DK162104B - Fremgangsmaade til chromatografisk adskillelse af blandinger af insulin, insulinderivater og eventuelt urenheder - Google Patents

Description

DK 162104 B j

Opfindelsen angår en fremgangsmåde til adskillelse af blandinger af insulin, insulinderivater og eventuelt urenheder.

Det er kendt at omdanne naturligt svineinsulin til 5 humaninsulin ad semisyntetisk vej ved kemisk eller enzymatisk ombytning af alaninet i stilling B 30 med threonin, jfr.

R. Obermeier og R. Geiger, Hoppe-Seyler·s Z.physiol.Chemie, 357. 759-767 (1976), M.A. Ruttenberg, Science, 177, 623-626 (1972), K.Morihara, T.Oka og H.Tsuzuki, Nature, 280, 412-413 10 (1979), K.Inouye, J.Am.Chem.Soc., 101. 751-752 (1979), E.-

Schmitt og H.G. Gattner, Hoppe-Seyler's z.physiol.Chemie, 359, 799-802 (1978) og W.W. Bromer og R.E. Chance, Biochem. Biophys.Acta, 133. 219-223 (1967).

Formålet med denne omdannelse er ved behandlingen af 15 diabetes hos mennesker af immunologiske grunde at kunne anvende artsidentisk insulin.

Fordelene ved denne behandling kan kun da komme til deres ret, når det lykkes fra råmaterialet fra semisyntesen med sikkerhed at skille insulinderivater og urenheder fra 20 humaninsulinet.

De kendte adskillelsesmetoder er ikke egnet til med sikkerhed at gennemføre adskillelsen af humaninsulinet fra svineinsulinkomponenter. Af de i litteraturen offentliggjorte aminosyreanalyser kan det udledes, at det i det semi-25 syntetiske humaninsulin er muligt at have en forurening med svineinsulin op til en størrelsesorden på 25%.

For at kunne undgå selv sporvis forekommende forureninger af humaninsulin med svineinsulin eller enzymer ved hjælp af den gentagne anvendelse af regenerérbare fyldmate-30 rialer til chromatograf isøj ler er det ønskeligt at have et billigt éngangsmateriale med optimal adskillelsesevne som ’ søjlefyldning. Ved den analytiske højtryksvæskechromato- j graf i opnås der udelukkende kraftigt opløsende, chroraatogra- ! fiske adskillelser på hydrofob, med organiske rester deriva-35 tiseret kiselgel ("reversed phase"). De høje omkostninger for i dette materiale forbyder imidlertid anvendelsen deraf som

DK 162104 B

2 éngangs-søjlefyldninger.

Fra Pickart et al., Preparative Biochemistry, 5 (5 og 6), 397-412 (1975), er det endvidere også kendt at rense vækstfremmende peptider og proteiner samt histoner ved høj-5 trykschromatografi på kiselgel; på side 411 i dette litteratursted er der specielt til den chromatografiske rensning af insulin angivet en løbemiddelblanding af methanol, vand og myresyre i forholdet 8:4:1. Heller ikke dette system er imidlertid fyldestgørende til adskillelsen af humaninsulin-10 (-ester) fra et forurenet produkt.

Det har nu overraskende vist sig, at den chromatografiske adskillelse af råblandinger fra enzymatiske semisyn-teser af insulin på søjler, der er pakket med gængs kiselgel, som ikke er derivatiseret med organiske rester, ved anven-15 delse af bestemte organiske opløsningsmiddelblandinger som løbemiddel, f.eks. chloroform/methanol/vand/triethylamin/-myresyre, er alle andre adskillelsesmetoder overlegen. Denne overlegenhed er for det første et resultat af de til dels store forskelle i retentionstiderne for komponenterne i de 20 blandinger, der skal adskilles, og for det andet et resultat af den store hastighed af et søjlegennemløb. Omkostningerne for den efter et gennemløb kasserede kiselgel kan i sammenligning med den behandlede insulinmængde lades ude af betragtning.

25 Opfindelsen angår således en fremgangsmåde til adskil lelse af blandinger af insulin, insulinderivater og eventuelt urenheder, ved at man chromatograferer blandingerne på en med kiselgel fyldt søjle, og denne fremgangsmåde er ejendommelig ved, at kiselgelen ikke er derivatiseret med organiske 30 rester, og at man til chromatograferingen anvender et løbemiddel bestående af en blanding af chloroform, methanol, vand, triethylamin samt eventuelt myresyre.

Fremgangsmåden egner sig navnlig til rensning af insulin og til adskillelse af insulin eller dets nedbrydnings-35 produkter fra trypsin eller lignende fermenter og insulinestere eller andre insulinderivater.

