JPS58103323A - インシュリン含有混合物の分離法 - Google Patents
インシュリン含有混合物の分離法Info
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- JPS58103323A JPS58103323A JP57210699A JP21069982A JPS58103323A JP S58103323 A JPS58103323 A JP S58103323A JP 57210699 A JP57210699 A JP 57210699A JP 21069982 A JP21069982 A JP 21069982A JP S58103323 A JPS58103323 A JP S58103323A
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- Japan
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- insulin
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- parts
- separation
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/62—Insulins
- C07K14/625—Extraction from natural sources
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- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
天然の豚インシュリンにおけるＢ２Ｏ位のアラニンを化
学的または酵素的にスレオニンと交換することにより半
合成的方法で前配豚インシエリンをヒトインシュリンに
変換することは知られている（「Ｈｏｐｐｅ−８ｅｙｌ
ｓｒ’ａ Ｚ、 ｐｈｙｓｉｏｌｃｈｅｍｉＪ篇３５７
巻ａｌｌ！７５９〜７６７頁（１９７６年）、ｒ８ｃｉ
・ｎａ＊Ｊ第１７７巻８６２５〜６２６真（１９７２年
）ＪＮａｔｕｒｓＪ無２８０！第４１２〜４１３頁（１
９７９年＞、ｒｙ、崩。
学的または酵素的にスレオニンと交換することにより半
合成的方法で前配豚インシエリンをヒトインシュリンに
変換することは知られている（「Ｈｏｐｐｅ−８ｅｙｌ
ｓｒ’ａ Ｚ、 ｐｈｙｓｉｏｌｃｈｅｍｉＪ篇３５７
巻ａｌｌ！７５９〜７６７頁（１９７６年）、ｒ８ｃｉ
・ｎａ＊Ｊ第１７７巻８６２５〜６２６真（１９７２年
）ＪＮａｔｕｒｓＪ無２８０！第４１２〜４１３頁（１
９７９年＞、ｒｙ、崩。
Ｃｈ＠ｍ、 Ｅｌｏｏ、Ｊ第１０１巻第７５１〜７５２
頁（１９７９年） 、ｒＨｏｐｐｅ −８ｓｙｌｅｒ’
ａ Ｚ、 ｐｈｙａｉｏｌ、 Ｃｈｅｗ、 Ｊ第３５９
巻第７９９〜８０２頁（１９７８年）および［Ｂｉｏｏ
ｈｅｍ、 Ｂｉｏｐｈｙｓ、 ＡｅｔａＪ第１３３巻ｊ
ｌ１２１ｔ〜２２５頁（１９６７年）参照〕。
頁（１９７９年） 、ｒＨｏｐｐｅ −８ｓｙｌｅｒ’
ａ Ｚ、 ｐｈｙａｉｏｌ、 Ｃｈｅｗ、 Ｊ第３５９
巻第７９９〜８０２頁（１９７８年）および［Ｂｉｏｏ
ｈｅｍ、 Ｂｉｏｐｈｙｓ、 ＡｅｔａＪ第１３３巻ｊ
ｌ１２１ｔ〜２２５頁（１９６７年）参照〕。
この変換の目的は人間の糖尿病治療において。
免疫学的理由から、同種インシュリンが使用されうるこ
とである。
とである。
この治療の利点は、半合成工程で得られた粗製物質中の
１７７１９２６１体および不純物をヒトインシュリンか
ら確実に分離しうる場合にのみ達成されうる。
１７７１９２６１体および不純物をヒトインシュリンか
ら確実に分離しうる場合にのみ達成されうる。
既知の分離法は豚インシュリン成分からのヒトインシュ
リンの分離を確実に保証するには適めでない。文献に記
載されているアイノ酸分析から、半合成的ヒトインシュ
リンにおいて紘２５−のレベルまでの豚インシュリンに
よる汚染が起り得ることが見出されている。
リンの分離を確実に保証するには適めでない。文献に記
載されているアイノ酸分析から、半合成的ヒトインシュ
リンにおいて紘２５−のレベルまでの豚インシュリンに
よる汚染が起り得ることが見出されている。
再生可能な充填物質をクロマトグラフィーカラムに反復
使用することＫよりヒトインシュリンの豚インシュリン
または酵素による痕跡量の汚染すらも回避するためＫｔ
ｉ最適の分離効率を有する安価な使い捨て物質がカラム
充填剤として望ましい。分析用高速液体クロマトグラフ
ィーにおいては高分解能クロマトグラフィー分離は疎水
性の有機基を用いて誘導されたシリカゲル〆「逆相（ｖ
ｅｖ＠ｒｓｅｌ ｐｈａｓｅ） Ｊでのみ達成される。
使用することＫよりヒトインシュリンの豚インシュリン
または酵素による痕跡量の汚染すらも回避するためＫｔ
ｉ最適の分離効率を有する安価な使い捨て物質がカラム
充填剤として望ましい。分析用高速液体クロマトグラフ
ィーにおいては高分解能クロマトグラフィー分離は疎水
