DK147109B

DK147109B - Fremgangsmaade til fremstilling af humant insulin eller humane insulinestere eller et salt eller kompleks deraf

Info

Publication number: DK147109B
Application number: DK057480AA
Authority: DK
Inventors: Jan Markussen
Original assignee: Novo Industri As
Priority date: 1980-02-11
Filing date: 1980-02-11
Publication date: 1984-04-09
Also published as: DK147437A; DK147109C; NL178797C; DE3104949A1; PT72485B; NL178797B; GB2069502A; PT72485A; NO810443L; DK54081A; BE887480A; GR73844B; DE3104949C2; NO156247B; JPH0211240B2; SE451143B; ZA81898B; IT1195038B; IT8119620A1; ES499238A0

Description

1 147109

Til behandlingen af diabetes mellitus har man sædvanligvis anvendt insulinpræparater, der er fremstillet på grundlag af svine- eller okseinsulin. Okseinsulin, svineinsulin og humant insulin udviser mindre forskelle med hensyn til amino-5 syresammensætningen, og forskellen mellem humant insulin og svineinsulin er begrænset til én enkelt aminosyre, idet den C-terminale aminosyre i B-kæden i humant insulin er Thr, hvorimod den tilsvarende aminosyre i svineinsulin er Ala. Man kunne imidlertid mene, at det ideelle insulinpræparat til behandling 10 af mennesker ville være insulin, som har præcis samme kemiske struktur som humant insulin.

Konventionelt okse- eller svineinsulin indeholder forskellige urenheder såsom insulinlignende proteiner med en molekylvægt på ca. 9000, f.eks. proinsulin, splitproinsulin, 15 desdipeptidproinsuliner og desnonapeptidproinsulin, foruden insulinlignende bestanddele med en molekylvægt på ca. 6000, f.eks. arginininsuliner og diarginininsuliner, jfr. R. Chance:

In Proceedings of the Seventh Congress of IDF, Buenos Aires 1970, 292 - 305, udgiver: R.R. Rodriquez & J.V.-Owen, Excerpta 20 Medica, Amsterdam. Til fremstilling af et insulinpræparat, som udviser ingen eller meget lav antigenicitet, har det vist sig at være nødvendigt at fjerne disse forskellige urenheder, f.eks. ved anvendelsen af gelfiltrering og ionbytterchromato-grafering, jfr. britisk patent nr. 1.285.023 og 1.285.024.

25 Det har nu overraskende vist sig, at insulin og insu linderivater med nedenstående almene formel I, som omfatter ovennævnte insulinlignende proteiner og bestanddele, ved en simpel kemisk omsætning kan omdannes til estere af humant insulin, hvilke på kendt måde kan omdannes til humant insulin. Den 30 foreliggende opfindelse angår således en fremgangsmåde til

fremstilling af humant insulin eller humane insulinestere med den almene formel III

ThrB30(R5)-OR4-h-In (III) hvor -h-In betegner humant des-(ThrB3^)-insulinyl, R4 betegner 5 35 en carboxylbeskyttelsesgruppe, og R betegner hydrogen eller en 2 147109

hydroxylbeskyttelsesgruppe, eller et salt eller kompleks deraf, kendetegnet ved, at én forbindelse med den almene formel i og forskellig fra humant insulin eller flere forbindelser med den almene formel I

5 S-——S

1 1 I 2 I 3 R -Q -Cys-Cys-Q -Cys-Q -Cys-Asn (A-kæde) I I (21) S S (I) 10 I /

S

2 4 I 5 I (22) (23) (29) .

r _q -cys-Q -Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-R

(B-kæde) 1 2 15 hvor Q betegner -Gly-Ile-Val-Glu-Gln-, Q betegner -Thr-Ser-

Ile-, betegner -Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-, Q4 beteg- 5 ner -Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-, Q betegner -Gly-Ser-His-Leu-

Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-, R1 betegner hydrogen, en basisk aminosyre eller et peptidfragment indeholdende højst 36 amino- 20 syrer i hvilket den C-terminale aminosyre er en basisk aminosy-2 re, R betegner hydrogen, en basisk aminosyre eller et peptid- 3 fragment med en C-terminal basisk aminosyre, og R betegner en aminosyre eller et peptidfragment indeholdende højst 36 aminosyrer, med det forbehold, at antallet af aminosyrer i R"*" plus 3 1

25 antallet af aminosyrer i R ikke er større end 36, eller R

3

sammen med R betegner en peptidbinding eller et peptidfragment indeholdende højst 36 aminosyrer, i hvilket den C-terminale aminosyre er en basisk aminosyre, eller komplekser eller salte deraf omsættes med en L-threoninester med den almene formel II

30 Thr(R5)-OR4 (II) 4 5 hvor R betegner en carboxylbeskyttelsesgruppe, og R betegner hydrogen eller en hydroxylbeskyttelsesgruppe, eller et salt deraf i en blanding af vand og ét eller flere organiske opløsningsmidler og i nærværelse af trypsin eller et aktivt tryp-35 sinderivat, hvorefter beskyttelsesgruppen eller -grupperne om ønsket fjernes.

