Opis patentowy opublikowano: 30.06.1978 96533 MKP A61k 17/04 Int. Cl.2 A61K 37/26 Twórca wynalazku Uprawniony z patentu: Eli Lilly and Co., Indianapolis (Stany Zjednoczone Ameryki) Sposób oczyszczania insuliny w postaci soli metalu alkalicznego lub soli amonowej Praedmiotem wynalazku jest Siposób oczyszcza¬ nia insuliny w positaci soli metalu alajkalicznego lub soli amonowej na drodze filtracji przez zel przy pH o wairtosci 7,5—9,5.Od czasu odikryoia insuliny w roku 1921 jako slkiadnifca trzustki, osiagnela ona ogromne zna¬ czenie na swiecie w leczeniu cukrzycy. Poniewaz w celu wyizolowania insuliny z tkanek trzustki stosuje sie metody ekstrakcyjne, równoczesnie z in¬ sulina usuwane sa znaczne ilosci protein, nie be¬ dacych insulina. Zostaly podjete znaczne wysilki w kierunku rozwiniecia metod oczyszczania insu¬ liny, tj. metod oddzielenia insuliny od protein, nie bedacych insulina. Liczne z tych metod uzyskaly wazne znaczenie handlowe. Jedna z tych waznych z handlowego punktu widzenia metod, wywodzila sie z ogólnego stwierdzenia, £e proteina posiada minimum rozTpuszczailnpsoi w puncie izoeiektrycz- nyrm, inne wisjpolozyinnilki pozostawaly bez zmian.Baniting i inni w opisie patentowym Sit. Zjedn.Amer. nr 1 46&994 podali sposób oczyszczania, po¬ legajacy na wytraceniu zawatntych w wodnym wy¬ ciagu z trzustki protein, nie bedacych insulina,, w ich punkcie izoeiektrycznym. Izoedektrryczne wy¬ tracanie insuliny przy pH 4—7 z wodnego eks¬ traktu trzustki zostalo opisane przez Waldena w opisie [patentowym St. Zjedn. Amer. nr 1520 673.W innej metodzie wczesniejszej wytracanie in¬ sulin bylo przeprowadzone przez dodanie od¬ powiedniej ilasci nieorganicznej soli. Muriin w opi¬ sie patentowym St. Zjedn. Amer. rur 1 547 515 opi¬ sal pierwszy proces wysalania insuliny z roz- pulszczalndka eksitrahujacegio za pomoca chlorku so¬ dowego. Inny proces wysalania zostal opiisany przez Lauitenschlagera i innych w opisie patentowym St.Zjedn. Aimer. rur 2 449 076, polegajacy na wysa- laniu insuliny z obojetnego ekstraktu przez doda¬ nie chlorku sodowego, przesaczeniu, ponownym rozpuszczeniu pozostalosci i ponownym wysoleniu io insuliny, lecz sola o nizszym stezeniu niz zasto¬ sowana w pierwszym etapie wysalania.Trzecia metoda handlowo wazna oczyszczania insuliny polega na wytracaniu lub krystaiMizacji insuliny z roztworu w positaci kompleksu z cyn- kLem. Na og6Lf cynk insuline wytraca sie z bu¬ forowanego wodnego roztworu, zawierajacego jo¬ ny cynku. Rózne bufory sa stosowane. Petersen nip. wig. opisu paitenitowiego St. Zjedn. Amer. nr 2 6126 228 stosuje kwas cytrynowy^cytrynian. Ni- niejszy przemyslowy sposób oczyszczania insuliny jest rozwinieciem wszystkich trzech powyzszych metod. Poniewaz cynk insulina jest najwaziniejsza handlowa postacia insuliny, ostatni etap *oczyszcza¬ nia insuliny jest zazwyczaj eta|pem krystalizacji cynku.Jednakze proteiny nieinsuMinowe, wsród których pmzewazaja