性の有機基を用いて誘導されたシリカゲル〆「逆相（ｖ
ｅｖ＠ｒｓｅｌ ｐｈａｓｅ） Ｊでのみ達成される。
しかしながらこの物質は高価なので使い捨てカラム充填
剤としてのその使用が制限されている。
剤としてのその使用が制限されている。
今やインシュリンの酵素的半合成工程から得られ大組製
混合物を、例えばクロロホルム／メタノール／水／ ）
リエチルアミン／蟻酸のようなある種の有機溶媒混合物
を使用して、商業上入手しうるシリｔＪｙルを充填し九
カラムでクロマトグラフィー分離するのがすべての他の
分−法よル優れていると見出された。この優越性は一方
では分離されるべき混合物の構成分の保持時間における
部分的に大きい相異そして他方ではカラム中の移行の迅
速さから生ずる。１回の操作後に捨てられるシリカゲル
の価格は処理畜れ九イン“シエリンと比較して無視され
うる。
混合物を、例えばクロロホルム／メタノール／水／ ）
リエチルアミン／蟻酸のようなある種の有機溶媒混合物
を使用して、商業上入手しうるシリｔＪｙルを充填し九
カラムでクロマトグラフィー分離するのがすべての他の
分−法よル優れていると見出された。この優越性は一方
では分離されるべき混合物の構成分の保持時間における
部分的に大きい相異そして他方ではカラム中の移行の迅
速さから生ずる。１回の操作後に捨てられるシリカゲル
の価格は処理畜れ九イン“シエリンと比較して無視され
うる。
従って本ａｖ４はインシュリン、インシュリン鋳導体お
よび場合によ〕不純物からなる混合物を分離するに当ｐ
、その混合物をシリカゲルで充填され九カラムでりａマ
ドグラフ処理することを特徴とする方法に関する。
よび場合によ〕不純物からなる混合物を分離するに当ｐ
、その混合物をシリカゲルで充填され九カラムでりａマ
ドグラフ処理することを特徴とする方法に関する。
この方法はインシュリンｏｎ製、およびトリプシン普工
祉同様の酵素およびインシュリンエステルまた社その他
インシュリン誘導体からのインシュリンまたはその分解
産物の分離に特に適する。
祉同様の酵素およびインシュリンエステルまた社その他
インシュリン誘導体からのインシュリンまたはその分解
産物の分離に特に適する。
カラム充填剤としては商業上入手しうるあらゆるシリカ
ゲル、例えばメルク社（ドイツ国ダルムスタット社）の
商業的製品たる５ｉ０２６０があげられる。
ゲル、例えばメルク社（ドイツ国ダルムスタット社）の
商業的製品たる５ｉ０２６０があげられる。
クロマトグラフィー用溶離剤としては、一方でインシュ
リンエステルまた社インシュリン誘導体がそしてもう一
方ではインシュリンｔｉｔｔその分解産物が商業上入手
しうる薄層クロマトグラフィー用プレート上に異なるｐ
Ｈ値を示すようなすべての溶離剤混合−が使用されうる
。
リンエステルまた社インシュリン誘導体がそしてもう一
方ではインシュリンｔｉｔｔその分解産物が商業上入手
しうる薄層クロマトグラフィー用プレート上に異なるｐ
Ｈ値を示すようなすべての溶離剤混合−が使用されうる
。
粗生成物をクロロホルム１５００〜２１００容量部、メ
タノール１０００〜１５ ［１容ｔＳ、水ｓｓｏ〜４５
０Ｖ量部、トリエチルアミン３５〜５５容量部および蟻
＠０〜１５容量部からなる溶離剤混合物中でクロマトグ
ラフ処理する場合に％に良好な分離効果が達成される。
タノール１０００〜１５ ［１容ｔＳ、水ｓｓｏ〜４５
０Ｖ量部、トリエチルアミン３５〜５５容量部および蟻
＠０〜１５容量部からなる溶離剤混合物中でクロマトグ
ラフ処理する場合に％に良好な分離効果が達成される。
この方法紘豚インシュリンをヒトインシュリンＫｌｌ素
的に変換させる場合に生ずるような混合物において豚イ
ンシュリンおよびトリプシンからヒトインシエリンーＢ
ＳＯ−ジ第３プチルメレオニンを分離する場合に％に好
都合である。
的に変換させる場合に生ずるような混合物において豚イ
ンシュリンおよびトリプシンからヒトインシエリンーＢ
ＳＯ−ジ第３プチルメレオニンを分離する場合に％に好
都合である。
例 １
ヒトインシュリン−ＢＳＯ−ジ第３ブチルスレオニン７
０−および豚インシュリン５０９ｇからなる混４Ｍ−＠
４ｆをクロロホルム／メタノール／水／トリエチルアイ
ン／蟻酸（１８００ｔ１５００１３７５１４５：？（φ
）〕からなる溶媒２〇−中に溶解させそして使い捨て注
射器を用いてロパール゛（Ｌｏｂａｒ＠） （戦時サイ
ズＣ）充填ずみカラムに適用する。このカラムを同じ溶
媒を用いて展翻させる。溶媒先熾が出現し友後、個々の
フラクシヨン（１０−）を集める。
０−および豚インシュリン５０９ｇからなる混４Ｍ−＠
４ｆをクロロホルム／メタノール／水／トリエチルアイ
ン／蟻酸（１８００ｔ１５００１３７５１４５：？（φ
）〕からなる溶媒２〇−中に溶解させそして使い捨て注
射器を用いてロパール゛（Ｌｏｂａｒ＠） （戦時サイ
ズＣ）充填ずみカラムに適用する。このカラムを同じ溶
媒を用いて展翻させる。溶媒先熾が出現し友後、個々の
フラクシヨン（１０−）を集める。
ヒトインシュリン−Ｂ Ｓ Ｏ−（Ｂｕｔ）２はフラク