3 147109

Anvendelige threoninestere med formlen II er sådanne, i hvilke R4 er en carboxylbeskyttelsesgruppe, som kan fjernes fra den humane insulinester med formlen III under betingelser, som ikke medfører irreversible ændringer i insulinmolekylet.

5 Som eksempler på sådanne carboxylbeskyttelsesgrupper kan angives methyl, ethyl, tert.butyl, diphenylmethy1, substituerede benzylgrupper såsom p-methoxybenzyl og 2,4,6-trimethylbenzyl og grupper med den almene formel -Ci^-Cl^-X, hvor X betegner -S+(R6)(R7), -SO-R6, -N+(R6)(R7)(R8) eller -P+(R6)(R7)(R8), 6 7 ^8 10 hvor R , R og R er ens eller forskellige, og hver betegner lavere alkyl såsom methyl, ethyl, propyl og n-butyl. Egnede hydroxylbeskyttelsesgrupper R er sådanne, som kan fjernes fra de humane insulinestere med formlen III under betingelser, som ikke medfører irreversible ændringer i insulinmolekylet. Som et 15 eksempel på en sådan gruppe kan angives tert.butyl.

Threoninestere med formlen II kan være de frie baser eller egnede salte deraf såsom acetater, propionater og butyra-ter.

Som eksempler på basiske aminosyrer i R og R i 20 formlen I kan angives lysin og arginin.

Som eksempler på forbindelser med den almene formel I

kan angives svineinsulin, hundeinsulin, finhvalinsulin eller 12 3 kaskelotinsulin (R og R er hydrogen, og R er -Ala), kaninin-12 3 sulin (R og R er hydrogen, og R er -Ser), svinediargininin-12 3 25 sulm (R og R er hydrogen, og R er -Ala-Arg-Arg), svineargi-12 3 mnmsulin (R og R er hydrogen, og R er -Ala-Arg), svinepro- 2 13 insulin (R er hydrogen, og R er sammen med R -Ala-Arg-Arg-

Glu-Ala-Glu-Asn-Pro-Gln-Ala-Gly-Ala-Val-Glu-Leu-Gly-Gly-Gly-

Leu-Gly-Gly-Leu-Gln-Ala-Leu-Ala-Leu-Glu-Gly-Pro-Pro-Gln-Lys- 30 Arg-, hvor den N-terminale alanyl er knyttet til Lys529, og den C-termmale arginyl er knyttet til Q ), hundepr oinsul in (R er 1 3 hydrogen, og R er sammen med R -Ala-Arg-Arg-Asp-Val-Glu-Leu-Ala-Gly-Ala-Pro-Gly-Glu-Gly-Gly-Leu-Gln-Pro-Leu-Ala-Leu-Glu-

Gly-Ala-Leu-Gln-Lys-Arg-, hvor den N-terminale alanyl er knyt- B29 i 35 tet til Lys , og den C-terminale arginyl er knyttet til ςρ), svmesplitproinsulin (R er hydrogen, R er Ala-Leu-Glu-Gly-

Pro-Pro-Gln-Lys-Arg-, og R3 er -Ala-Arg-Arg-Glu-Ala-Glu-Asn- 4 147109

Pro-Gln-Ala-Gly-Ala-Val-Glu-Leu-Gly-Gly-Gly-Leu-Gly-Gly-Leu-Gln-Ala-Leu), desdipeptidproinsulin (R1 og R2 er hydrogen, og R er ~Ala-Arg-Arg-Glu-Ala-Glu-Asn-Pro-Gln-Ala-Gly-Ala-Val-Glu-Leu-Gly-Gly-Gly-Leu-Gly-Gly-Leu-Gln-Ala-Leu-Ala-Leu-Glu-5 Gly-Pro-Pro-Gln), humant proinsulin (R2 er hydrogen, og R3" er sammen med R3 -Thr-Arg-Arg-Glu-Ala-Glu-Asp-Leu-Gln~Val-Gly-Gln-Val-Glu-Leu-Gly-Gly-Gly-Pro-Gly-Ala-Gly-Ser-Leu-Gln-Pro-Leu-Ala-Leu-Glu-Gly-Ser-Leu-Gln-Lys-Arg-, hvor den N-terminale threonyl er knyttet til Lys° , og den C-terminale arginyl er 10 knyttet til Q1), og abeproinsulin (R2 er hydrogen, og R1 er 3 sammen med R -Thr-Arg-Arg-Glu-Ala-Glu-Asp-Pro-Gln-Val-Gly-Gln-Val-Glu-Leu-Gly-Gly-Gly-Pro-Gly-Ala-Gly-Ser-Leu-Gln-Pro-Leu-Ala-Leu-Glu-Gly-Ser-Leu-Gln-Lys-Arg-).