proinsuiMina i proteiny piroinsulino-po- dobne, zostaly uznane w ostatnich latach jako sikladniiki niepozadane handlowej cynk insuliny.Jakkolwiek skladniki te na ogól stanowia mniej 9653396533 3 4 miz okolo 8% wagowych handlowej cynk insuliny, niektóre z nich zostaly uznane za antygeny lub czynniki immuinogeniczne. Patrz np. Ghance i inni Science 1611, 165 (1968); Steiner i inini, Diaibetes, 18, 725 (1068); Bromer, Bioscience, 20, 701 (1070); oraz Rubenstein i inni, Amn. Rer. Med. 22, 1, (197il).Tak wiec stalymi problemem jest usuwanie pro¬ tein niefinlsulinowych z insuliny na slkale przemy¬ slowa.Okreslenie „insulina", stosowane w opisie, doty¬ czy nie tylko insuliny jako takiej, aile rówmiez wszystkich proteiin insulino-ipodobinych, takich jak dezamidtoninsuliina. Poniewaz insuMina i proteiny iinsuliino-podobne posiadaja podobna aktywnosc hy- poglicemliczna, zazwyczaj nie ma potrzeby odidiziie- lania insuliny od wszystkich innych protein, za- wairtych w trzustce, tj. normalnie nie jest wyma¬ gana insulina homogeniczna.Techniki rozdzielania soubsltancji biologicznych na skale laboratoryjna, taMe jak elektroforeza i ohiro- matograifia jonitowa, sa znane w celu oddzielania skladników naeiinsuliriowych od insMLny bedacej skladnikiem preparatów handlowych insuliny (lub nawet surowej). Techniki te pozwalaja nawet roz¬ lozyc skladnik insuillLny na insuline jako taka i in¬ suline desamidowana. Jednakze takie procedury posiadaja wat(piMwa przydatnosc na duza slkale.Procesem bardziej nadajacym sie do zastosowa¬ nia na duza slkale jest chromatografia na zelu (synonimem jest gel exclusion ch i gel permeaition (^romatography). W metodach tych proteiny sa rozdzielane w kolumnie, wypel¬ nionej zelem, który jest siieci)owany w taki sposób,? ze pory sa wytwarzane dla kazdego zelu oddziel¬ nie. Pory te posiadaja okreslona, wymderzaiina ob¬ jetosc, która jest wprost proporcjonalna do stop¬ nia spedznienia zelu i odwrotnie proporcjonalna do stopnia uislieoiowanLa. Poniewaz mniejsze czas- teozki maja wiekszy dJostep do tych por niz wiek¬ sze czasteczki, pnzesiuwanie sie mniejszych czaste¬ czek przez kolumne jest hamowane w stosunku do wiekszych czasteczek, które maja tylko czesciowy Wulb nie maja wcale dostepu do por.Filtracja na zelu stosowana byla dawniej przy oczyszczaniu insuliny. Przy wysalamiu pojedymczej insuliny z trzustki kota, otrzymuje sie surowa in¬ suline na drodze ekstrakcji kwas/alkohol, Mora nastepnie traktuje sie alkaliami w celu usuniecia substancja nieaktywmych, nastepnie za&eza, poddaje izoelektryeznemu wytiracaniu i wreszcie wytraca¬ niu przez wysolende dhlorkiUern sodu. Surowa insu¬ line wprowadza sie do kolumny, wypelnionej sie- ciowanym zelem dekstranowym i eluuje 1,0 m kwasem octowym [Davoren, Biochim. Biophys.Acta, 63, 150 (1962)].Przy wyosobnianiu insuliny z ryb, gruczoly ho¬ mogenizuje sie w wodzie, a proteiny wyitrajca roz¬ tworem kwasu trójchloiiooctowego, ekstirahuje roz¬ tworem kwas/etanol, a ekstrakt traktuje chlorkiem metylenu w celu usuniecia lipidów. Pozostale ciala stale izoluje sie, przenosi do 5,0 m rOzftworu kiwasu octowego i przesacza przez kolumne, wypelniana sieciowianym zielem deksitranowym, nastepnie elu¬ uje 5,0 m kwasem octowym [Humbel, Biochem.Biophys. Res. Commun. 