고압 액체 크로마토그라피에서, 고-분해 크로마토그라피적 분리는 유기 잔기에 의해 유도된 소수성 실리카겔(역상)상에서만 성취된다. 그러나 이 물질은 고가이므로 1회용 컬럼 충진물질로서 사용할 수 없다.
본 발명에 이르러, 인슐린의 효소적 반-합성법으로부터 수득한 조 혼합물을, 유기용매 예를들어, 클로로포름 : 메탄올 : 물 : 트리에틸아민 : 포름산의 혼합물을 사용하여, 시판되고 있는 실리카겔로 충진된 컬럼상에 서 크로마토그라피시켜 인슐린을 분리하는 것이 다른 모든 분리 방법보다 탁월함이 밝혀졌다. 이 탁월성은 한편으로는 분리될 혼합물의 성분들의 체류시간의 차이(이들중 몇몇은 차이가 크다) 및 다른 한편으로는 컬럼유동속도에 기인한다. 1회 사용후 버리는 실리카겔의 가격은 처리하여 분리된 인슐린의 가격과 비교하여 무시할 수 있다.
이와같이 본 발명은 인슐린, 인슐린 유도체 및 경우에 따라, 불순물의 혼합물을 실리카겔로 충진된 컬럼상에서 크로마토그라피함을 특징으로 하여, 이 혼합물을 분리하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 인슐린을 정제시키며, 인슐린 또는 이의 분해 생성물을 트립신 또는 유사한 효소 및 인슐린 에스테르 또는 기타 인슐린 유도체로부터 분리시키는데 특히 적합하다. 모든 시판되고 있는 실리카겔은, 예를들어 다른 스타트 소재의 머크사로부터 시판되고 있는 시판품 SiO260은, 컬럼 충진물질로서 적합하다.
크로마토그라피의 경우에는, 인슐린 에스테르 또는 유도체 및 다른 한편으로는 인슐린 또는 이의 분해 생성물이 시판되는 박층 크로마토그라피 판상에서 Rf치의 차이를 나타내는 모든 용출제의 혼합물을 용출제로 사용할 수 있다. 조 생성물을 클로로포름 1,500 내지 2,100용량부, 메탄올 1,000 내지 1,500용량부, 물 350 내지 450용량부, 트리에틸아민 35 내지 55용량부 및 포름산 0 내지 15용량부로 이루어진 용출제 혼합물중에서 크로마토그라피하는 경우에 특히 양호한 분리 효과를 얻을 수 있다. 본 발명의 방법은 피그 인슐린을 인체 인슐린으로 효소적 전환시킬 때 생성되는 혼합물인 피그 인슐린 및 트립신으로부터 인체 인슐린-B30-디-3급-부틸트레오닌을 분리하는데 특히 유리하다.
[용도 실시예]
1. 70%의 인체 인슐린-B30-디-3급-부틸트레오닌 및 30%의 피그 인슐린의 혼합물 4g을 클로로포름 : 메탄올 : 물 : 트리에틸아민 : 포름산[1,800 : 1,500 : 375 : 45 : 9(V/V)]로 이루어진 용매 20ml에 용해시킨 다음, 1회용 주사기를 사용하여 건조크기 C인 Lobar(R)의 미리 충진된 컬럼상에 적용시킨다. 컬럼을 동일한 용매를 사용하여 전개시킨다. 용매 전단이 나타난후, 각 분획(10ml)을 모은다. 인체 인슐린-B30-(But)2는 37 내지 53분획에 나타난다. 이를 합하여 회전 증발기 상에서 30 내지 50ml의 용량으로 농축시킨다. 아세톤 약 500ml를 이 용액에 가하여 침전된 생성물을 원심분리하여 분리시킨다. 피그 인슐린은 120 내지 137 분획에서 용출되며 상기 기술한 바와같이 분리시킨다. 두 생성물을 약한 진공하에서 건조시킨다. 수득량 : 인체 인슐린-B30-(But)22.59g인슐린(피그)1.03g
2. N-αB1-3급-부틸옥시카보닐-B30-디-3급-부틸트레오닌-인슐린(4g)을 실시예 1과 같이 용해시킨 다음, 클로로포름으로 평형화된 실리카겔 SiO2-60(R)300g으로 충진된 컬럼(2.5×50Cm)에 적용시킨다. 컬럼을 실시예 1과 동일한 용매 혼합물로 용출시킨다. 처음에 나타나는 피그는 B1-BOC-인슐린-B30-(But)2를 함유하고, 피그 인슐린은 말기의 분획에서 용출된다. 실시예 1과 같이 후처리한다.
3. 실시예 1에서의 혼합물 (4g)을 70%에탄올/30%트리스완충액(0.05M, pH8.0)으로 평형화된 Lobar(R)의 미리 충진된 컬럼 C에 적용시키고, 동일한 용출제를 사용하여 크로마토그라피한다. 서로 분리된 인체인슐린 B30-디-3급-부틸트레오닌 및 피그 인슐린을 함유하는 적절한 분획을 실시예 1에서와 같이 후처리한다.
4. 피그의 불순한 인슐린(4g)을 클로로포름 : 메탄올 : 물 : 트리에틸아민 : 포름산(1,200 : 1,100 : 370 : 47 : 11)의 혼합물에 용해시키고 실시예 2와 같이 실리카겔 컬럼상에서 크로마토그라피한다. 10ml씩으로 분획된 용출물을 실시예 1에서와 같이 후처리한다. 고압 액체 크로마토그라피 및 폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로써 검사한 후 순수한 피그 인슐린을 함유하는 분획을 합한다. 수득량 : 3.61g

Claims (9)

  1. 인슐린, 인슐린 유도체 및, 경우에 따라 불순물의 혼합물을 클로로포름, 메탄올, 물, 트리에틸아민 및 필요한 경우, 포름산으로 이루어진 용출제를 사용하여, 유기 라디칼에 의해 유도화시키지 않은 실리카겔로 충진된 컬럼상에서 크로마토그라피시킴을 특징으로 하여, 인슐린, 인슐린 유도체 및 경우에 따라 불순물의 혼합물을 크로마토그라피적으로 분리시키는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 용출제가 1,500 내지 2,100용량부의 클로로포름, 1,000 내지 1,500용량부의 메탄올, 350 내지 450용량부의 물, 35 내지 55용량부의 트리에틸아민 및 0 및 15용량부의 포름산으로 이루어진 방법.
  3. 제1항 또는 2항에 있어서, 인슐린을 분리시키는 방법.
  4. 제3항에 있어서, 분리된 인슐린이 인체 또는 돼지의 인슐린인 방법.
  5. 제1항 또는 2항에 있어서, 인슐린 유도체를 분리시키는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 분리된 인슐린 유도체가 인슐린 에스테르인 방법.
  7. 제6항에 있어서, 인체 인슐린 B30-디-3급-부틸-트레오닌을 분리시키는 방법.
  8. 제7항에 있어서, 돼지의 인슐린 및 트립신을 함유하는 혼합물로부터 분리시키는 방법.
  9. 제8항에 있어서, 사용된 혼합물이 돼지 인슐린의 인체 인슐린으로의 효소적 전환 반응으로부터 수득되는 방법.
KR8205395A 1981-12-03 1982-12-03 인슐린, 인슐린 유도체 및 불순물의 혼합물을 분리하는 방법 KR880002607B1 (ko)

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