Som eksempler på aktiverede trypsinderivater kan an-15 gives acetyleret trypsin, succinyleret trypsin, giutaraldehydbehandlet trypsin og immobiliserede trypsinderivater.

Som eksempler på et kompleks eller salt af en forbindelse med formlen I kan angives et zinkkompleks eller -salt.

Formelt kan fremgangsmåden ifølge den foreliggende 20 opfindelse betragtes som en transacyleringsreaktion, i hvilken carbonylgruppen i Lys i forbindelsen med formlen I og carbo- nylgruppen i en eventuelt tilstedeværende arginyl- eller lysyl-1 2 gruppe R eller R eller i en arginyl- eller lysylgruppe, som er den C-terminale aminosyre i et eventuelt tilstedeværende 1 2 25 peptidfragment R eller R , overføres til aminogruppen i forbindelser med formlen II. Fremgangsmåden kan udføres ved at opløse 1) en forbindelse med formlen I, 2) en threoninester med formlen II og 3) trypsin i en blanding af vand og mindst ét organisk opløsningsmiddel. Som eksempler på organiske opløsnings-30 midler kan angives Ν,Ν-dimethylformamid, N,N-dimethylacetamid, N-methylpyrrolidon, hexamethylphosphortriamid, ethanol, metha-nol, 2-propanol, dioxan og acetonitril. Afhængigt af hvilket eller hvilke organiske opløsningsmidler der anvendes, er indholdet af organisk opløsningsmiddel sædvanligvis over ca. 40%, 35 fortrinsvis over 50%, og mindre end ca. 80%, fortrinsvis mindre end ca. 75% (rumfang/rumfang).

5 147109 Såfremt der anvendes et immobiliseret trypsinderivat, suspenderes det i mediet. Der kan tilsættes syrer såsom eddikesyre, propionsyre og smørsyre eller baser såsom pyridin, TRIS (tris(hydroxymethyl)aminomethan), N-methylmbrpholin og N-ethyl-5 morpholin til opnåelse af et egnet puffersystem. Fremgangsmåden udføres ved en temperatur på ca. 0 - 50°C, fortrinsvis ved ca.

37°C. Der kan tilsættes ioner, som stabiliserer trypsin, såsom kalciumioner. Afhængigt af den anvendte mængde trypsin og af de øvrige reaktionsbetingelser er reaktionstiden sædvanligvis un-10 der 24 timer.

Humant insulin kan fremstilles ud fra ovennævnte humane insulinestere med formlen III ved fjernelse af beskyttel- 4 sesgruppen R og en eventuelt tilstedeværende beskyttelsesgrup- 5 pe R under anvendelse af kendte metoder eller i og for sig 15 kendte metoder, såfremt R4 er methyl, ethyl eller en gruppe med formlen -CH2-CH2-X, hvor X har ovennævnte betydning, kan den pågældende beskyttelsesgruppe fjernes under milde basiske betingelser i et vandigt medium, fortrinsvis ved en pH-værdi på ca. 8 - 12, f.eks. ved ca. 9,5. Som base kan anvendes ammoniak, 20 triethylamin eller hydroxider af alkalimetaller såsom natriumhydroxid. Såfremt R4 er tert.butyl, substitueret benzyl såsom p-methoxybenzyl eller 2,4,6-trimethylbenzyl eller diphenyl-methyl, kan den pågældende gruppe fjernes ved acidolyse, fortrinsvis med trifluoreddikesyre. Trifluoreddikesyren kan være 25 ikke-vandig eller kan indeholde noget vand, eller den kan være fortyndet med et organisk opløsningsmiddel såsom dichlormethan. Såfremt R^ er tert.butyl, kan den pågældende gruppe fjernes ved acidolyse, jævnfør ovenfor.

Foretrukne forbindelser med formlen III er forbindel- 5 30 ser, hvor R er hydrogen.