12, 3&* (1003)]. Podawano wydajnosc ojdolo 80%. Nalezy zauwazyc, ze Hum¬ bel stwierdzil, ze w celu dobrego oddzielenia in¬ suliny od ionych protein, warunki eluoji.powinny ulatwiac dysocjacje czajsteczek insuiliiny. Sugeruje on dalej, ze 1,0 m kiwas octowy nie jest od|powtied- niim rozpuszczalnikiem, poniewaz wedlug Yjphantis i Wangh [Biochiim. Biophys. Acta,- 26, 218 (1957)] inisuilina nie jest w tym przypadku calkowicie zdy- socjowana.Surowy ekstrakt trzuteki wolowej zostal przesa¬ czony przez sieciowany zel dekstranowy przez Epsteliina i innych, Biochemistry, 2, 461, (1968). Roz¬ puszczalnikiem eluiujajcym byl 0,2 m weglan amo¬ nu, rozpuslzcizalnifciem polecanym równiez przez iHuimlbela byl supra. Epsitein i inni podlawali wy¬ dajnosc okolo 60%.Insulina byla nawet izolowana z trzustki ludz¬ kiej. Gruczoly byly najpierw homogenizowane i ekstrahowane. PTrakcjonowanie siarczanem amo- mu usuwalo niektóre substancje nieaktywne. Na¬ stepnie wytracano insuline, najpierw chlorkiem so¬ du, nastepnie stosujac wytracenie izoelektiryczne.Otrzyfmana insuline rozpuszczano w 0,5 n kiwasie octowym i przesaczaino przez sieciowany zel elek- stiranowy. Przesaczona insuline przeprowadzano w cynk insuAine [Jackson i inni, Diabetes, 18, 206 (1969)], Wydajnosc insuiliiny po przesaczeniu przez _. zel wynosila okolo 60%.Wreszcie, saczeniie przez zel i chax)matografia jo¬ nitowa zostaly polaczone przez ScMichltikTulla i in¬ nych, jak podano w opisie patentowym Poludnio¬ wej Afryki nr 691/5280 (odpowiada opisowa paten- towemu belgijskiemu nr 737\257). W jednym przy¬ kladzie, dotyczacym saczenia przez zel (przyklad I) cynk insulina byla przepuszczana przez kolumne z sieciowanym zelem dekstranowym z wydajnos¬ cia 80%. Rozpuszczalnikiem eluujacym byl 1,0 m 40 kwas octowy. Nalezy podkreslic, ze SchichtkrulI i inmd uznali za konieczne, po filtracji, wysailanie, wyftracanie izoelekitryczne i krystalizacje cynku w celu otrzymania cynk insuiliiny.Kazdy z uprzednich sposobów stosowania sacze- 45 nia przez zel w celu oczyszczenia insiuflliny powo¬ dowal na ogól straty insuliny. Ponadto poprzednie metody nie dawaly pewnosci, ze w wyniku stoso¬ wania saczenia przez zel otozymuje sie tylko in¬ suline (polaczenie z proteinami inisulinopodobnymi, 50 jak podano powyzej).Na ogól, w procesie wedlug wynalazku mozna izastosowac kazdy odlpowdedni, peczniejacy w wo¬ dzie zel do rozpuszczonych protein. Jakkolwiek (takie zele beda posiadaly w stanie suchym luib nie 55 sjpeozmonym co najmniej okolo 4% wagowych wo¬ dy, w przeliczeniu na suchy zel i srednice czajste¬ czek beda mniejsze niz