JP2020523999A - クロマトグラフィーを利用してｄ−プシコースボレート錯体からｄ−プシコースを生産する方法、及びｄ−プシコースを含む組成物 - Google Patents

Abstract

本出願は、Ｄ−プシコースボレート錯体（ｃｏｍｐｌｅｘ）を含む組成物を、２価陽イオンが含まれているクロマトグラフィーに投入するステップと、前記Ｄ−プシコースボレート錯体を含む組成物を、Ｄ−プシコースを含む分画物（ｉ）とボレートを含む分画物（ｉｉ）とに分離するステップとを含むＤ−プシコースの生産方法に関する。【選択図】図４

Description

本出願は、クロマトグラフィーを利用してＤ−プシコースボレート錯体（ｃｏｍｐｌｅｘ）からＤ−プシコースを生産する方法、及びＤ−プシコースを含む組成物に関する。

Ｄ−プシコースは、無花果及び干しぶどうなどに極少量存在する天然糖であって、砂糖に比べ７０％の甘味度を有する単糖類である。Ｄ−プシコースは、果糖や砂糖とは違って、人体内で代謝されないためカロリーがほとんどなく、血糖の上昇に影響がなく、非う食及び抗う食機能で歯牙の健康に役立つという事実が公知となっている。

そのため、Ｄ−プシコースは甘味料としての関心が高まっているが、自然界に極めて珍しく存在するため、食品産業に適用するためにはこれを効率よく生産する技術の開発が必要である。

ここに、本発明者達は、Ｄ−プシコースの生産方法として、葡萄糖を果糖に異性化した後、これをＤ−プシコースエピマー化酵素を生産する固定化菌体と反応させてＤ−プシコースを経済的に生産する方法を報告（韓国公開特許第１０−２０１１−００３５８０５号、以下、「酵素変換方法」と記載する）したことがあり、このような酵素変換方法にボレート（Ｂｏｒａｔｅ）を利用する場合、Ｄ−プシコースの転換率を著しく上昇させ得ることが公知となったことがある（Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４４（２００９）８２２−８２８、ＡＰＰＬＩＥＤ ＡＮＤ ＥＮＶＩＲＯＮＭＥＮＴＡＬ ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ、Ｍａｙ ２００８、ｐ．３００８−３０１３）。

ただし、前記ボレートを利用した酵素変換方法を産業的生産に適用するためには、酵素変換方法に用いたボレート（Ｂｏｒａｔｅ）を分離し、回収してリサイクルを可能にすることができる経済性を考慮した工程の開発が求められる。さらに、ＷＨＯ（Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ）は、飲用水内に含まれるホウ素の含量を０．５ｐｐｍ以下に推奨しているため、ホウ素を除去する必要性が存在する。

酵素変換方法に用いられたボレートは、酵素変換方法により生成された糖液でホウ酸（Ｈ_３ＢＯ_３）の形態で存在し、ｐＫａの値が約９で酵素変換反応液（ｐＨ５から７）でほぼ非解離の状態で存在するため、イオンの状態ではほとんど存在しない。

ボレートを除去するための従来の技術には、アルカリ剤を供給してｐＨを９から１１に調整することでホウ酸をポリホウ酸に切り替えた後、低圧逆浸透濾過を行って除去する方法（韓国登録特許第１０−１３８４９９２号）、及びｐＨを９．０から１０．５の領域に調節してホウ酸除去の効率を低めるスケール（Ｓｃａｌｅ）を除去した後、逆浸透工程を行ってボレートを除去する方法が報告されたことがある（韓国登録特許第１０−１０３０１９２号）。しかし、酵素変換方法によって生成された液状プシコースの場合、ｐＨがアルカリ領域に切り替わる際、急激な色価の下落によって脱色の費用が上昇し、アルカリ重合反応によってプシコースの含量が変化し、投入されたアルカリ剤を除去するための工程がさらに必要なので、産業化のための経済性が低下するという問題点がある。

このような背景の下、本発明者達は、ボレートを利用した酵素変換方法で製造したプシコースに残っているボレートを効率よく分離及び除去するために鋭意研究に努めた結果、擬似移動床クロマトグラフィーを利用する場合、プシコースを含む分画物と果糖及びボレートを含む分画物とを効果的に分離できることを確認することで本出願を完成した。