Nogle forbindelser med formlen II er kendte forbindelser, og de øvrige forbindelser med formlen II kan fremstilles analogt med fremstillingen af kendte forbindelser eller analogt med kendte metoder.

35 Ved en foretrukken udførelsesform for den foreliggen de opfindelse omsættes urent svineinsulin indeholdende én eller flere af følgende forureninger: proinsulin, arginininsulin, 6 147109 diarginininsulin, splitproinsulin, desdipeptidproinsuliner og desnonapeptidproinsulin eller et salt eller kompleks deraf med en forbindelse med formlen II eller et salt deraf under oven- 4 nævnte betingelser, hvorefter beskyttelsesgruppen R og en 5 5 eventuelt tilstedeværende beskyttelsesgruppe R fjernes. Ved denne fremgangsmåde omdannes svineinsulinet til humant insulin.

En af fordelene ved denne fremgangsmåde er, at også ovennævnte urenheder omdannes til humant insulin. Det var tidligere nødvendigt at fjerne og kassere de omhandlede urenheder for at 10 fremstille insulinpræparater med ingen eller meget lave antigene egenskaber. Nogle antigene urenheder omdannes derfor til humant insulin.

Den nødvendige mængde af humane pankreaskirtler til fremstilling af naturligt, humant insulin er ikke til stede.

15 I lille skala og med meget store omkostninger har der været fremstillet syntetisk, humant insulin, jævnfør Helv.Chim.

Acta _57, 2617, og 60_, 27. Semisyntetisk, humant insulin har været fremstillet ud fra svineinsulin på langsommelige måder, jævnfør Hoppe-Seyler's Z.Physiol.Chem. 356, 1631, og Nature 20 280, 412. Den foreliggende opfindelse angår imidlertid en frem gangsmåde, som i industriel målestok kan anvendes til fremstilling af humant insulin.

USA-patentskriftet nr. 3.276.961 påstås at angå en fremgangsmåde til fremstilling af semisyntetisk, humant insu-25 lin. Der opnås imidlertid ikke humant insulin ved fremgangsmåden, idet fremgangsmåden udføres i vand, under hvilke betingel-ser trypsin forårsager en spaltning af Arg -Gly -bindingen (jævnfør formel I), jævnfør J.Biol.Chem. 236, 743.

En kendt semisyntetisk fremgangsmåde til fremstilling 30 af humant insulin omfatter følgende tre trin: Først omdannes B3 λ svineinsulin til svine-des-(Ala )-insulin ved behandling med carboxypeptidase A, jævnfør Hoppe-Seyler's Z.Physiol.Chem. 359, BO Λ 799. I det andet trin underkastes svine-des-(Ala )-insulin en trypsinkat aly seret kobling med Thr-OBu*", hvorved der dannes hu-B3 q 35 man insulin-Thr -tert.butylester. Derefter behandles den på gældende ester med trifloureddikesyre, hvorved fås humant insulin, jævnfør Nature 280, 412. Ved det første trin sker der 7 147109 -Al imidlertid en delvis fjernelse af AsnA , hvorved fås des- (AlaB^,AsnA^)-insulin. Dette derivat giver efter de to efter- følgende reaktioner anledning til forurening af des-(Asn )- insulin i det fremstillede semisyntetiske, humane insulin, 5 hvilket er en forurening, som ikke kan fjernes ved kendte, præ- A21 parative metoder. Des-(Asn )-insulin udviser lav biologisk aktivitet (ca. 5%), jævnfør Amer.J.Med. 4£, 750.

Fra Biochem.Biophys.Res.com. 9j2, 396 - 402, kendes en metode til fremstilling af humant insulin, ved hvilken man i B30 10 første trin fremstiller svine-des-(Ala )-insulin ud fra svineinsulin med Achromobacter-protease I i vandigt medium og i andet trin kobler des- (AlaB^) -insulinet med Thr-OBu*" med Achromobacter-protease I som katalysator til fremstilling af B3O-esteren af humant insulin i et medium indeholdende ét eller 15 flere organiske opløsningsmidler. I modsætning hertil fås B30-esteren af humant insulin ved fremgangsmåden ifølge denne opfindelse direkte i ét trin.

Fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse udviser følgelig følgende fordele i sammenligning med den kendte 20 teknik:

1) Den enzymatiske hydrolyse med carboxypeptidase A

udelades.

2) Isoleringen af mellemproduktet, nemlig svine-des- B3 g (Ala )-insulin, er unødvendig.

A21 25 3) Forureningen med des-(Asn )-insulinderivater undgås.

4) Proinsulin og andre insulinlignende urenheder, som er angivet ved formel I, og som er til stede i råinsulin, omdannes ved fremgangsmåden ifølge foreliggende opfindelse til 30 humant insulin, hvorved udbyttet forøges.