okolo 100 mikronów. Ko¬ rzystnie, gdy zawartosc wody w zelach bedzie w granicach okolo 4—9<8°/o, a zwlaszcza 5-h20%. Ko¬ go ^zyistnie, gdy srednice suchych czasteczek zedu sa niniejsze niz okolo 80 mikronów, szczególnie ko¬ rzystny jest zakres srednic czajsteczek od okolo 20 do okolo 80 mikronów.Przykladami odpowilednich zeli miedzy iranytmi sa es ,skrobia (wlacznie z kukurydz-iana), sieciowany gala-5 96533 6 ktomannan/' sieciowany dekstran-agar lufo agaroza, poliacyloaniidy, kopolimery acyloamidu z metyle- noHbis^akrylcaimidem, kopolimery metylleno-bis-aikry- loamidu z winyioetylo-fcarbfLtolem i z winylo-piro- lidonem i podobnymi. Najodpowiedniejszymi zela¬ mi sa siecioiwane dekstrany, takie, jak sephadex, produkowany i sprzedawany przez Pharmacia Fine Cnemicals, Inc. Fiscataway, N. J., USA.Rodzaj stosowanych kolumn nie jest istotny. Wy¬ bór wysokosci, srednicy i ksztaltu zalezy od po¬ zadanych parametrów prooesiu. Oczywiscie ze wzro¬ stem wysokosci kolumny maleje szybkosc prze¬ plywu; stwierdzono niezaleznie od siebie, ze opór kolumny jest wprost proporcjonalny do jej wyso¬ kosci. Z tego powodu korzystny jest ksztalt komi¬ nowy kolumny, taki jak Pharmacia Seotiional Co- lumin KS-370. Dila celów normalnej produkcji slu¬ zy bardzo dobrze kolumna zlozona z 6^ciu czesci.W przyfblizeniu zadowalajace oczysizczenie insu¬ liny mozna przeprowadzic w kolumnie, wypelnio¬ nej okolo 4,5 g insuliny w postaci soli metalu al¬ kalicznego lub soda amonowej na litr objetosci pod¬ loza. Takie wypelnienie jest najkorzystniejsze. Je¬ dnakze, na ogól wypelnienie kolumny moze wyno¬ sic 0,&-h6,7 g na litr objetosci podloza, korzystnie 3,6—6,0 g na lita: objetosci podloza. Naturalnie optymalne warunki moga byc ustalone z latwoscia dla kazdej kolumny.Zel mozna speczniac i wypelniac kolumne specz- nionyim zelazem w dowolny znany sposób. Na ogól zel specznia sie w srodku eluuijacym albo mozna go sjpecznic w 30% roztworze wodnym, etanolu, zdekantbwac i srodowisko speczniajace zastapic srodowiskiem eluujacym.Wynalazek dotyczy sposobu oczyszczania insu¬ liny w postaci soli metalu alkalicznego lub soli amonowej, polegajacego na specznianiu zelu, za¬ wierajacego w stanie suchym co najmniej okolo 4% wagowych wody i srednice czasteczek mniejsze niz okolo 100 mikronów, napelnieniu kolumny spe- czndonym zelem, podaniu na kolumne wodnego roz¬ tworu insuliny w pstaci soli metalu alkalicznego lub soli amonowej o czystosci co najmniej okolo 80°/o, przy czym stezenie insuliny lezy w grani¬ ach l—&fa wagowych na objetosc; calkowita ilosc insuliny jeslt wystarczajaca do wypelnienia kolu¬ mny w granicach od okolo 0,8 do okolo 6,7 g na litr objetosci podloza, pnzy pH roztworu w grani¬ cach 7,5—9,5 i elucji insuliny z kolumny w temperaturze 5-^30°C wodnym roztworem eluanta o pH, utaymanym w takich samych granicach, jak /oztwór insuliny.Na ogól insuline w postaci soli metalu alkalicz¬ nego luib sold amonowej rozpuszcza