KR101981430B1 - D-사이코스 붕산염 착물로부터 크로마토그래피를 이용한 d-사이코스의 생산 방법 및 d-사이코스를 포함하는 조성물 - Google Patents

D-사이코스 붕산염 착물로부터 크로마토그래피를 이용한 d-사이코스의 생산 방법 및 d-사이코스를 포함하는 조성물 Download PDF

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Abstract

본 출원은 D-사이코스 붕산염 착물(complex)을 포함하는 조성물을 2가 양이온이 포함된 크로마토그래피에 투입하는 단계; 및 상기 D-사이코스 붕산염 착물을 포함하는 조성물을 D-사이코스를 포함하는 분획물(i)과 붕산염을 포함하는 분획물(ii)로 분리하는 단계를 포함하는 D-사이코스 생산방법에 관한 것이다.

Description

D-사이코스 붕산염 착물로부터 크로마토그래피를 이용한 D-사이코스의 생산 방법 및 D-사이코스를 포함하는 조성물{Method for producing D-psicose from D-psicose borate complex by utilizing chromatography and Composition comprising D-psicose}
본 출원은 D-사이코스 붕산염 착물(complex)로부터 크로마토그래피를 이용한 D-사이코스의 생산 방법, 및 D-사이코스를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
D-사이코스는 무화과 및 건포도 등에 극소량 존재하는 천연당으로 설탕 대비 70%의 감미도를 가진 단당류다. D-사이코스는 과당이나 설탕과는 달리 인체 내에서 대사되지 않아 칼로리가 거의 없고, 혈당상승에 영향이 없으며, 비우식 및 항우식 기능으로 치아건강에 도움을 준다는 사실이 공지되어 있다.
이에, D-사이코스는 감미료로서의 관심이 높아지고 있으나 자연계에 극히 드물게 존재하기 때문에, 식품 산업에 적용하기 위해서는 이를 효율적으로 생산하는 기술의 개발이 필요하다.
이에, 본 발명자들은 D-사이코스 생산 방법으로 포도당을 과당으로 이성화한 후, 이를 D-사이코스 에피머화 효소를 생산하는 고정화 균체와 반응시켜 D-사이코스를 경제적으로 생산하는 방법을 보고(대한민국 공개특허 제 10-2011-0035805호, 이하, '효소 전환방법'으로 기재)한 바 있으며, 이러한 효소 전환방법에 붕산염(Borate)을 이용하는 경우 D-사이코스 전환율을 현저하게 상승시킬 수 있음이 공지된 바 있다(Process Biochemistry 44 (2009) 822-828, APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, May 2008, p. 3008-3013).
다만, 상기 붕산염을 이용한 효소 전환방법을 산업적 생산에 적용하기 위해서는 효소 전환방법에 사용한 붕산염(Borate)의 분리하고, 회수하여 재활용을 가능하게 할 수 있는 경제성을 고려한 공정개발이 요구된다. 또한, WHO(World Health Organization)는 음용수 내 포함되는 붕소 함량을 0.5 ppm 이하로 권장하고 있어 붕소 제거의 필요성이 존재한다.
효소 전환방법에 사용된 붕산염은 효소 전환방법에 의한 생성된 당(糖)액에서 붕산(H3BO3)의 형태로 존재하며, pKa의 값이 약 9로 효소 전환반응액(pH 5 내지 7)에서 거의 비해리(非解離) 상태로 존재하기 때문에 이온상태로는 거의 존재하지 않는다.
붕산염을 제거하기 위한 종래기술로는 알칼리제를 공급하여 pH를 9 내지 11로 조정하여 붕산을 폴리 붕산으로 전환한 다음, 저압 역삼투 여과를 하여 제거하는 방법(대한민국 등록특허 제10-1384992호) 및 pH를 9.0 내지 10.5 영역으로 조절하여 붕산 제거 효율을 낮추는 스케일(Scale)을 제거한 후 역삼투 공정을 수행하여 붕산염을 제거하는 방법이 보고된 바 있다(대한민국 등록특허 제10-1030192호). 그러나 효소 전환방법에 의하여 생성된 액상 사이코스의 경우 pH가 알칼리영역으로 전환될 경우 급격한 색가 하락으로 인하여 탈색비용이 상승하고, 알칼리 중합반응으로 인하여 사이코스 함량이 변화하며, 투입된 알칼리제 제거를 위한 공정이 추가로 필요하므로 산업화를 위한 경제성이 떨어지는 문제점이 있다.
이러한 배경 하에, 본 발명자들은 붕산염을 이용한 효소 전환방법으로 제조한 사이코스에 남아있는 붕산염을 효율적으로 분리 및 제거하기 위하여 예의 연구 노력한 결과, 모사이동층 크로마토그래피를 이용하는 경우 사이코스를 포함하는 분획물과 과당 및 붕산염을 포함하는 분획물을 효과적으로 분리할 수 있음을 확인함으로써 본 출원을 완성하였다.
본 출원의 목적은 D-사이코스 붕산염 착물(complex)을 포함하는 조성물을 2가 양이온이 포함된 크로마토그래피에 투입하는 단계; 및 상기 D-사이코스 붕산염 착물을 포함하는 조성물을 D-사이코스를 포함하는 분획물(i)과 붕산염을 포함하는 분획물(ii)로 분리하는 단계를 포함하는 D-사이코스 생산방법을 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 목적은 D-사이코스 함량이 건조 고형분 기준 99%(w/w)이상 100%(w/w)미만이고, 붕산염 함량이 0 초과 0.5 ppm(w/w) 미만인, D-사이코스를 포함하는 조성물을 제공하는 것이다.