シヨンＳ７〜５３に現われる。これらを合し１回転蒸発
器で５０〜５０−となるまで濃鵬する。この溶液中に約
５００−のアセトンを添加しそして沈毅した生成物を遠
心分１１１１によシ単一する。
シヨンＳ７〜５３に現われる。これらを合し１回転蒸発
器で５０〜５０−となるまで濃鵬する。この溶液中に約
５００−のアセトンを添加しそして沈毅した生成物を遠
心分１１１１によシ単一する。
豚インシュリンはフラクシヨン１２０〜１３７中ＫＷ離
されそして前記のようにして単離される。
されそして前記のようにして単離される。
いずれの生成物も軽度の真空下に乾燥する。
収量エヒトインシエリ７−Ｂ３０−（Ｂｕｔ）２２．５
９ ｔインシュリン（豚） １０３ｆ 例 ２ ｙａｍｌ−ｇ ３７１’チルオキシカルボニル−Ｂ２Ｏ
−ジ諮３ブチルスレオニン−インシュリン（４ｆ）を例
１にお妙ると同様にして溶解させ、そしてクロロホルム
で平衡化させたシリカゲル５ｔｏ２−６゜ａｏｏｒを充
填し九カラＡ（２，５Ｘ５０ｍ）Ｋ適用する。このカラ
ムを例１におけると同じ溶媒混合物を用いて溶離する。
９ ｔインシュリン（豚） １０３ｆ 例 ２ ｙａｍｌ−ｇ ３７１’チルオキシカルボニル−Ｂ２Ｏ
−ジ諮３ブチルスレオニン−インシュリン（４ｆ）を例
１にお妙ると同様にして溶解させ、そしてクロロホルム
で平衡化させたシリカゲル５ｔｏ２−６゜ａｏｏｒを充
填し九カラＡ（２，５Ｘ５０ｍ）Ｋ適用する。このカラ
ムを例１におけると同じ溶媒混合物を用いて溶離する。
最初に埃われるピークがＢｌ−ＢＯ（１！−インシュリ
ン−Ｂ２Ｏ−（Ｂｕｔ）２を含有してお９、豚インシュ
リンは遅い方のフラクシ曹ン中に溶離される。後処理は
例１におけると同様にして行われる。
ン−Ｂ２Ｏ−（Ｂｕｔ）２を含有してお９、豚インシュ
リンは遅い方のフラクシ曹ン中に溶離される。後処理は
例１におけると同様にして行われる。
例 ５
例１におけると同じ混合物（４ｔ）をエタノール７０１
！／）リス緩慟液（０，０５Ｍ％ｐＨ８，０）３０、−
を用いて平衡化したロバール充填ずみカラムＣに適用し
そして同じ溶離剤を用いてタロマドグラフ＠ｍする。相
互に分離されえヒトインシ具リンＢ５０−ジ１ｌＲ３フ
チルスレオニンおよび豚インシュリンを含有する相当す
ゐフラクシヨンを例１におけると同様にして後処理する
。
！／）リス緩慟液（０，０５Ｍ％ｐＨ８，０）３０、−
を用いて平衡化したロバール充填ずみカラムＣに適用し
そして同じ溶離剤を用いてタロマドグラフ＠ｍする。相
互に分離されえヒトインシ具リンＢ５０−ジ１ｌＲ３フ
チルスレオニンおよび豚インシュリンを含有する相当す
ゐフラクシヨンを例１におけると同様にして後処理する
。
例 ４
未精製の豚インシュリン（４ｔ）をクロロホルム／メタ
ノール／水／ ）リエチルア電ン／蟻酸（１２００１１
１００１３７０：４７１１１）の混合物中に溶解させそ
して例２におけるようにしてシリカゲルカラム上でクロ
マトグラフ処理する。
ノール／水／ ）リエチルア電ン／蟻酸（１２００１１
１００１３７０：４７１１１）の混合物中に溶解させそ
して例２におけるようにしてシリカゲルカラム上でクロ
マトグラフ処理する。
１０−ずつに分別され大連出液を例１におけるようにし
て後処理する。ＨＰＬＣおよびポリアクリル了ｉドｙル
電気泳動における再検査によれば純粋な豚インシュリン
を含有するフラクシヨンを合する。収量＆６１ｆ
て後処理する。ＨＰＬＣおよびポリアクリル了ｉドｙル
電気泳動における再検査によれば純粋な豚インシュリン
を含有するフラクシヨンを合する。収量＆６１ｆ
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １）インシエリン、インシュリン誘導体および場合によ
〕不純物からなる混合物を分離するに当〕、この混合物
をシリカゲルを充゛填したカラムでタロ實トゲラフ処理
することを特徴とする方法。 ２）クロマトグラフィーがりＥＩＥＩホルム１５００〜
２１００容量部、メタノール１０００〜１５００容量部
、水３５０〜４５０容量部、トリエチルアｉ：１５５〜
５５容量部および蟻ＩｌＯ〜１５容量部からなる溶腸剤
混合物中で遂行されることを脣黴とする前記特許Ｉ１１
求の範囲第１項記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE3147842.5 | 1981-12-03 | ||
| DE19813147842 DE3147842A1 (de) | 1981-12-03 | 1981-12-03 | "verfahren zur trennung von gemischen aus insulin, insulinderivaten und gegebenenfalls verunreinigungen" |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS58103323A true JPS58103323A (ja) | 1983-06-20 |