sie w wodzie destylowanej i koryguje pH za pomoca rozcien¬ czonej zasady lub rozoienczalnego buforu organi¬ cznego. Odpowiednimi zasadami sa wodorotlenek sodu, potasu, litu, amonu i podobne. Wodorotlenek sodu jest najodpowiedniejszy. Przykladami odpo¬ wiednich buforów onganicznych sa: wodorotlenek gliicyno-sodowy, tróji/hydiroksymietyloZ-aminometan i podobne.Na ogól insuline w postaci soli metalu alkalicz¬ nego lub soli amonowej mozna wytwarzac w do¬ wolny znany sposób. Jednakze, korzystnie jest wy¬ twarzac sposobem, opisanym w opisie patentowym St. Zjedn. Amer. nr 3i7i10©55. Jak wykazano po¬ wyzej, insulina powinna byc o czystosci co naj¬ mniej 80°/o. To jest, zawaritbsc insuHiny wlacznie z pnoteinamii insulinopodobnymi, wykazujacymi aktywnosc hypoglicemiczna, powinna wynosic co najmniej okolo 80% icalkowitej zawartosci protein.Stezenie roztworu soli metalu alkalicznego lub amonowej insuliny, wprowadzanego na kolumne, powinno wynosic, jak stwierdzono powyzej, 1—8% wagowych na objetosc. Korzystne stezenie 4—6%.Zadowalajace rezultaty otrzymuje sie, gdy sól metalu alkaflicanego lub sól amonowa insuliny roz¬ pusci sie w mndejsizej objetosci rozpuszczalnika niz objetosc stosowana przy rozdzielaniu, co zostalo omówione ponizej.W chromatografii, wspólczynnik podzialu Kd, jest okreslony jako stosunek stezenia substancji rozpuszczonej w fazie ruchomej do stezenia sub¬ stancja rozpuszczonej w fazie stacjonarnej. W sa¬ czeniu przez zel faze ruchoma stanowi rozpusizczaiL- niik, poruszajacy sie w rjrtoesllarlzeni por pomiedzy czasteczkami zelu, a .faze stacjonarna stanowi roz¬ puszczalnik, pochloniety w czasteczkach zelu, tj. zatnzyimany w porach wewnatrz kazdej ozaslteczki zelu. Tak wiec wspólczynnik Kd wskazuje te frak¬ cje pochlonietego rozpuszczalnika, która jest na¬ sycona spbsttancja rozpuszczona.W okresleniach Kd, objetosc eluanta, Ve, sub¬ stancji rozpusizczonej moze byc wyrazona równa- ntem Ve = V0+|Kd-V1 gdizie V0 oznacza objetosc por w kolumnie, Vi oznacza objetosc pochlonietego rozpuszczalnika.Oznaczajac Kd, równanie przyjmuje postac Jesli gestosc wody przyjmie sie za jednosc, Vi = a •¦ Wr, gdizie a oznacza ciezar suchego zelu, Wr zawartosc wody.W ten sposób _ Ve-Vo Kd" aWr i moze byc oznaczony doswiadczalnie przez fa¬ chowców z tej dziedziny.Przyjmujac, ze roztwór zawiera dwie substancje * irozpusiaazone, objetosc elucji dla kazdej substacji rozpuszczonej wyraza sie nastepujaco: Ve' ^o+iK^i Ve" =V0+/Kd"Vi Objetosc rozdzielania, Vs, stanowi róznice po¬ miedzy objetoscia elucji dwóch substancji rozpu¬ szczonych: V.=.