이하에서는, 본 출원을 더욱 상세히 설명한다.
본 출원에서 개시되는 각각의 설명 및 실시 양태는 다른 설명 및 실시 양태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술되는 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 할 수 없다.
본 출원의 목적을 달성하기 위한 일 양태로서, 본 출원은 D-사이코스 붕산염 착물(complex)을 포함하는 조성물을 2가 양이온이 포함된 크로마토그래피에 투입하는 단계; 및 상기 D-사이코스 붕산염 착물을 포함하는 조성물을 D-사이코스를 포함하는 분획물(i)과 붕산염을 포함하는 분획물(ii)로 분리하는 단계를 포함하는 D-사이코스의 생산방법을 제공한다.
또한, 본 출원의 D-사이코스 생산방법은 상기 투입하는 단계 이전에 D-사이코스 3-에피머화 효소, 상기 효소를 발현하는 균주 또는 상기 균주의 배양물에 D-과당 및 붕산염(borate)을 접촉시켜 상기 D-사이코스 붕산염 착물을 포함하는 조성물을 얻는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 출원에서 사용된 용어인 "분획"은 일반적으로, 크로마토그래피법 등에 의하여 각종 구성성분 또는 혼합물이나 조성물로부터 각각의 성분 또는 특정의 그룹으로 분리하는 조작을 의미한다. 이에 따라, 이러한 조작에 의하여 얻어진 특정 성분을 분리하여 낸 물질을, 본 출원에서는 "분획물"로 표현하여, 분획과 구분하여 사용되었다.
따라서, D-사이코스를 포함하는 분획물은 D-사이코스 붕산염 착물을 포함하는 조성물 중에서, 크로마토그래피 분리 조작을 통하여 얻어진 물질을 의미한다. 또한, 붕산염을 포함하는 분획물은 D-사이코스 붕산염 착물을 포함하는 조성물 중에서, D-사이코스를 포함하는 분획물을 제외한 분획물을 의미한다. 구체적으로 본 출원에서 사이코스 분획물과 붕산염 분획물의 구분은 붕산염 및/또는 과당의 분획물 고형분 내 붕산염 및/또는 과당의 함량이 최고가 되는 분획물 이후, 분획물 내 사이코스의 분획물 고형분 내 사이코스 함량이 최고가 되는 분획물 이전을 중심으로 구분할 수 있다. 추가로 붕산염 및/또는 과당의 함량이 최고가 되는 분획물 이후 붕산염 및/또는 과당의 순도가 과당의 함량이 최고가 되는 분획물 대비 80%(w/w) 이하, 15%(w/w) 이하, 또는 1%(w/w) 이하가 되는 지점 이후, 사이코스의 함량이 최고가 되는 분획물 이전 사이코스의 순도가 사이코스의 함량이 최고가 되는 분획물 대비 70%(w/w) 이하, 10%(w/w) 이하, 1%(w/w) 이하 또는 0.4%(w/w) 이하가 되는 지점 이전으로 구분할 수 있다.
본 출원의 D-사이코스 3-에피머화 효소(이하, '사이코스 에피머화 효소'로 기재)는 D-과당을 D-사이코스로 에피머화시키는 활성을 가지는 단백질이라면 제한 없이 포함할 수 있으며, 상기 단백질을 내재적으로 발현하는 균주, 상기 단백질을 발현하도록 형질 전환된 균주, 상기 균주의 배양물, 또는 상기 배양물로부터 분리된 단백질을 사이코스 에피머화 효소로 사용할 수 있다.
본 출원의 D-사이코스 3-에피머화 효소는 아그로박테리움 투메파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens) 또는 카이스티아 그래뉼리(Kaistia granuli) 유래의 야생형 사이코스 에피머화 효소 또는 이의 변이체일 수 있고, 구체적으로 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3 또는 서열번호 4의 아미노산 서열과 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 99% 이상 또는 100%의 유전적 상동성을 갖는 사이코스 에피머화 효소일 수 있다. 또한, 이러한 상동성을 가지는 아미노산 서열로서, 사이코스 에피머화 효소 활성을 가지는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환, 또는 부가된 아미노산 서열도 본 출원의 아미노산 서열 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다. 더욱 구체적으로 서열번호 1 또는 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 사이코스 에피머화 효소일 수 있다.
본 출원의 균주는 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11403P (대한민국 등록특허 제10-1455759호)일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
본 출원의 D-과당은 설탕의 가수분해에 의해 제조되거나, 포도당을 이성질화하여 제조된 것일 수 있다. 이를 통해, 프럭토스, 설탕 및 포도당과 같이 보편화되고 저렴한 원료를 사용하여 높은 수율로 D-사이코스를 제조할 수 있어 사이코스의 대량 생산을 가능하게 할 수 있다. 또한, 붕산염은 붕산의 수소 원자가 금속 원소로 치환된 염류로서, 시판되는 것을 그대로 사용할 수 있다.