本出願の目的は、Ｄ−プシコースボレート錯体（ｃｏｍｐｌｅｘ）を含む組成物を２価陽イオンが含まれているクロマトグラフィーに投入するステップと、前記Ｄ−プシコースボレート錯体を含む組成物を、Ｄ−プシコースを含む分画物（ｉ）とボレートを含む分画物（ｉｉ）とに分離するステップとを含むＤ−プシコースの生産方法を提供することにある。

本出願のまた他の目的は、Ｄ−プシコースの含量が乾燥固形分を基準に９９％（ｗ／ｗ）以上１００％（ｗ／ｗ）未満で、ボレートの含量が０超過０．５ｐｐｍ（ｗ／ｗ）未満である、Ｄ−プシコースを含む組成物を提供することにある。

以下では、本出願をさらに詳しく説明する。

本出願で開示されるそれぞれの説明及び実施の態様は、他の説明及び実施の様態にも適用されてよい。すなわち、本出願で開示された多様な要素のすべての組み合わせが本出願の範疇に属する。また、下記で記述される具体的な叙述によって本出願の範疇が制限されるとはいえない。

本出願の目的を達成するための一態様として、本出願は、Ｄ−プシコースボレート錯体（ｃｏｍｐｌｅｘ）を含む組成物を、２価陽イオンが含まれているクロマトグラフィーに投入するステップと、前記Ｄ−プシコースボレート錯体を含む組成物を、Ｄ−プシコースを含む分画物（ｉ）とボレートを含む分画物（ｉｉ）とに分離するステップとを含むＤ−プシコースの生産方法を提供する。

また、本出願のＤ−プシコースの生産方法は、前記投入するステップ以前に、Ｄ−プシコース３−エピマー化酵素、前記酵素を発現する菌株または前記菌株の培養物にＤ−果糖及びボレート（ｂｏｒａｔｅ）を接触させて前記Ｄ−プシコースボレート錯体を含む組成物を得るステップをさらに含むことができる。

本出願で用いられた用語である『分画』とは、一般に、クロマトグラフィー法などによって各種の構成成分または混合物や組成物からそれぞれの成分または特定のグループに分離する操作を意味する。これに伴い、このような操作によって得られた特定の成分を分離し出した物質を、本出願では『分画物』と表現することで、分画と区分して用いられた。

したがって、Ｄ−プシコースを含む分画物とは、Ｄ−プシコースボレート錯体を含む組成物の中で、クロマトグラフィー分離操作を介して得られた物質を意味する。また、ボレートを含む分画物とは、Ｄ−プシコースボレート錯体を含む組成物の中で、Ｄ−プシコースを含む分画物を除いた分画物を意味する。具体的に、本出願におけるプシコース分画物とボレート分画物の区分は、ボレート及び／または果糖の分画物固形分内のボレート及び／または果糖の含量が最高になる分画物以後、分画物内プシコースの分画物固形分内のプシコースの含量が最高になる分画物以前を中心に区分することができる。さらに、ボレート及び／または果糖の含量が最高になる分画物以後、ボレート及び／または果糖の純度が、果糖の含量が最高になる分画物に比べ８０％（ｗ／ｗ）以下、１５％（ｗ／ｗ）以下、または１％（ｗ／ｗ）以下になる地点以後、プシコースの含量が最高になる分画物以前、プシコースの純度が、プシコースの含量が最高になる分画物に比べ７０％（ｗ／ｗ）以下、１０％（ｗ／ｗ）以下、１％（ｗ／ｗ）以下、または０．４％（ｗ／ｗ）以下になる地点以前に区分することができる。

本出願のＤ−プシコース３−エピマー化酵素（以下、「プシコースエピマー化酵素」と記載する）は、Ｄ−果糖をＤ−プシコースにエピマー化させる活性を有するタンパク質であれば制限なく含むことができ、前記タンパク質を内在的に発現する菌株、前記タンパク質を発現するように形質転換された菌株、前記菌株の培養物、または前記培養物から分離されたタンパク質をプシコースエピマー化酵素として用いることができる。