-Ve"—Ve' Vs=:(Kd"^Kd')Vi Z powyzszego wynika, ze stopien rozdlzielenia dwóch (lub wiecej) subsltancjii rozpuszczonych jest czesciowo zalezny od obciazenia kolumny. Kiedy 40 45 50 55 60$6533 8 ilosc substancji rozpuszczonych o nizszym ciezarze czasteczkowym zbliza sie do granicy wolnych por, rozdzial dwóch substancji rozpuszczonych z ko¬ niecznosci musi zmalec. W gtranicach obciazenia, ctaeslonych jako czesc niniejszego' wynalazku, sto- 8 pien rozdzialu moze sie zmieniac. W pewnych przypadkach, wyzsze obciazenie kolumny moze byc dopuszczalne dla zrównowazenia rozdzielania w stosunku do wydajnosci.Jak stwierdzono uprzednio, srodek eluujacy moze 10 .posiadac pH w granicach 7,5 do 9,5. Zazwyczaj srodkiem eluujacym jest wodny roztwór tej samej zasady lub buforu, stosowanego przy otrzymywaniu roztworu insuliny.Jesli itrzeba, "srodek eluujacy moze zawierac sól 15 nieorganiczna w ilosci do okolo 0,02 m na Mtir, ta¬ ka jak chlorek sodu, chlorek potasu, chlorek amo¬ nu i podobne. Korzystne stezenie wynosi 0,01 m, a korzystna sola jestt chlorek sodu. Zastosowanie takiej soli jest korzystne w celu polepszenia zdol- 20 nosci rozdzielczej i zabezpieczenia substancji pod¬ stawowej przed zaabsorbowaniem przez zel.Elucje kolumny mozna przeprowadzic w grani¬ cach temperaitury 5-^30°C, korzystnie w temperatu¬ rze otoczenia lufonizej. 25 Przebieg eftioji mozna kontrolowac w jakikolwiek dogodny sposób. Jfednakze szczególna^ dogodna jest metoda pomiaru absorpcji przy 280 m|x kazdej frakcji. Erakcje te, stanowiace oczyszczony skla- dnik insuliny, laczy sie i zazwyczaj przeprowadza 30 w cynk insulinie.Jak zaznaczono powyzej, cynk insulina jest najwazniejsza postacia insuliny. W konsekwencji, otrzymana w procesie insuline w postaci soli me¬ talu alkalicznego lub soli amonowej o wysokiej 35 czystosci przeprowadza sie w cynk insuline. Prze¬ mianie w cynk insuline przeprowadza sie korzy¬ stnie przy pH = 6,0 w obecnosci octanu amonu jako buforu. Nie ma potrzeby izolowania soli me¬ talu alkalicznego lub amonowej insuliny ze sro- 40 dowasika eluujacego luib zatezenia roztworu oczy¬ szczonej insuliny przed krystalizacja z cynikiem.Postepem w niniejszym procesie jest to, ze roz¬ twór izolowanej insuliny jest dostatecznie stezo¬ ny i ze nie ma potrzeby stosowania wysalania 45 luib izoelektrycznego wytracania, jakkolwiek, je¬ sli trzeba mozna te procesy stosowac.W wyniku stosowania sposobu wedllug wyna- •lazku otrzymuje sie cynk insuline o wiekszej czy¬ stosci. Ta polepszona czystosc moze byc udowod- 50 niona róznymi metodami. Cynk insuline mozna analizowac bezposrednio na obecnosc protein nie- insulinowych, takich jak proinsulina i glukagon.Obecnosc protein wielkoczasteczkowych, ido których nalezy protaminaza, proteolityczny enzym, moze 55 byc oznaczona przez pomiar sitalbilnosci zawiesi¬ ny insuliny protaminowiej w podwyzszonej tem¬ peraturze, jesli protaminaza jest obecna, kom¬ pleks insuliny protaiminowej bejdzie dysocjowal z powodu rozkladu protaminy. Moga byc miesza- 60 ne fizyczne wlasnosci, takie jak rozpuszczalnosc cynk insuliny w obojetnym pH i zabarwienie otrzymanego roztworu. Wireszcie, aktywnosc wla¬ sciwa insuliny moze byc mieszana za pomoca prób bakteriologicznych i immunologicznych. 