또한, 본 출원의 D-사이코스 생산방법은 약품재생형 이온교환장치(예를 들면 2상3탑식 이온교환장치 또는 2상2탑식 이온교환장치)를 가지는 설비에 당액(糖液)을 통액하여 금속이온을 제거하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 금속이온을 제거하는 단계는 상기 D-사이코스 붕산염 착물을 포함하는 조성물을 얻는 단계 이후 및/또는 상기 D-사이코스 붕산염 착물(complex)을 포함하는 조성물을 2가 양이온이 포함된 크로마토그래피에 투입하는 단계 이전에 추가로 포함될 수 있다.
본 출원에 따르면, 본 출원의 상기 D-사이코스 붕산염 착물을 포함하는 조성물은 건조 고형분 기준 붕산염 함량이 25 %(w/w) 미만일 수 있다. 구체적으로, 본 출원의 조성물물은 건조 고형분 기준 붕산염 함량이 6.25 %(w/w) 내지 25 %(w/w) 또는 6.25 %(w/w) 내지 21.05 %(w/w)일 수 있다.
본 출원에 따르면, 본 출원의 D-사이코스를 포함하는 분획물은 건조 고형분 기준 붕산염 함량이 0.5 ppm(w/w) 미만일 수 있다. 구체적으로, D-사이코스를 포함하는 분획물은 건조 고형분 기준 붕산염 함량은 0.1 ppm(w/w) 내지 0.45 ppm(w/w), 0.05 ppm(w/w) 내지 0.45 ppm(w/w), 0.1 ppm(w/w) 내지 0.4 ppm(w/w), 0.05 ppm(w/w) 내지 0.39 ppm(w/w), 0.1 ppm(w/w) 내지 0.39 ppm(w/w), 또는 0.05 ppm(w/w) 내지 0.35 ppm(w/w)일 수 있다.
본 출원에 따르면, 본 출원의 D-사이코스를 포함하는 분획물은 건조 고형분 기준 D-사이코스 함량이 85%(w/w) 이상일 수 있다. 구체적으로, 본 출원의 D-사이코스를 포함하는 분획물은 건조 고형분 기준 D-사이코스 함량이 85%(w/w) 내지 99.9%(w/w), 90%(w/w) 내지 99.9%(w/w), 90%(w/w) 내지 99.5%(w/w), 91%(w/w) 내지 99.9%(w/w), 91%(w/w) 내지 99.5%(w/w), 98.0%(w/w) 내지 99.9 %(w/w), 98.0%(w/w) 내지 99.5 %(w/w), 99.0 %(w/w) 내지 99.9 %(w/w) 또는 99.0 %(w/w) 내지 99.5 %(w/w) 일 수 있다.
또한 본 출원에 따르면, 본 출원의 D-사이코스를 포함하는 분획물은 D-과당을 포함할 수 있으며, 구체적으로 건조 고형분 기준 D-과당 함량이 10%(w/w)이하, 더욱 구체적으로 0.1%(w/w) 내지 9.9%(w/w), 0.1%(w/w) 내지 9.5%(w/w), 0.2%(w/w) 내지 9.5%(w/w), 0.1%(w/w) 내지 9%(w/w), 0.1%(w/w) 내지 5%(w/w), 0.1%(w/w) 내지 2%(w/w), 또는 0.1%(w/w) 내지 1%(w/w)일 수 있다.
본 출원에 따르면, 상기 크로마토그래피는 모사이동층 (SMB; Simulated Moving Bed) 크로마토그래피이면서, 양이온 교환수지가 충전된 컬럼 형태로 포함할 수 있다. 이러한 2가 양이온은 칼슘 이온(Ca2+), 바륨이온(Ba2+), 스트론튬 이온(Sr2+) 등일 수 있고, 구체적으로 칼슘 이온일 수 있다.
또한, 본 출원에 따르면, 본 출원의 모사이동층 크로마토그래피는 4개 이상의 컬럼을 포함할 수 있다. 또한, 본 출원의 모사이동층 크로마토그래피는 50 내지 70℃의 물로 용리를 실시할 수 있다. 구체적으로, 상기 용리는 55 내지 65℃ 또는 58 내지 62℃의 물로 실시할 수 있다.
한편, 본 출원에 따르면, 상기 D-사이코스 붕산염 착물을 포함하는 조성물은 pH가 5 내지 7일 수 있으며, 상기 D-사이코스 붕산염 착물을 포함하는 조성물을 2가 양이온이 포함된 크로마토그래피에 투입하는 단계 전 pH를 5 내지 7로 조정하거나 유지시킬 수 있다. 상기 D-사이코스 붕산염 착물을 포함하는 조성물을 pH 5 내지 7로 하여, D-사이코스 분해에 의한 착색 등의 현상이 방지될 수 있다.
추가로, 본 출원에 따르면, 상기 D-사이코스를 포함하는 분획물(i)을 붕소선택성 이온교환수지를 충진한 이온교환탑에 통액시켜 미량의 잔류 붕산염을 제거 할 수 있는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 출원의 컬럼에 충전되는 양이온 교환수지(흡착제)는 붕소를 선택적으로 흡착할 수 있는 것이면 한정받지 않고 이용할 수 있고 구체적으로 관능기로서 다가 알콜기를 도입한 예를 들면 Amberlite IRA743, Purolite S108 등을 들 수 있다.