本出願のＤ−プシコース３−エピマー化酵素は、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）またはカイスティア・グラヌリ（Ｋａｉｓｔｉａ ｇｒａｎｕｌｉ）由来の野生型プシコースエピマー化酵素またはその変異体であってよく、具体的に、配列番号１、配列番号２、配列番号３または配列番号４のアミノ酸配列と７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９９％以上または１００％の遺伝的相同性を有するプシコースエピマー化酵素であってよい。また、このような相同性を有するアミノ酸配列として、プシコースエピマー化酵素活性を有するアミノ酸配列であれば、一部の配列が欠失、変形、置換または付加されたアミノ酸配列も、本出願のアミノ酸配列の範囲に含まれるものと解釈されなければならない。さらに具体的に、配列番号１または配列番号４のアミノ酸配列を有するプシコースエピマー化酵素であってよい。

本出願の菌株は、コリネバクテリウム・グルタミクムＫＣＣＭ１１４０３Ｐ（韓国登録特許第１０−１４５５７５９号）であってよいが、これに制限されない。

本出願のＤ−果糖は、ショ糖の加水分解によって製造されるか、ぶどう糖を異性化して製造されたものであってよい。これを介し、果糖、ショ糖及びぶどう糖のように普遍化され低廉な原料を使って高い収率でＤ−プシコースを製造することができるので、プシコースの大量生産を可能にすることができる。また、ボレートは、ホウ酸の水素原子が金属元素に置換された塩類であって、市販されるものをそのまま用いることができる。

また、本出願のＤ−プシコースの生産方法は、薬品再生型イオン交換装置（例えば、２床３塔式イオン交換装置または２床２塔式イオン交換装置）を有する設備に糖液を通して金属イオンを除去するステップをさらに含むことができる。前記金属イオンを除去するステップは、前記Ｄ−プシコースボレート錯体を含む組成物を得るステップ以後、及び／または前記Ｄ−プシコースボレート錯体（ｃｏｍｐｌｅｘ）を含む組成物を２価陽イオンが含まれているクロマトグラフィーに投入するステップ以前にさらに含まれてよい。

本出願によれば、本出願の前記Ｄ−プシコースボレート錯体を含む組成物は、乾燥固形分基準のボレートの含量が２５％（ｗ／ｗ）未満であってよい。具体的に、本出願の組成物は、乾燥固形分基準のボレートの含量が６．２５％（ｗ／ｗ）から２５％（ｗ／ｗ）または６．２５％（ｗ／ｗ）から２１．０５％（ｗ／ｗ）であってよい。

本出願によれば、本出願のＤ−プシコースを含む分画物は、乾燥固形分基準のボレートの含量が０．５ｐｐｍ（ｗ／ｗ）未満であってよい。具体的に、Ｄ−プシコースを含む分画物は、乾燥固形分基準のボレートの含量が０．１ｐｐｍ（ｗ／ｗ）から０．４５ｐｐｍ（ｗ／ｗ）、０．０５ｐｐｍ（ｗ／ｗ）から０．４５ｐｐｍ（ｗ／ｗ）、０．１ｐｐｍ（ｗ／ｗ）から０．４ｐｐｍ（ｗ／ｗ）、０．０５ｐｐｍ（ｗ／ｗ）から０．３９ｐｐｍ（ｗ／ｗ）、０．１ｐｐｍ（ｗ／ｗ）から０．３９ｐｐｍ（ｗ／ｗ）、または０．０５ｐｐｍ（ｗ／ｗ）から０．３５ｐｐｍ（ｗ／ｗ）であってよい。

本出願によれば、本出願のＤ−プシコースを含む分画物は、乾燥固形分基準のＤ−プシコースの含量が８５％（ｗ／ｗ）以上であってよい。具体的に、本出願のＤ−プシコースを含む分画物は、乾燥固形分基準のＤ−プシコースの含量が８５％（ｗ／ｗ）から９９．９％（ｗ／ｗ）、９０％（ｗ／ｗ）から９９．９％（ｗ／ｗ）、９０％（ｗ／ｗ）から９９．５％（ｗ／ｗ）、９１％（ｗ／ｗ）から９９．９％（ｗ／ｗ）、９１％（ｗ／ｗ）から９９．５％（ｗ／ｗ）、９８．０％（ｗ／ｗ）から９９．９％（ｗ／ｗ）、９８．０％（ｗ／ｗ）から９９．５％（ｗ／ｗ）、９９．０％（ｗ／ｗ）から９９．９％（ｗ／ｗ）、または９９．０％（ｗ／ｗ）から９９．５％（ｗ／ｗ）であってよい。