5) Der fås et produkt med meget lav eller ingen anti-genicitet, idet proinsulinet og de ovennævnte mellemprodukter omdannes til humant insulin.

De anvendte forkortelser er i overensstemmelse med de 35 regler, som i 1974 blev godkendt af IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature, jævnfør Selected Tentative Rules & 8 147109

Recommendations of the Commission on Biochemical Nomenclature IUPAC-IUB, 2. udgave, Maryland 1975.

Analytiske undersøgelser;

Omdannelsen af svineinsulin og svineproinsulin til 5 humane insulinestere kan demonstreres ved DISC PAGE (polyacryl-amidgelelectrophorese) i 7,5% polyacrylamidgel i en puffer bestående af 0,375 M TRIS, 0,06 HCl, og 8 M urinstof. Pufferens pH-værdi er 8,7. Estere med formlen III, hvori estergruppen ikke har nogen ladning, vandrer med en hastighed på 75% af 10 svineinsulinets hastighed. Svineinsulin, som vandrer med 55% af svineproinsulins hastighed, omdannes ved fremgangsmåden ifølge foreliggende opfindelse til det samme produkt. Identificeringen af omdannelsesproduktet som forbindelser med formel III bygger på følgende kriterier: 15 a) Den electrophoretiske vandring af humane insulin estere med formel III i sammenligning med svineinsulinets svarer til tabet af én negativ ladning for uladede estergrupper og til tabet af to negative ladninger for estergrupper, som har én positiv ladning.

20 b) Aminosyresammensætningen af de farvede proteinbånd i gelen, som svarer til forbindelser med formel III er identisk med humant insulins aminosyresammensætning, nemlig 3 mol threo-nin og 1 mol alanin pr. mol insulin, og sammensætningen af svineinsulin er 2 mol threonin og 2 mol alanin pr. mol insulin.

25 Metoden til analysering af aminosyresammensætninger i proteinbånd i polyacrylamidgeler er beskrevet af Sundby & Markussen,

Eur.J.Biochem. 25, 147.

c) Beviset for, at det indføjede threonin-er placeret som C-terminal aminosyre i B-kæden, fås ved oxidativ sulfito- 30 lyse af S-S-broerne i insulin i 6 M guanidin-hydrochlorid efterfulgt af separering af A- og B-kæderne ved ionbytnings-chromatografi på "SP Sephadex" (registreret varemærke,

Pharmacia AB, Sverige). Ved fordøjelse af B-kæde-S-sulfonatet med carboxypeptidase A frigøres kun den C-terminale aminosyre.

35 Denne teknik er beskrevet af Markussen i Proceedings of the 9 U7109

Symposium on Proinsulin, Insulin and C-peptide, Tokushima, 12.

- 14. juli 1978, (udgiver: Baba, Kaneko & Yaniahara)

Int.Congress Series nr. 468, Excerpta Medica, Amsterdam-Oxford. Analysen udføres, efter at estergruppen er spaltet fra forbin-5 delser med formlen III.

Disse 3 analyser beviser klart, at der er sket en omdannelse til humant insulin.

Omdannelsen af svineinsulin og svineproinsulin til humane insulinestere kan følges kvantitativt ved HPLC (høj-10 tryksvæskechromatografering) på omvendt fase. Der anvendes en 3 x 300 mm '^Bondapak C^g column" (Waters Ass.) og elueringen udføres med en puffer indeholdende 0,2 M ammoniurasulfat (indstillet på en pH-værdi på 3,5 med svovlsyre) og indeholdende 26 -50% acetonitril. Den optimale acetonitrilkoncentration afhænger 15 af, hvilken ester med formlem III man ønsker at separere fra o 4 5 o svineinsulin. Såfremt R er methyl, og R er hydrogen, opnas separering i 26% (rumfang/rumfang) acetonitril. Svineinsulin og B3 0

Thr -OMe-h-In (Me er methyl) elueres efter henholdsvis 4,5 og 5,9 kolonnerumfang som godt separerede symmetriske toppe. Før 20 påføringen på HPLC-kolonnen udfældes proteinerne i reaktionsblandingen ved tilsætning af 10 rumfang acetone. Bundfaldet isoleres ved centrifugering, tørres i vacuum og opløses i 0,02 M svovlsyre.

Fremgangsmåden til fremstilling af humane insulin-25 estere og humant insulin belyses ved følgende eksempler. Eksemplerne angiver nogle foretrukne udførelsesformer for fremgangsmåden ifølge opfindelsen.