또한, 본 출원에 따르면, 붕산염을 포함하는 분획물(ii)은 상기 D-사이코스 붕산염 착물을 포함하는 조성물 내 붕산염 함량 100 중량부 대비 95 중량부 이상일 수 있다.
또한, 본 출원에 따르면, D-사이코스 붕산염 착물을 포함하는 조성물은 과당을 추가적으로 포함할 수 있다. 이 경우, 상기 붕산염을 포함하는 분획물(ii) 내 붕산염은 상기 D-사이코스 붕산염 착물을 포함하는 조성물 내 붕산염 함량 100중량부 대비 95 중량부 이상이고, 과당은 상기 D-사이코스 붕산염 착물을 포함하는 조성물 내 과당 함량 100중량부 대비 95 중량부 이상일 수 있다.
상기 붕산염을 포함하는 분획물(ii) 내 붕산염 함량 및 과당의 함량은 D-사이코스 붕산염 착물을 포함하는 조성물 내 중량부 대신 D-사이코스를 포함하는 분획물(i)과 붕산염을 포함하는 분획물(ii)의 합계일 수 있으며, 구체적으로 해당 함량은 95 중량부 이상, 96 중량부 이상, 97 중량부 이상, 98 중량부 이상, 99 중량부 이상, 99.1 중량부 이상, 또는 99.5 중량부 이상일 수 있으며, 100중량부를 초과하지 않을 수 있다.
붕산염을 포함하는 분획물(ii) 내 붕산염 및 과당을 상기 범위로 포함하여 붕산염을 포함하는 분획물(ii)을 재사용할 수 있다.
본 출원의 다른 양태로서, 본 출원은 D-사이코스 함량이 건조 고형분 기준 85%(w/w)내지 99.9%(w/w) 이고, 붕산염 함량이 0 초과 0.5 ppm(w/w) 미만인 D-사이코스를 포함하는 조성물을 제공한다.
상기 D-사이코스를 포함하는 조성물은 D-과당을 건조 고형분 기준 10%(w/w) 이하로 포함한다. 또한, 상기 D-사이코스를 포함하는 조성물은 크로마토그래피로 분리된 D-사이코스를 포함하는 분획물이다.
이러한 양태와 관련된 구체적인 내용은 상술한 D-사이코스 생산방법과 관련하여 기재된 것을 그대로 적용할 수 있으므로, 생략한다.
이후에는, 도 4인 본 출원의 D-사이코스 생산 공정도를 참조하여 본 발명을 간단하게 설명한다. 우선, 단계(1)로서, 과당과 붕산염을 혼합한 후, 단계(2)로서, 단계(1)에서 얻어진 혼합물에 D-사이코스 3-에피머화 효소를 접촉시켜 효소반응 공정을 행한다. 이어서, 단계(3)으로서, D-사이코스, 잔여 과당 및 붕산염인 D-사이코스 붕산염 착물을 얻은 다음, 단계(4)로서, SMB 크로마토그래피를 이용하여 D-사이코스 분획물(i)과 붕산염 분획물(ii)을 분리하게 된다. 여기서 단계(4)에서 얻어진 붕산염 분획물(ii)은 잔여 과당과 붕산염을 포함하는 것이므로, 단계(1)로 순환하여 재사용할 수 있다. 한편, 단계(4)에서 얻어진 D-사이코스 분획물(i)은 상기한 바와 같이, 필요에 따라, 붕소선택성 이온교환수지를 충진한 이온교환탑에 통액시켜 미량의 잔류 붕산염을 추가로 제거할 수 있다.
본 출원의 사이코스 생산방법 붕산염의 분리방법은 붕산염을 이용한 효소 전환방법으로 제조한 사이코스에 남아있는 붕산염을 효율적으로 분리 및 제거할 수 있는 효과가 있다.
또한, 본 출원의 방법을 사이코스 생산에 이용하는 경우 원료인 과당과 붕산염을 사이코스로부터 효과적으로 분리할 수 있어 원료의 재활용이 가능한 이점이 있다.
도 1은 본 출원의 실시예 1의 D-사이코스 에피머화 효소 반응에 붕산염을 첨가한 경우(실험예 1)와 첨가하지 않은 경우(비교예 1)의 D-과당에서 D-사이코스로의 전환 결과에 대한 HPLC 크로마토그램이다.
도 2는 본 출원의 모사 이동층(SMB) 크로마토그래피에 의하여 분획된 D-사이코스 분획물의 HPLC 크로마토그램이다.
도 3은 본 출원의 모사 이동층(SMB) 크로마토그래피에 의하여 분획된 붕산염 분획물의 HPLC 크로마토그램이다.
도 4는 본 출원의 D-사이코스 생산 공정도이다.
이하, 본 출원을 실시예에 의하여 보다 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 출원을 예시적으로 설명하기 위한 것으로, 본 출원의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다. 본 명세서에 기재되지 않은 내용은 본 출원의 기술 분야 또는 유사 분야에서 숙련된 자이면 충분히 인식하고 유추할 수 있는 것이므로 그 설명을 생략한다.