| JPH0354678B2 JPH0354678B2 (ja) | 1991-08-20 |
Family
ID=6147790
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP57210699A Granted JPS58103323A (ja) | 1981-12-03 | 1982-12-02 | インシュリン含有混合物の分離法 |
Country Status (15)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4677192A (ja) |
| EP (1) | EP0082359B1 (ja) |
| JP (1) | JPS58103323A (ja) |
| KR (1) | KR880002607B1 (ja) |
| AR (1) | AR230430A1 (ja) |
| AT (1) | ATE18057T1 (ja) |
| AU (1) | AU563350B2 (ja) |
| CA (1) | CA1245633A (ja) |
| DE (2) | DE3147842A1 (ja) |
| DK (1) | DK162104C (ja) |
| ES (1) | ES8607343A1 (ja) |
| FI (1) | FI75349C (ja) |
| GR (1) | GR77764B (ja) |
| IL (1) | IL67378A (ja) |
| ZA (1) | ZA828864B (ja) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3511269A1 (de) * | 1985-04-12 | 1986-10-09 | Veb Berlin-Chemie, Ddr 1199 Berlin | Verfahren zur reinigung von insulin |
| DE4028120C2 (de) * | 1990-09-05 | 1996-09-19 | Hoechst Ag | Verfahren zur Reinigung von Insulin und/oder Insulinderivaten |
| US5278284A (en) * | 1992-05-14 | 1994-01-11 | Miller Brewing Company | Protein purification method |
| US5451660A (en) * | 1993-12-13 | 1995-09-19 | Genentech, Inc. | Method for purifying polypeptides |
| DE19652713C2 (de) * | 1996-12-18 | 2001-11-22 | Aventis Pharma Gmbh | Verfahren zur Reinigung von Insulin und Insulinderivaten durch Chromatographie an stark saurem Kationenaustauscher |
| EP3171888B1 (en) | 2014-07-21 | 2022-12-28 | Merck Sharp & Dohme LLC | Chromatography process for purification of inlsulin and insulin analogs |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS532492A (en) * | 1976-06-26 | 1978-01-11 | Shimizu Seiyaku Kk | Process for preparing pure insuline |
| JPS5542185A (en) * | 1978-09-22 | 1980-03-25 | Kawasaki Heavy Ind Ltd | Detecting device for arc welding or the like |
| JPS5587283A (en) * | 1978-12-25 | 1980-07-01 | Kawasaki Heavy Ind Ltd | Recognizing method and servo unit with recognizing function |
-
1981
- 1981-12-03 DE DE19813147842 patent/DE3147842A1/de not_active Withdrawn
-
1982
- 1982-11-30 DE DE8282111061T patent/DE3269252D1/de not_active Expired
- 1982-11-30 AT AT82111061T patent/ATE18057T1/de not_active IP Right Cessation