Eksempel 1 200 g urent svineinsulin, som er krystalliseret én 30 gang, opløses i 1,8 ml 3,33 M eddikesyre. Der tilsættes 2 ml af en 2 M opløsning af Thr-OMe (Me er methyl) i N,N-dimethylaceta-mid og 20 mg trypsin opløst i 0,2 ml vand. Efter 18 timers henstand ved 37°C udfældes proteinerne ved tilsætning af 40 ml acetone, og bundfaldet isoleres ved centrifugering. Supernatan-35 ten kasseres. Ved analyse af bundfaldet ved HPLC under anven- 10 U7109 delse af 26% acetonitril (jævnfør Analytiske undersøgelser) fås en 60% omdannelse af svineinsulin til Thr -OMe-h-In. Bundfaldet opløses i 8 ml friskt afioniseret 8 M urinstof, pH-værdien indstilles på 8,0 med 1 M ammoniak, og opløsningen sættes på en 5 2,5 x 25 cm kolonne, som er pakket med "QAE A-25 Sephadex", der er ækvilibreret med en 0,1 M ammoniumchloridpuffer, som indeholder 60% (rumfang/rumfang) ethanol, og hvis pH-værdi er indstillet på 8,0 med ammoniak. Elueringen udføres med den samme puffer, og der opsamles fraktioner på hver 15 ml. Thr -OMe-10 h-In findes i fraktionerne nr. 26 - 46, og uomsat svineinsulin findes i fraktionerne nr. 90 - 120. Fraktionerne nr. 26 - 46 B3 q forenes, ethanolet afdampes i vacuum, og Thr -OMe-h-In krystalliseres i en citratpuffer som beskrevet af Schlichtkrull et al., Handbuch der inneren Medizin, 7/2A, 96, Berlin, Heidel-15 berg, New York 1975. Udbyttet er 95 mg krystaller med samme rhombiske form som svineinsulinkrystaller, der er krystalliseret på samme måde. Aminosyresammensætningen findes at være identisk med aminosyresammensætningen for humant insulin. Ved yderligere analytiske forsøg, som er beskrevet i ovennævnte af-20 snit: Analytiske undersøgelser, vises det, at det resulterende produkt er ThrB^®-OMe-h-In.

Eksempel 2 100 mg svineinsulin, som opfylder de renhedskriterier, der er angivet i britisk patentskrift nr. 1.285.023, oplø-25 ses i 0,9 ml 3,33 M eddikesyre, og der tilsættes derefter 1 ml af en 2 M opløsning af threoninmethylester i Ν,Ν-dimethylformamid og 12 mg TPCK-behandlet (TPCK er tosylphenylalaninchlor-methylketon) trypsin opløst i 0,1 ml vand. Efter inkubering i 24 timer ved 37°C standses omsætningen ved tilsætning af 4 ml 1 B3 0 30 M phosphorsyre. Den vundne Thr -OMe-h-In separeres fra uomsat svineinsulin ved ionbytterchromatografering på en 2,5 x 25 cm kolonne af "SP Sephadex” med en eluent indeholdende 0,09 M na- triumchlorid og 0,02 M natriumdihydrogenphosphat (pH-værdien af pufferen er 5,5) i 60% ethanol. Fraktioner indeholdende B3 q 35 Thr -OMe-h-In opsamles, ethanolet fjernes i vacuum, og -,-, 147109 produktet krystalliseres analogt med beskrivelsen i eksempel 1.

B3 0

Udbyttet er 50 mg Thr -OMe-h-In.

Eksempel 3 100 mg svineproinsulin opløses i 0,9 ml 3,33 M eddi- B3 0 o o 5 kesyre og omdannes til Thr -OMe-h-In og renses på analog måde som beskrevet for svineinsulin i eksempel 1. Omdannelsen af B3 0 proinsulin til Thr -OMe-h-In findes ved HPLC-analysen af ace- B3o tonebundfaldet at være 73%. Udbyttet af krystallinsk Thr -h-In er 54 mg.

10 Eksempel 4 100 mg svineinsulin opløses i 0,9 ml 2,77 M eddikesyre i vand og omsættes på analog måde som beskrevet i eksempel 2. Efter afslutning af omsætningen fældes proteinerne ved tilsætning af 10 rumfang acetone. Analyse ved DISC PAGE viser en R? Π 15 omdannelse til Thr -OMe-h-In på 70%.

Eksempel 5 100 mg svineinsulin opløses i 0,9 ml 3,33 M eddikesyre, og der tilsættes 1 ml 2 M Thr-OMe i N-methylpyrrolidon.