실시예 1: 붕산염 및 효소 전환방법을 이용한 D-사이코스 생산
아그로박테리움 투메파시엔스 유래 사이코스 에피머화 효소의 변이체를 발현하는 재조합 균주로 공지(대한민국 등록특허 제10-1455759호)되어 있는 코리네박테리움 글루타미쿰(KCCM11403P)을 이용하여 효소 전환반응을 진행하였다. 0.1 M 과당을 물에 용해시킨 후 0.05 M 붕산염 및 10 mM MnCl2를 첨가(실험예 1) 또는 10 mM MnCl2만을 첨가(비교예 1)하여 효소 전환반응을 위한 원료를 제조하고, 이에 상기 균주[20 %(w/w)]를 첨가하여 pH 8.0, 55℃ 조건 하에 3시간 동안 반응을 진행하였다.
이후, HPLC 분석을 통해 상기 사이코스 에피머화 효소의 기질(D-과당)과 생성물(사이코스)의 피크 면적(area)값을 비교하여 전환율을 계산하였으며, 상기 HPLC 분석은 80℃로 설정된 컬럼(BP-100 Ca2+ carbohydrate column)에 시료를 주입한 후, 이동상 용매로 증류수를 0.6 ml/min 속도로 통과시키는 조건에서 수행하였다.
그 결과, D-사이코스로의 전환율은 비교예 1이 25%인 반면 실험예 1은 56%로 비교예 1 대비 224%가 상승함을 확인할 수 있었다(도 1).
실시예 2: 붕산염 분리
2-1. SMB 크로마토그래피를 이용한 붕산염 분리 확인
D-사이코스 붕산염 착물이 포함된 조성물(붕산염, D-과당 및 D-사이코스, 이하 공급물)로부터 붕산염이 제거된 D-사이코스를 분리하기 위하여 모사이동층(SMB: Simulated Moving Bed) 크로마토그래피를 이용하였다. 상기 SMB 크로마토그래피는 개선된 시뮬레이티드 무빙-베드 시스템(Advanced Simulated Moving-bed System; Organo, Japan) 장비를 사용하였으며, 상기 장비는 연속적으로 연결된 6개의 컬럼(각 컬럼의 높이는 1.2 m, 직경은 4.3 cm), 공급물(feed) 펌프, 재순환 펌프, 용리액 펌프, 열교환기, 유량 제어를 위한 밸브를 포함한다. SMB 크로마토그래피 운전 조건은 하기 표 1과 같다.
공급물 과당, 사이코스 및 붕산염의 혼합물
공급물의 농도 60 %(w/w)
컬럼에 충전되는 양이온 교환수지(흡착제) 앰버라이트 (Amberlite CR-1310; Ca-type)
컬럼 크기 및 개수 43 mm x 1200 mm * 6 컬럼
탈착제(용리액) H2O
유속 2.49 m/H
용리액 온도 60 ℃
추가로 2가 양이온인 칼슘 이온 대신에, 바륨 이온(Ba2+), 스트론튬 이온(Sr2+)을 충전하여 사용하고, 대조군으로 1가 양이온인 나트륨 이온(Na+)에 대한 실험을 추가로 실시하였다.
그 결과, 칼슘 이온, 스트론튬 이온, 바륨 이온을 사용한 사이코스 분획물 내의 붕산염 잔류량은 각각 0.2 ppm, 0.3 ppm, 0.4 ppm으로 WHO에서 권장하는 음용수 내 붕소 함량 기준인 0.5 ppm보다 낮고, 제거율은 99.999 %(DS %, w/w)인 것을 확인하였다. 반면 나트륨 이온을 사용한 사이코스 분획물은 62100 ppm으로 0.5 ppm보다 매우 높은 수치임을 확인하였다. 또한, 사이코스 분획물 내의 사이코스의 순도는 각각 99.350 %(DS %, w/w)(도 3), 99.150 %(DS %, w/w), 90.850 %(DS %, w/w)였다. 또한 칼슘 이온 및 스트론튬 이온을 사용한 붕산염 분획물은 공급물 대비 붕산염 회수율이 약 100%이며, 과당은 99.264%로 높은 회수율(붕산염 분획물 내 붕산염 함량/(사이코스 분획물+붕산염 분획물)*100)을 보였다. 따라서 SMB 크로마토그래피를 이용하여 고순도 사이코스를 획득하면서도, 사이코스 제조에 사용되는 원료인 과당 및 붕산염을 분리할 수 있어(표 2 및 도 3) 사이코스 제조 후의 잔여 과당 및 붕산염의 재활용이 가능함을 확인할 수 있었다(도 4).
앰버라이트 (Amberlite CR-1310; Ca-type) 공급물 사이코스 분획물 붕산염 분획물
붕산염(DS %, w/w) 12.050 0.00002 12.050
D-사이코스(DS %, w/w) 49.255 99.350 0.280
D-과당(DS %, w/w) 38.695 0.650 87.670
앰버라이트 (Amberlite CR-1310; Sr-type) 공급물 사이코스 분획물 붕산염 분획물
붕산염(DS %, w/w) 12.050 0.00003 12.050
D-사이코스(DS %, w/w) 49.255 99.150 0.350
D-과당(DS %, w/w) 38.695 0.850 87.600
앰버라이트 (Amberlite CR-1310; Ba-type) 공급물 사이코스 분획물 붕산염 분획물
붕산염(DS %, w/w) 12.050 0.00004 12.050
D-사이코스(DS %, w/w) 49.255 90.850 8.750
D-과당(DS %, w/w) 38.695 9.150 79.200
앰버라이트 (Amberlite CR-1310; Na-type) 공급물 사이코스 분획물 붕산염 분획물
붕산염(DS %, w/w) 12.050 6.210 8.870
D-사이코스(DS %, w/w) 49.255 55.850 37.280
D-과당(DS %, w/w) 38.695 37.940 53.850
* DS(Dry Solid): 건조 고형분
2-2. SMB 크로마토그래피에 의하여 분리가 가능한 붕산염 함량 확인
사이코스 분획물 내 사이코스의 순도가 99%(DS %, w/w) 이상이 되면서도 붕산염 함량이 WHO에서 권장하는 음용수 내 붕소 농도인 0.5 ppm 이하 조건을 만족하여 SMB 크로마토그래피 적용이 가능한 공급물 내 붕산염 함량을 확인하였다. 공급물 내 붕산염, 사이코스 및 D-과당의 함량은 하기 표 3과 같다.