- 1982-11-30 EP EP82111061A patent/EP0082359B1/de not_active Expired
- 1982-12-01 IL IL67378A patent/IL67378A/xx not_active IP Right Cessation
- 1982-12-01 ES ES517844A patent/ES8607343A1/es not_active Expired
- 1982-12-01 GR GR69942A patent/GR77764B/el unknown
- 1982-12-01 AR AR291468A patent/AR230430A1/es active
- 1982-12-01 FI FI824135A patent/FI75349C/fi not_active IP Right Cessation
- 1982-12-02 ZA ZA828864A patent/ZA828864B/xx unknown
- 1982-12-02 AU AU91102/82A patent/AU563350B2/en not_active Ceased
- 1982-12-02 DK DK536282A patent/DK162104C/da not_active IP Right Cessation
- 1982-12-02 JP JP57210699A patent/JPS58103323A/ja active Granted
- 1982-12-02 CA CA000416875A patent/CA1245633A/en not_active Expired
- 1982-12-03 KR KR8205395A patent/KR880002607B1/ko active
-
1985
- 1985-12-04 US US06/804,325 patent/US4677192A/en not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS532492A (en) * | 1976-06-26 | 1978-01-11 | Shimizu Seiyaku Kk | Process for preparing pure insuline |
| JPS5542185A (en) * | 1978-09-22 | 1980-03-25 | Kawasaki Heavy Ind Ltd | Detecting device for arc welding or the like |
| JPS5587283A (en) * | 1978-12-25 | 1980-07-01 | Kawasaki Heavy Ind Ltd | Recognizing method and servo unit with recognizing function |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ZA828864B (en) | 1984-05-30 |
| JPH0354678B2 (ja) | 1991-08-20 |
| DE3147842A1 (de) | 1983-06-23 |
| DK162104C (da) | 1992-02-17 |
| AU563350B2 (en) | 1987-07-09 |
| ES517844A0 (es) | 1986-05-16 |
| FI75349B (fi) | 1988-02-29 |
| EP0082359B1 (de) | 1986-02-19 |
| GR77764B (ja) | 1984-09-25 |
| IL67378A0 (en) | 1983-05-15 |
| AR230430A1 (es) | 1984-04-30 |
| ES8607343A1 (es) | 1986-05-16 |
| FI824135A0 (fi) | 1982-12-01 |
| AU9110282A (en) | 1983-06-09 |
| ATE18057T1 (de) | 1986-03-15 |
| FI75349C (fi) | 1988-06-09 |
| FI824135L (fi) | 1983-06-04 |
| EP0082359A1 (de) | 1983-06-29 |
| US4677192A (en) | 1987-06-30 |
| KR840002771A (ko) | 1984-07-16 |
| KR880002607B1 (ko) | 1988-12-04 |
| DE3269252D1 (en) | 1986-03-27 |
| DK536282A (da) | 1983-06-04 |
| IL67378A (en) | 1985-12-31 |
| DK162104B (da) | 1991-09-16 |
| CA1245633A (en) | 1988-11-29 |
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