Omsætningen udføres på analog måde som beskrevet i eksempel 4, B3 0 20 og omdannelsen til Thr -OMe-h-In er 20%.

Eksempel 6 100 mg svineinsulin opløses i 0,9 ml 2,77 M eddikesyre i vand, og der tilsættes 1 ml 2 M Thr-OMe i HMPA (hexa-methylphosphortriamid). Omsætningen udføres på analog måde som 25 beskrevet i eksempel 4. Omdannelsen til Thr-OMe-h-In er 80%.

12 147109

Eksempel 7 100 mg svineinsulin opløses i 0,9 ml 3,33 M eddikesyre, og der tilsættes 1 ml 2 M Thr-OMe i N,N-dimethylacetamid. Omsætningen udføres på analog måde som beskrevet i eksempel 4.

D“3 Q

5 Omdannelsen til Thr -OMe-h-In er 80%.

Eksempel 8 100 mg svineinsulin opløses i 0,9 ml 3,33 M eddikesyre, og der tilsættes 1 ml 2 M Thr-OMe i N,N-dimethylacetamid.

Der tilsættes derefter 200 enheder trypsinaktivitet (målt mod 10 substratet BAEE (alfa-N-benzoyl-L-argininethylester)), som er immobiliseret på 1 g glasperler, og efter inkubering ved 37°C i 24 timer frafiltreres det til glasset bundne trypsin. Efter afslutning af omsætningen fældes proteinerne ved tilsætning af 10 rumfang acetone. Analyse ved DISC PAGE viser en omdannelse til 15 ThrB3®-OMe-h-In på 40%.

Eksempel 9 100 mg svineinsulin opløses i 0,9 ml 3,33 M eddikesyre, og der tilsættes 1 ml 2 M Thr-OMe i N,N-dimethylacetamid.

Der tilsættes derefter 300 enheder trypsin (aktivitet målt med 20 substratet BAEE), som er immobiliseret på 200 μg "Sephadex G-115" med glutaraldehyd. Efter inkubering ved 37°C i 24 timer frafiltreres det til "Sephadex" bundne trypsin. Efter afslutning af omsætningen fældes proteinerne ved tilsætning af 10 rumfang acetone. Analyse ved DISC PAGE viser en omdannelse til 25 ThrB30-OMe-h-In på 70%.

Eksempel 10

Den i eksempel 7 beskrevne fremgangsmåde gentages med t t det forbehold, at den anvendte ester er 2 M Thr-OBu (Bu er con tert.butyl) i Ν,Ν-dimethylacetamid. Omdannelsen til Thr -30 OBu^-h-In er 80%.

Eksempel 11 147109 13

Den i eksempel 8 beskrevne fremgangsmåde gentages med det forbehold, at den anvendte ester er 2 M Thr-OBu^ i N,N-dimethylacetamid. Omdannelsen til Thr -OBut-h-In er 30%.

5 Eksempel 12

Den i eksempel 9 beskrevne fremgangsmåde gentages med det forbehold, at den anvendte ester er 2 M Thr-OBut i N,N-dimethylacetamid. Omdannelsen til Thr^^-OBu^-h-In er 70%.

Eksempel 13 10 100 mg svineproinsulin opløses i 0,9 ml 3,33 M eddi kesyre, og der tilsættes 1 ml 2 M Thr-OMe i N,N-dimethylaceta-mid. Omsætningen udføres på analog måde som beskrevet i eksem- B3 ø pel 4. Omdannelsen til Thr -OMe-h-In er 80%.

Eksempel 14 15 100 mg svineproinsulin opløses i 0,9 ml 3,33 M eddi kesyre, og der tilsættes 1 ml 2 M Thr-OMe i N,N-dimethylaceta- mid. Blandingen behandles med immobiliseret trypsin på analog o B3 0 måde som beskrevet i eksempel 10. Omdannelsen til Thr -OMe- h-In er 40%.

20 Eksempel 15 100 mg svineproinsulin opløses i 0,9 ml 3,33 M eddikesyre, og der tilsættes 1 ml 2 M Thr-OMe i N,N-dimethyl-acetamid. Blandingen behandles med immobiliseret trypsin på analog måde som beskrevet i eksempel 9. Omdannelsen til 25 ThrB30-OMe-h-ln er 70%.

14 147109

Eksempel 16 100 mg svineproinsulin opløses i 0,9 ml 3,33 M eddikesyre, og der tilsættes 1 ml 2 M Thr-OBu*" i N,N-dimethylaceta-mid. Omsætningen udføres på analog måde som beskrevet i eksem-5 pel 4. Omdannelsen til ThrB3B-OBut-h-In er 80%.