그 결과, 붕산염의 첨가량이 21.05 %(DS %, w/w) 이하인 경우 붕산염 제거율이 모두 99.999 %이고, 사이코스 분획물 내 붕산염 잔여량이 0.5 ppm(w/w) 이하이며, 사이코스의 순도가 99 %(DS %, w/w) 이상임을 확인할 수 있었다(표 3).
실험예 2 실험예 3 실험예 4 실험예 5 실험예 6 실험예 7
공급물 내 붕산염 함량(DS %, w/w) 0.00 6.25 11.76 16.67 21.05 25.00
사이코스 분획물 함량
(DS %, w/w)		 붕산염 0 0.000015 0.000021 0.000032 0.000044 0.000137
D-과당 0.78 0.75 0.68 0.56 0.54 1.23
사이코스 99.22 99.25 99.32 99.44 99.46 98.77
* DS(Dry solid): 건조 고형분
이상으로 본 출원의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시예일뿐이며, 이에 의해 본 출원의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 출원의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
기탁기관명 : 한국미생물보존센터(국외)
수탁번호 : KCCM11403P
수탁일자 : 20130328
<110> CJ CHEILJEDANG CORPORATION <120> Method for producing D-psicose from D-psicose borate complex by utilizing chromatography and Composition comprising D-psicose <130> P18-0209 <160> 4 <170> KopatentIn 3.0 <210> 1 <211> 289 <212> PRT <213> Amino acid sequences of the triple-mutant from D-psicose 3-epimerase <400> 1 Met Lys His Gly Ile Tyr Tyr Ser Tyr Trp Glu His Glu Trp Ser Ala 1 5 10 15 Lys Phe Gly Pro Tyr Ile Glu Lys Val Ala Lys Leu Gly Phe Asp Ile 20 25 30 Leu Glu Val Ala Ala His His Ile Asn Glu Tyr Ser Asp Ala Glu Leu 35 40 45 Ala Thr Ile Arg Lys Ser Ala Lys Asp Asn Gly Ile Ile Leu Thr Ala 50 55 60 Gly Ile Gly Pro Ser Lys Thr Lys Asn Leu Ser Ser Pro Asp Ala Ala 65 70 75 80 Val Arg Ala Ala Gly Lys Ala Phe Phe Glu Arg Thr Leu Ser Asn Val 85 90 95 Ala Lys Leu Asp Ile His Thr Ile Gly Gly Ala Leu His Ser Tyr Trp 100 105 110 Pro Ile Asp Tyr Ser Gln Pro Val Asp Lys Ala Gly Asp Tyr Ala Arg 115 120 125 Gly Val Glu Gly Ile Asn Gly Ile Ala Asp Phe Ala Asn Asp Leu Gly 130 135 140 Ile Asn Leu Cys Ile Glu Val Leu Asn Arg Phe Glu Asn His Val Leu 145 150 155 160 Asn Thr Ala Ala Glu Gly Val Ala Phe Val Lys Asp Val Gly Lys Asn 165 170 175 Asn Val Lys Val Met Leu Asp Thr Phe His Met Asn Ile Glu Glu Asp 180 185 190 Ser Phe Gly Asp Ala Ile Arg Thr Ala Gly Pro Leu Leu Gly His Phe 195 200 205 His Thr Gly Glu Cys Asn Arg Arg Val Pro Gly Lys Gly Arg Met Pro 210 215 220 Trp His Glu Ile Gly Leu Ala Leu Arg Asp Ile Asn Tyr Thr Gly Ala 225 230 235 240 Val Ile Met Glu Pro Phe Val Lys Thr Gly Gly Thr Ile Gly Ser Asp 245 250 255 Ile Lys Val Trp Arg Asp Leu Ser Gly Gly Ala Asp Ile Ala Lys Met 260 265 270 Asp Glu Asp Ala Arg Asn Ala Leu Ala Phe Ser Arg Phe Val Leu Gly 275 280 285 Gly <210> 2 <211> 289 <212> PRT <213> Amino acid sequences of the double-mutant from D-psicose 3-epimerase <400> 2 Met Lys His Gly Ile Tyr Tyr Ser Tyr Trp Glu His Glu Trp Ser Ala 1 5 10 15 Lys Phe Gly Pro Tyr Ile Glu Lys Val Ala Lys Leu Gly Phe Asp Ile 20 25 30 Leu Glu Val Ala Ala His His Ile Asn Glu Tyr Ser Asp Ala Glu Leu 35 40 45 Ala Thr Ile Arg Lys Ser Ala Lys Asp Asn Gly Ile Ile Leu Thr Ala 50 55 60 Gly Ile Gly Pro Ser Lys Thr Lys Asn Leu Ser Ser Glu Asp Ala Ala 65 70 75 80 Val Arg Ala Ala Gly Lys Ala Phe Phe Glu Arg Thr Leu Ser Asn Val 85 90 95 Ala