DK 162104 B

3

Som søjlefyldning kommer enhver handelsgængs, med organiske rester ikke derivatiseret kiselgel i betragtning, f.eks. handelsproduktet SiO2“60® fra Merck a Co., Darmstadt.

Som løbemidler kan der til chromatograferingen anven-5 des alle de i krav 1 omhandlede løbemiddelblandinger, i hvilke insulinestere eller -derivater på den ene side og insulin eller dets nedbrydningsprodukter på den anden side udviser forskellige Rf-værdier på i handelen værende tyndt-1agschromatografi-plader.

10 Særligt gode adskillelseseffekter opnås, når man ifølge opfindelsen chromatograferer råproduktet i en løbemid-delblanding af 1500-2100 rumfangsdele chloroform, 1000-1500 rumfangsdele methanol, 350-450 rumfangsdele vand, 35-55 rumfangsdele triethylamin og 0-15 rumfangsdele myresyre.

15 Særlig fordelagtig er fremgangsmåden i forbindelse med adskillelsen af humaninsulin-B 30-di-tert.butyl-threonin fra svineinsulin og trypsin, en blanding, der forekommer ved den enzymatiske omdannelse af svineinsulin til humaninsulin.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen belyses nærmere i 20 de følgende eksempler.

Anvendelseseksempler 1. 4 gram af en blanding af 70% humaninsulin-B 30-di-tert.butyl-threonin og 30% svineinsulin opløses i 20 ml af 25 et opløsningsmiddel bestående af chloroform, methanol, vand, triethylamin og myresyre i rumfangsforholdet 1800:1500:375:-45:9 og sættes ved hjælp af en éngangssprøjte til en tør Lobar®-færdigsøjle, størrelse C. Søjlen fremkaldes med samme opløsningsmiddel. Efter fremkomsten af opløsningsmiddelfron-30 ten indsamles der enkeltfraktioner (10 ml).

Humaninsulin-B 30-(But)2 forekommer i fraktionerne 37-53. Disse forenes og koncentreres på en rotationsfordamper til et rumfang på 30-50 ml. Til denne opløsning sættes der ca. 500 ml acetone, og det udfældede produkt isoleres ved 35 centrifugering.

Svineinsulinet elueres i fraktionerne 120-137 og iso-

DK 162104B

4 leres som ovenfor beskrevet. Begge produkter tørres i let vakuum.

Udbytte: 2,59 gram humaninsulin-B 30-(But)2 1,03 gram insulin (S).

5 2. NaB^-tert. butyloxycarbonyl-B 30-di-tert.butyl-thre-onin-insulin i en mængde på 4 gram opløses som i eksempel 1 og sættes til en med 300 gram kiselgel S1O2-6O® fyldt søjle (2,5 x 50 cm), der er ækvilibreret med chloroform. Søjlen 10 elueres med den samme opløsningsmiddelblanding som i eksempel 1. Den først fremkommende top indeholder B^-BOC-insulin B 30-(But)2/ medens svineinsulin elueres i de senere fraktioner. Oparbejdningen sker som i eksempel 1.

3. En blanding som i eksempel 1 (4 gram) sættes til 15 en Lobar®-færdigsøjle C, ækvilibreret med en blanding af 70% ethanol og 30% tris-puffer (0,05 M, pH=8,0), og der chromatograferes med det samme elueringsmiddel. De tilsvarende fraktioner, der adskilt fra hverandre indeholder hu-maninsulin-B 30-di-tert.butyl-threonin og svineinsulin, opar-20 bejdes som i eksempel 1.

4. 4 gram urenset svineinsulin opløses i en blanding af chloroform, methanol, vand, triethylamin og myresyre i forholdet 1200:1100:370:47:11 og chromatograferes som i eksempel 2 over en kiselgelsøjle. Det i portioner på 10 ml 25 fraktionerede eluat oparbejdes som i eksempel 1. Fraktioner, der efter undersøgelse ved HPLC og polyacrylamidgel-elek-troforese indeholder rent svineinsulin, forenes. Udbytte: 3,61 gram.

Claims (2)

1. Fremgangsmåde til adskillelse af blandinger af insulin, insulinderivater og eventuelt urenheder, ved at man chromatograferer blandingerne på en med kiselgel fyldt 5 søjle, kendetegnet ved, at kiselgelen ikke er derivatiseret med organiske rester, og at man til chromato-graferingen anvender et løbemiddel bestående af en blanding af chloroform, methanol, vand, triethylamin samt eventuelt myresyre. 10

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendeteg net ved, at chromatograferingen udføres i en løbemid-delblanding af 1500-2100 rumfangsdele chloroform, 1000-1500 rumfangsdele methanol, 350-450 rumfangsdele vand, 35-55 rumfangsdele triethylamin og 0-15 rumfangsdele myresyre.