Eksempel 17 100 mg svineproinsulin opløses i 0,9 ml 3,33 M eddikesyre, og der tilsættes 1 ml 2 M Thr-OBu** i N,N-dimethylaceta-mid. Blandingen behandles med trypsin, som er immobiliseret på 10 glasperler, på analog måde som beskrevet i eksempel 10. Omdannelsen til ThrB30-OBut-h-In er 40%.

Eksempel 18 100 mg svineproinsulin opløses i 0,9 ml 3,33 M eddi- t * kesyre, og der tilsættes 1 ml 2 M Thr-OBu i N,N-dimethylaceta-15 mid. Blandingen behandles med trypsin, som er immobiliseret på CNBr-aktiveret "Sephadex G-150", på analog måde som beskrevet i eksempel 9. Omdannelsen til ThrB30-OBut-h-In er 70%.

Eksempel 19 100 mg svineinsulin opløses i 0,5 ml 6 M eddikesyre, 20 og der tilsættes 1 ml 1 M Thr-OTmb (Tmb er 2,4,6-trimethylben-zyl) i Ν,Ν-dimethylacetamid. Der tilsættes yderligere 0,5 ml Ν,Ν-dimethylacetamid og 5 mg TPCK-behandlet trypsin i 0,1 ml vand. Reaktionsblandingen lades henstå ved 32°C i 44 timer. Efter afslutning af omsætningen udfældes proteinerne ved tilsæt-25 ning af 10 rumfang acetone. Analyse ved DISC PAGE viser en om- DO Λ dannelse til Thr -OTmb-h-In på 50%.

Claims

1. Fremgangsmåde til fremstilling af humant insulin eller humane insulinestere med den almene formel III ThrB30(R1)-OR4-h-In (III) 15 hvor -h-In betegner humant des-(ThrB3^)-insulinyl, R4 betegner en carboxylbeskyttelsesgruppe, og R3 betegner hydrogen eller en hydroxylbeskyttelsesgruppe, eller et salt eller kompleks deraf, kendetegnet ved, at én forbindelse med den almene formel I og forskellig fra humant insulin eller flere forbindelser med den 20 almene formel I S-S

1. I 2^3 R -Q -Cys-Cys-Q -Cys-Q -Cys-Asn (A-kæde) I I (21)

25. S (I)

2. I 5 I (22) (23) (29) - R -Q -Cys-Q -Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-R 30 (B-kæde) 16 147109 1. hvor Q betegner -Gly-Ile-Val-Glu-Gln-, Q betegner -Thr-Ser- Ile-, Q3 betegner -Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-, Q4 betegner -Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-, Q5 betegner -Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-, R1 betegner hydrogen, en basisk 5 aminosyre eller et peptidfragment indeholdende højst 36 aminosyrer, i hvilket den C-terminale aminosyre er en basisk amino-2 syre, R betegner hydrogen, en basisk aminosyre eller et pep- O tidfragment med en C-terminal basisk aminosyre, og R betegner en aminosyre eller et peptidfragment indeholdende højst 36 ami- 10 nosyrer, med det forbehold, at antallet af aminosyrer i R1 plus 3 1 antallet af aminosyrer i R ikke er større end 36, eller R sammen med R3 betegner en peptidbinding eller et peptidfragment indeholdende højst 36 aminosyrer, i hvilket den C-terminale aminosyre er en basisk aminosyre, eller komplekser eller salte 15 deraf omsættes med en L-threoninester med den almene formel II Thr(R5)-OR4 (II) 4 5 hvor R betegner en carboxylbeskyttelsesgruppe, og R betegner hydrogen eller en hydroxylbeskyttelsesgruppe, eller et salt deraf i en blanding af vand og ét eller flere organiske opløs-20 ningsmidler og i nærværelse af trypsin eller et aktivt trypsin-derivat, hvorefter beskyttelsesgruppen eller -grupperne om ønsket fjernes.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at 1 2 en eventuelt tilstedeværende basisk aminosyre R og/eller R og 25 den C-terminale aminosyre i et eventuelt tilstedeværende pep-tidfragment R og/eller R er lysin eller arginin.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved, at summen af aminosyrer i R^ og R3 eller antallet af 1 3 aminosyrer, som er til stede i R og R , såfremt de danner et 30 peptidfragment, ikke er over 34.

4. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 1-3, kendetegnet ved, at Rb er hydrogen.

5. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 1-3, kendetegnet ved, at R"*- er hydrogen eller Ala-Leu- 2 3

35 Glu-Gly-Pro-Pro-Gln-Lys-Arg-, R er hydrogen, R er -Ala, -Ser,