Lys Leu Asp Ile His Thr Ile Gly Gly Ala Leu His Ser Tyr Trp 100 105 110 Pro Ile Asp Tyr Ser Gln Pro Val Asp Lys Ala Gly Asp Tyr Ala Arg 115 120 125 Gly Val Glu Gly Ile Asn Gly Ile Ala Asp Phe Ala Asn Asp Leu Gly 130 135 140 Ile Asn Leu Cys Ile Glu Val Leu Asn Arg Phe Glu Asn His Val Leu 145 150 155 160 Asn Thr Ala Ala Glu Gly Val Ala Phe Val Lys Asp Val Gly Lys Asn 165 170 175 Asn Val Lys Val Met Leu Asp Thr Phe His Met Asn Ile Glu Glu Asp 180 185 190 Ser Phe Gly Asp Ala Ile Arg Thr Ala Gly Pro Leu Leu Gly His Phe 195 200 205 His Thr Gly Glu Cys Asn Arg Arg Val Pro Gly Lys Gly Arg Met Pro 210 215 220 Trp His Glu Ile Gly Leu Ala Leu Arg Asp Ile Asn Tyr Thr Gly Ala 225 230 235 240 Val Ile Met Glu Pro Phe Val Lys Thr Gly Gly Thr Ile Gly Ser Asp 245 250 255 Ile Lys Val Trp Arg Asp Leu Ser Gly Gly Ala Asp Ile Ala Lys Met 260 265 270 Asp Glu Asp Ala Arg Asn Ala Leu Ala Phe Ser Arg Phe Val Leu Gly 275 280 285 Gly <210> 3 <211> 289 <212> PRT <213> Amino acid sequences of D-psicose 3-epimerase <400> 3 Met Lys His Gly Ile Tyr Tyr Ser Tyr Trp Glu His Glu Trp Ser Ala 1 5 10 15 Lys Phe Gly Pro Tyr Ile Glu Lys Val Ala Lys Leu Gly Phe Asp Ile 20 25 30 Ile Glu Val Ala Ala His His Ile Asn Glu Tyr Ser Asp Ala Glu Leu 35 40 45 Ala Thr Ile Arg Lys Ser Ala Lys Asp Asn Gly Ile Ile Leu Thr Ala 50 55 60 Gly Ile Gly Pro Ser Lys Thr Lys Asn Leu Ser Ser Glu Asp Ala Ala 65 70 75 80 Val Arg Ala Ala Gly Lys Ala Phe Phe Glu Arg Thr Leu Ser Asn Val 85 90 95 Ala Lys Leu Asp Ile His Thr Ile Gly Gly Ala Leu His Ser Tyr Trp 100 105 110 Pro Ile Asp Tyr Ser Gln Pro Val Asp Lys Ala Gly Asp Tyr Ala Arg 115 120 125 Gly Val Glu Gly Ile Asn Gly Ile Ala Asp Phe Ala Asn Asp Leu Gly 130 135 140 Ile Asn Leu Cys Ile Glu Val Leu Asn Arg Phe Glu Asn His Val Leu 145 150 155 160 Asn Thr Ala Ala Glu Gly Val Ala Phe Val Lys Asp Val Gly Lys Asn 165 170 175 Asn Val Lys Val Met Leu Asp Thr Phe His Met Asn Ile Glu Glu Asp 180 185 190 Ser Phe Gly Asp Ala Ile Arg Thr Ala Gly Pro Leu Leu Gly His Phe 195 200 205 His Thr Gly Glu Ser Asn Arg Arg Val Pro Gly Lys Gly Arg Met Pro 210 215 220 Trp His Glu Ile Gly Leu Ala Leu Arg Asp Ile Asn Tyr Thr Gly Ala 225 230 235 240 Val Ile Met Glu Pro Phe Val Lys Thr Gly Gly Thr Ile Gly Ser Asp 245 250 255 Ile Lys Val Trp Arg Asp Leu Ser Gly Gly Ala Asp Ile Ala Lys Met 260 265 270 Asp Glu Asp Ala Arg Asn Ala Leu Ala Phe Ser Arg Phe Val Leu Gly 275 280 285 Gly <210> 4 <211> 297 <212> PRT <213> Amino acid sequence of D-psicose 3-epimerase from Kaistia granuli <400> 4 Met Lys Asn Lys Leu Gly Val His Ala Gln Val Trp Val Gly Gly Trp 1 5 10 15 Ser His Ala Glu Ala Glu Arg Ala Ile Ala Ser Thr Ala Ser Leu Gly 20 25 30 Tyr Asp Tyr Ile Glu Ala Pro Ala Leu Asp Pro Ser Leu Ile Asp Ile 35 40 45 Asp Phe Thr Arg Lys Ala Leu Glu Lys His Gly Leu Gly Ile Thr Thr 50 55 60 Ser Leu Gly Leu Asp Asp Ser Cys Asp Ile Ser Ser Gly Asp Pro Asp 65 70 75 80 Lys Lys Ala Arg Gly Gln Ala His Leu Met Lys Val Val Ser Thr Thr 85 