また、本出願によれば、本出願のＤ−プシコースを含む分画物はＤ−果糖を含んでよく、具体的に、乾燥固形分基準のＤ−果糖の含量が１０％（ｗ／ｗ）以下、さらに具体的に、０．１％（ｗ／ｗ）から９．９％（ｗ／ｗ）、０．１％（ｗ／ｗ）から９．５％（ｗ／ｗ）、０．２％（ｗ／ｗ）から９．５％（ｗ／ｗ）、０．１％（ｗ／ｗ）から９％（ｗ／ｗ）、０．１％（ｗ／ｗ）から５％（ｗ／ｗ）、０．１％（ｗ／ｗ）から２％（ｗ／ｗ）、または０．１％（ｗ／ｗ）から１％（ｗ／ｗ）であってよい。

本出願によれば、前記クロマトグラフィーは、擬似移動床（ＳＭＢ；Ｓｉｍｕｌａｔｅｄ Ｍｏｖｉｎｇ Ｂｅｄ）クロマトグラフィーであるとともに、陽イオン交換樹脂が充填されたコラム状で含んでよい。このような２価陽イオンは、カルシウムイオン（Ｃａ^２＋）、バリウムイオン（Ｂａ^２＋）、ストロンチウムイオン（Ｓｒ^２＋）などであってよく、具体的にカルシウムイオンであってよい。

また、本出願によれば、本出願の擬似移動床クロマトグラフィーは、４個以上のコラムを含んでよい。さらに、本出願の擬似移動床クロマトグラフィーは、５０から７０℃の水で溶離を実施することができる。具体的に、前記溶離は、５５から６５℃または５８から６２℃の水で実施することができる。

一方、本出願によれば、前記Ｄ−プシコースボレート錯体を含む組成物のｐＨは５から７であってよく、前記Ｄ−プシコースボレート錯体を含む組成物を２価陽イオンが含まれているクロマトグラフィーに投入するステップの前にｐＨを５から７に調整するか維持させることができる。前記Ｄ−プシコースボレート錯体を含む組成物のｐＨを５から７にすることで、Ｄ−プシコースの分解による着色などの現象が防止され得る。

さらに、本出願によれば、前記Ｄ−プシコースを含む分画物（ｉ）をホウ素選択性イオン交換樹脂を充填したイオン交換塔に通すことで、微量の残留ボレートを除去できるステップをさらに含むことができる。

本出願のコラムに充填される陽イオン交換樹脂（吸着剤）は、ホウ素を選択的に吸着できるものであれば限定されることなく利用可能であり、具体的に、官能基として多価アルコール基を導入した、例えば、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ＩＲＡ７４３、Ｐｕｒｏｌｉｔｅ Ｓ１０８などが挙げられる。

また、本出願によれば、ボレートを含む分画物（ｉｉ）は、前記Ｄ−プシコースボレート錯体を含む組成物内のボレートの含量１００重量部に対して９５重量部以上であってよい。

また、本出願によれば、Ｄ−プシコースボレート錯体を含む組成物は、果糖をさらに含むことができる。この場合、前記ボレートを含む分画物（ｉｉ）内のボレートは、前記Ｄ−プシコースボレート錯体を含む組成物内のボレートの含量１００重量部に対して９５重量部以上であり、果糖は、前記Ｄ−プシコースボレート錯体を含む組成物内の果糖の含量１００重量部に対して９５重量部以上であってよい。

前記ボレートを含む分画物（ｉｉ）内のボレートの含量及び果糖の含量は、Ｄ−プシコースボレート錯体を含む組成物内の重量部の代わりにＤ−プシコースを含む分画物（ｉ）とボレートを含む分画物（ｉｉ）の合計であってよく、具体的に当該含量は、９５重量部以上、９６重量部以上、９７重量部以上、９８重量部以上、９９重量部以上、９９．１重量部以上、または９９．５重量部以上であってよく、１００重量部を超過しないことがある。

ボレートを含む分画物（ｉｉ）内のボレート及び果糖を前記範囲で含んで、ボレートを含む分画物（ｉｉ）を再使用することができる。

本出願の他の態様として、本出願は、Ｄ−プシコースの含量が乾燥固形分を基準に８５％（ｗ／ｗ）から９９．９％（ｗ／ｗ）であり、ボレートの含量が０超過０．５ｐｐｍ（ｗ／ｗ）未満である、Ｄ−プシコースを含む組成物を提供する。