65 Z powodu wyzszej czystosci cynk insulina, o- trzymana sposobem wedlug wynalazku, jest po¬ zadanym skladnikiem przy wytwarzaniu róznych postaci farmakologicznych insuliny, takich jak insulina zwykla, insulina izofanowa,, protaminowa cynk insulinai, zawiesina cynk insuliny, insulina iglobinowa i podobne. Nastepnie, bardziej czysta insulina umozliwia otrzymanie obojetnej insuliny, która, jest postacia bardziej trwala niz insulina w postaci kwasowej. Zanieczyszczenia, które po¬ przednio wystepowaly w cynk insulinie czesto wytracaja sie czesciowo w obojejtnym pH. Takie zanieczyszczenia zawieralyby czesto enzymy, po¬ wodujace rozklad insuliny, takie jak trypsyna i chymotrypsyna, które zmniejszaja aktywnosc preparatu insuliny. Bardziej czysta insulina umo¬ zliwia wytwarzanie preparatów insuliny o prze¬ dluzonym dzialaniu z wieprzy i wolów bez do¬ datkowego oczyszczania wymaganego uprzednio.Wreszcie, wytwarzanie insufliny izofanowej z bar¬ dziej czystej cynk insuliny wyrnagia mniejszej ilo¬ sci protaminy, poniewaz brak zanieczyszczen pro¬ teinami kwasowymi umozliwia uzycie protaminy tylko w ilosci, niezbednej do wytracania insu¬ liny. m sposób wedlug wynalazku moze ewentualnie byc polaczony z innymi sposobami oczyszczania.Np. roztwór insuliny w postaci soli metalu alkai- lioznegp lub amonowej mozna poddawac jednemu lub wiecej procesom saczenia przed procesem saczenia przez zel. Równiez insuline eiuowana mozna poddawac jednemu lub wiecej procesom saczenia przed reakcja przemiany w cynk insu¬ line.Przyklad I. 5,53 g insuliny sodowej z wolu o aktywnosci 26,4 jednostek/mg i zawartosci 7,2% wagowych proinsuliny zawiesza sie w wodzie de¬ stylowanej. Rbzcienczony wodorotlenek sodu do¬ daje sie do wartosci pH=9,0. Objetosc otrzy¬ manego roztworu wynosi 100 ml. Sieciowany zel dekstranowy o zawartosci wody 5% i wymiarach czastek 20—80 \i korygiuje sie w wodnym roztwo¬ rze wodorotlenku sodu do pH = 9,0. Speczniony zel stosuje sie do napelniania kolumny o wymia¬ rach 4,0X43,0 cm i objetosci podloza 540 ml. 40 ml roztworu insuliny wiproWadiza sie do kolumny. Na¬ stepnie ^kolumne eluuje sie wodnym roztworem wodorotlenku sodu o pH = 9, zbierajac frakcje okolo 6y5 ml. Eluoje kontroluje sie przez pomiar absorpcji w ultrafiolecie przy 280 m \i. Hrafccje, zawierajace insuline, laczy sie i zakwasza do pH = = 3,0 za pompca 6 n kwasu solnego. Otrzymany roztwór przesacza sie, dodaje chlorku cynku i wy- osabnia cynk insuline przy pH = 6fi z buforu oc¬ tanu amonowego..Wydajnosc cynk insuliny wynosi ly83 g, co od¬ powiada 82,5% w stosunku do produktu wyjscio- iwego. Insulina wykazuje aktywnosc 26,8 jednostek/ /mig i zawartosc proinsuliny mniejsza niz 0,05% wagowych; odzyskano 83,8% w przeliczeniu na jed¬ nostke wyjsciowa. 37,5 ml roztworu oryginalnej insuliny przeprowa¬ dzono bezposrednio w cynk insuline, jak opisano powyzej bez stosowania etapu saczenia przez zel.96533 Odzyskano 1,87 g (90yl%) cynik insuliny o zawar¬ tosci proinsuiMny 5,4% wagowych. PL