90 95 Arg Asp Leu Gly Gly Thr His Ile Thr Gly Ile Leu Tyr Ser Gly Phe 100 105 110 Gln Lys Tyr Phe Thr Pro Ala Thr Pro Glu Gly Val Ala Gly Ala Val 115 120 125 Glu Val Leu His His Val Ala Glu Glu Ala Ala Lys Ser Asn Ile Thr 130 135 140 Leu Gly Leu Glu Val Val Asn Arg Tyr Glu Thr Asn Val Ile Asn Thr 145 150 155 160 Ala Ala Gln Gly Val Glu Leu Cys Lys Arg Val Gly Met Pro Asn Val 165 170 175 Lys Val His Leu Asp Cys Tyr His Met Asn Ile Glu Glu Ala Asp Ala 180 185 190 Glu Arg Ala Ile Ile Asp Thr Gly Asp Tyr Leu Gly Tyr Phe His Thr 195 200 205 Gly Glu Ser His Arg Gly Tyr Leu Gly Thr Gly Ser Ile Asp Phe Thr 210 215 220 Arg Ile Phe Arg Gly Leu Val Lys Ala Asn Tyr Gln Gly Pro Ile Cys 225 230 235 240 Phe Glu Ser Phe Ser Ser Ala Val Ala Gly Glu Pro Leu Ser Gly Ile 245 250 255 Leu Gly Ile Trp Arg Asn Leu Trp Thr Asp Ser Thr Asp Leu Cys Arg 260 265 270 His Ala Met Gln Phe Thr Gln Ala Gln Met Gln Ala Ala Glu Gln Ala 275 280 285 Gln Ser Ile Arg Thr Gly Ala Asp Trp 290 295

Claims (16)

  1. D-사이코스 붕산염 착물(complex)을 포함하는 조성물을 2가 양이온이 포함된 크로마토그래피에 투입하는 단계; 및
    상기 D-사이코스 붕산염 착물을 포함하는 조성물을 상기 크로마토그래피를 이용하여 D-사이코스를 포함하는 분획물(i)과 붕산염을 포함하는 분획물(ii)로 분리하는 단계를 포함하고,
    상기 2가 양이온은 칼슘 이온, 바륨 이온, 스트론튬 이온 중 어느 하나 이상이며,
    상기 크로마토그래피는 모사이동층(Simulated Moving Bed) 크로마토그래피인, D-사이코스 생산방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 투입하는 단계 이전에 D-사이코스 3-에피머화 효소, 상기 효소를 발현하는 균주 또는 상기 균주의 배양물에 D-과당 및 붕산염(borate)을 접촉시켜 상기 D-사이코스 붕산염 착물을 포함하는 조성물을 얻는 단계를 추가로 포함하는, D-사이코스 생산방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 D-사이코스 3-에피머화 효소는 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) 또는 카이스티아 그래뉼리(Kaistia granuli) 유래의 야생형 사이코스 에피머화 효소 또는 이의 변이체인, D-사이코스 생산방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 D-사이코스 붕산염 착물을 포함하는 조성물은 건조 고형분 기준 붕산염 함량이 25 %(w/w) 미만인, D-사이코스 생산방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 D-사이코스를 포함하는 분획물(i)은 건조 고형분 기준 붕산염 함량이 0.5 ppm(w/w) 미만인, D-사이코스 생산방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 D-사이코스를 포함하는 분획물(i)은 건조 고형분 기준 D-사이코스 함량이 85 %(w/w) 이상인, D-사이코스 생산방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 2가 양이온은 양이온 교환수지가 충전된 컬럼형태로 포함하는, D-사이코스 생산방법.
  8. 삭제
  9. 제1항에 있어서, 상기 모사이동층 크로마토그래피는 4개 이상의 컬럼을 포함하는, D-사이코스 생산방법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 모사이동층 크로마토그래피는 50℃ 내지 70℃의 물로 용리를 실시하는, D-사이코스 생산방법.
  11. 제1항에 있어서, 상기 붕산염을 포함하는 분획물(ii)은 상기 D-사이코스 붕산염 착물을 포함하는 조성물 내 붕산염 함량 100 중량부 대비 95 중량부 이상인, D-사이코스 생산방법
  12. 제1항에 있어서, 상기 D-사이코스 붕산염 착물을 포함하는 조성물은 과당을 추가적으로 포함하는 것인, D-사이코스 생산방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 붕산염을 포함하는 분획물(ii) 내 붕산염은 상기 D-사이코스 붕산염 착물을 포함하는 조성물 내 붕산염 함량 100중량부 대비 95 중량부 이상이고, 과당은 상기 D-사이코스 붕산염 착물을 포함하는 조성물 내 과당 함량 100중량부 대비 95 중량부 이상인, D-사이코스 생산방법.
  14. 제1항에 있어서, 상기 분리된 붕산염을 포함하는 분획물(ii)은 D-사이코스 3-에피머화 효소, 상기 효소를 발현하는 균주 또는 상기 균주의 배양물에 D-과당을 접촉시키는 효소반응 공정으로 순환하여 재사용하는 것인, D-사이코스 생산방법.
  15. 삭제
  16. 삭제
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