前記Ｄ−プシコースを含む組成物は、Ｄ−果糖を乾燥固形分基準に１０％（ｗ／ｗ）以下で含む。また、前記Ｄ−プシコースを含む組成物は、クロマトグラフィーで分離されたＤ−プシコースを含む分画物である。

このような態様と係わる具体的な内容は、前述したＤ−プシコースの生産方法と係わって記載されたものをそのまま適用することができるので、省略する。

以下では、図４である、本出願のＤ−プシコースの生産工程図を参照しつつ、本発明を簡単に説明する。まず、ステップ（１）として、果糖とボレートを混合した後、ステップ（２）として、ステップ（１）で得られた混合物にＤ−プシコース３−エピマー化酵素を接触させて酵素反応工程を行う。次いで、ステップ（３）として、Ｄ−プシコース、残余果糖、及びボレートであるＤ−プシコースボレート錯体を得た後、ステップ（４）として、ＳＭＢクロマトグラフィーを利用してＤ−プシコース分画物（ｉ）とボレート分画物（ｉｉ）を分離することになる。ここで、ステップ（４）から得られたボレート分画物（ｉｉ）は、残余果糖とボレートを含むものなので、ステップ（１）に循環して再使用することができる。一方、ステップ（４）から得られたＤ−プシコース分画物（ｉ）は、前記のところのように、必要に応じて、ホウ素選択性イオン交換樹脂を充填したイオン交換塔に通して微量の残留ボレートをさらに除去することができる。

本出願のプシコースの生産方法及びボレートの分離方法は、ボレートを利用した酵素変換方法で製造したプシコースに残っているボレートを効率よく分離及び除去することができるという効果がある。
また、本出願の方法をプシコースの生産に利用する場合、原料である果糖とボレートをプシコースから効果的に分離することができるので、原料のリサイクルが可能であるという利点がある。

本出願の実施例１のＤ−プシコースエピマー化酵素反応にボレートを添加した場合（実験例１）と添加していない場合（比較例１）の、Ｄ−果糖からＤ−プシコースへの転換の結果に対するＨＰＬＣクロマトグラムである。 本出願の擬似移動床（ＳＭＢ）クロマトグラフィーによって分画されたＤ−プシコース分画物のＨＰＬＣクロマトグラムである。 本出願の擬似移動床（ＳＭＢ）クロマトグラフィーによって分画されたボレート分画物のＨＰＬＣクロマトグラムである。 本出願のＤ−プシコースの生産工程図である。

以下、本出願を実施例によってより詳しく説明する。しかし、これら実施例は本出願を例示的に説明するためのものであって、本出願の範囲がこれら実施例によって制限されるものではない。本明細書に記載されていない内容は、本出願の技術分野または類似の分野で熟練した者であれば、十分認識して類推することができるものであるため、その説明を省略する。

実施例１：ボレート及び酵素変換方法を利用したＤ−プシコースの生産
アグロバクテリウム・ツメファシエンス由来のプシコースエピマー化酵素の変異体を発現する組換菌株として公知（韓国登録特許第１０−１４５５７５９号）となっているコリネバクテリウム・グルタミクム（ＫＣＣＭ１１４０３Ｐ）を利用して酵素変換反応を進めた。０．１Ｍ果糖を水に溶解させた後、０．０５Ｍボレート及び１０ｍＭ ＭｎＣｌ_２を添加（実験例１）するか、１０ｍＭ ＭｎＣｌ_２のみを添加（比較例１）して酵素変換反応のための原料を製造し、これに前記菌株［２０％（ｗ／ｗ）］を添加してｐＨ ８．０、５５℃の条件下で３時間反応を進めた。

その後、ＨＰＬＣ分析を介して前記プシコースエピマー化酵素の基質（Ｄ−果糖）と生成物（プシコース）のピーク面積（ａｒｅａ）値を比べて転換率を計算し、前記ＨＰＬＣ分析は、８０℃に設定されたコラム（ＢＰ−１００ Ｃａ^２＋ ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ ｃｏｌｕｍｎ）に試料を注入した後、移動相溶媒として蒸留水を０．６ｍｌ／ｍｉｎの速度で通過させる条件で行った。

その結果、Ｄ−プシコースへの転換率は、比較例１が２５％である反面、実験例１は５６％で、比較例１に比べて２２４％上昇することを確認することができた（図１）。

実施例２：ボレートの分離
２−１．ＳＭＢクロマトグラフィーを利用したボレート分離の確認
Ｄ−プシコースボレート錯体が含まれている組成物（ボレート、Ｄ−果糖及びＤ−プシコース、以下、供給物）からボレートが除去されたＤ−プシコースを分離するため、擬似移動床（ＳＭＢ：Ｓｉｍｕｌａｔｅｄ Ｍｏｖｉｎｇ Ｂｅｄ）クロマトグラフィーを利用した。前記ＳＭＢクロマトグラフィーは、改善された擬似移動床システム（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｓｉｍｕｌａｔｅｄ Ｍｏｖｉｎｇ−ｂｅｄ Ｓｙｓｔｅｍ；Ｏｒｇａｎｏ、Ｊａｐａｎ）装備を用いており、前記装備は、連続的に連結された６個のコラム（各コラムの高さは１．２ｍ、直径は４．３ｃｍ）、供給物（ｆｅｅｄ）ポンプ、再循環ポンプ、溶離液ポンプ、熱交換器、流量制御のためのバルブを含む。ＳＭＢクロマトグラフィーの運転条件は、下記表１の通りである。

さらに、２価陽イオンであるカルシウムイオンの代りに、バリウムイオン（Ｂａ^２＋）、ストロンチウムイオン（Ｓｒ^２＋）を充填して用い、対照群として、１価陽イオンであるナトリウムイオン（Ｎａ^＋）に対する実験をさらに実施した。その結果、カルシウムイオン、ストロンチウムイオン、バリウムイオンを用いたプシコース分画物内のボレートの残留量はそれぞれ０．２ｐｐｍ、０．３ｐｐｍ、０．４ｐｐｍで、ＷＨＯで推奨する飲用水内のホウ素含量の基準である０．５ｐｐｍより低く、除去率は９９．９９９％（ＤＳ％、ｗ／ｗ）であることを確認した。一方、ナトリウムイオンを用いたプシコース分画物は６２１００ｐｐｍで、０．５ｐｐｍより非常に高い数値であることを確認した。また、プシコース分画物内のプシコースの純度は、それぞれ９９．３５０％（ＤＳ％、ｗ／ｗ）（図３）、９９．１５０％（ＤＳ％、ｗ／ｗ）、９０．８５０％（ＤＳ％、ｗ／ｗ）であった。さらに、カルシウムイオン及びストロンチウムイオンを用いたボレート分画物は、供給物に対するボレートの回収率が約１００％であり、果糖は９９．２６４％で高い回収率（ボレート分画物内のボレートの含量／（プシコース分画物＋ボレート分画物）＊１００）を見せた。したがって、ＳＭＢクロマトグラフィーを利用して高純度プシコースを獲得しながらも、プシコースの製造に用いられる原料である果糖及びボレートを分離することができるので（表２及び図３）、プシコース製造後の残余果糖及びボレートのリサイクルが可能であることを確認することができた（図４）。

２−２．ＳＭＢクロマトグラフィーによって分離が可能なボレート含量の確認
プシコース分画物内プシコースの純度が９９％（ＤＳ％、ｗ／ｗ）以上でありながらも、ボレートの含量がＷＨＯで推奨する飲用水内ホウ素の濃度である０．５ｐｐｍ以下の条件を満たし、ＳＭＢクロマトグラフィーの適用が可能な供給物内ボレートの含量を確認した。供給物内のボレート、プシコース及びＤ−果糖の含量は、下記表３の通りである。
その結果、ボレートの添加量が２１．０５％（ＤＳ％、ｗ／ｗ）以下の場合、ボレートの除去率がいずれも９９．９９９％で、プシコース分画物内のボレートの残余量が０．５ｐｐｍ（ｗ／ｗ）以下であり、プシコースの純度が９９％（ＤＳ％、ｗ／ｗ）以上である
ことを確認することができた（表３）。

以上、本出願の特定の部分を詳しく記述したが、当業界で通常の知識を有する者において、このような具体的な記述はただ好ましい実施例に過ぎず、これによって本出願の範囲が制限されるものではないことは明らかなはずである。よって、本出願の実質的な範囲は、特許請求の範囲とそれらの等価物によって定義されるといえるはずである。

Claims (16)

1. Ｄ−プシコースボレート錯体（ｃｏｍｐｌｅｘ）を含む組成物を、２価陽イオンが含まれているクロマトグラフィーに投入するステップと、
   前記Ｄ−プシコースボレート錯体を含む組成物を、Ｄ−プシコースを含む分画物（ｉ）とボレートを含む分画物（ｉｉ）とに分離するステップと
   を含むＤ−プシコースの生産方法。
2. 前記投入するステップ以前に、Ｄ−プシコース３−エピマー化酵素、前記酵素を発現する菌株または前記菌株の培養物にＤ−果糖及びボレート（ｂｏｒａｔｅ）を接触させて前記Ｄ−プシコースボレート錯体を含む組成物を得るステップをさらに含む、請求項１に記載のＤ−プシコースの生産方法。
3. 前記Ｄ−プシコース３−エピマー化酵素は、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）またはカイスティア・グラヌリ（Ｋａｉｓｔｉａ ｇｒａｎｕｌｉ）由来の野生型プシコースエピマー化酵素またはその変異体である、請求項２に記載のＤ−プシコースの生産方法。
4. 前記Ｄ−プシコースボレート錯体を含む組成物は、乾燥固形分基準のボレートの含量が２５％（ｗ／ｗ）未満である、請求項１に記載のＤ−プシコースの生産方法。
5. 前記Ｄ−プシコースを含む分画物（ｉ）は、乾燥固形分基準のボレートの含量が０．５ｐｐｍ（ｗ／ｗ）未満である、請求項１に記載のＤ−プシコースの生産方法。
6. 前記Ｄ−プシコースを含む分画物（ｉ）は、乾燥固形分基準のＤ−プシコースの含量が８５％（ｗ／ｗ）以上である、請求項１に記載のＤ−プシコースの生産方法。
7. 前記クロマトグラフィーは擬似移動床（Ｓｉｍｕｌａｔｅｄ Ｍｏｖｉｎｇ Ｂｅｄ）クロマトグラフィーであり、前記２価陽イオンは、陽イオン交換樹脂が充填されたコラム状で含む、請求項１に記載のＤ−プシコースの生産方法。
8. 前記２価陽イオンは、カルシウムイオン、バリウムイオン、ストロンチウムイオン中いずれか一つ以上である、請求項１に記載のＤ−プシコースの生産方法。
9. 前記擬似移動床クロマトグラフィーは、４個以上のコラムを含む、請求項７に記載のＤ−プシコースの生産方法。
10. 前記擬似移動床クロマトグラフィーは、５０℃から７０℃の水で溶離を実施する、請求項７に記載のＤ−プシコースの生産方法。
11. 前記ボレートを含む分画物（ｉｉ）は、前記Ｄ−プシコースボレート錯体を含む組成物内のボレートの含量１００重量部に対して９５重量部以上である、請求項１に記載のＤ−プシコースの生産方法。
12. 前記Ｄ−プシコースボレート錯体を含む組成物は、果糖をさらに含むものである、請求項１に記載のＤ−プシコースの生産方法。
13. 前記ボレートを含む分画物（ｉｉ）内のボレートは、前記Ｄ−プシコースボレート錯体を含む組成物内のボレートの含量１００重量部に対して９５重量部以上であり、果糖は、前記Ｄ−プシコースボレート錯体を含む組成物内の果糖の含量１００重量部に対して９５重量部以上である、請求項１２に記載のＤ−プシコースの生産方法。
14. Ｄ−プシコースの含量が乾燥固形分を基準に９９％（ｗ／ｗ）以上１００％（ｗ／ｗ）未満であり、ボレートの含量が０超過０．５ｐｐｍ（ｗ／ｗ）未満である、Ｄ−プシコースを含む組成物。
15. 前記Ｄ−プシコースを含む組成物は、Ｄ−果糖を乾燥固形分基準に２％（ｗ／ｗ）以下で含むものである、請求項１４に記載のＤ−プシコースを含む組成物。
16. 前記Ｄ−プシコースを含む組成物は、クロマトグラフィーで分離されたＤ−プシコースを含む分画物であるものである、請求項１４に記載のＤ−プシコースを含む組成物。