CS199577B2 - Způsob čištění insulinu - Google Patents

Description

Vynález se týká způsobu čištění insulinu ve formě soli alkalického kovu nebo soli amonné.

Předmětem vynálezu je tedy způsob čištění insulinu ve formě soli alkalického kovu nebo amonné soli, vyznačující se tím, že se nabobtná gel, schopný přijímat v suchém stavu 4 až 98 hmotnostních % vody, mající částečky o průměru 20 až 80 mikronů, nabobtnalým gelem se naplní kolona, do níž se vpustí vodný roztok soli insulinu a alkalického kovu nebo amonné soli o čistotě nejméně 80 °/o, přičemž koncentrace insulinu je v rozmezí od 1 do 8 % (hmotnostní procenta/objemová procenta) a celkové množství insulinu dostačuje k zatížení kolony v rozmezí od 0,8 do 6,7 g na litr objemu náplně v koloně, přičemž hodnota pH roztoku je v rozmezí od 7,5 do 9,5, načež se vymývá insulin z adsorbentu za teploty v rozmezí od 5 do 30 °C vodným roztokem s obsahem až 0,02 M anorganické soli o stejné hodnotě pH, jakou měl původní roztok insulinu.

Výhodným gelem je zesítněný dextran, schopný přijmout 5 až 20 % hmotnostních vody.

Od doby svého objevu v r. 1921, kdy byl insulin nalezen v pankreasu, má insulin na celém světě mimořádnou důležitost při léč2 bě cukrovky (diabetes mellitusj. Protože při postupech extrakce insulinu z pankreasové tkáně se extrahují rovněž podstatná množství jiných proteinů kromě insulinu, bylo vynaloženo mnoho úsilí na čištění insulinu, například tedy na nalezení postupů dělení insulinu od jiných proteinů. Některé z postupů čištěni insulinu jsou značně používány.

Jeden z těchto výrobně důležitých postupů, a to jeden z nejstarších, využívá obecného jevu, že rozpustnost proteinu je nejnižší v isoelektrickém bodě za dodržování dalších konstantních podmínek. V US patentu číslo 1 469 994 je popisován postup, vyznačující se tím, že se z vodného extraktu z pankreasu vysrážejí proteiny neinsuíinové povahy v odpovídajících isoelektrických bodech. Isoelektrické vysrážení insulinu z vodného extraktu pankreasu za hodnoty pH od asi 4 do asi 7 je popsáno v americkém patentovém spise číslo 1 520 673.

Při jednom z původních někdejších postupů se provádí srážení insulinu přidáním dostatečného množství anorganické soli. V US patentu číslo 1 547 515 je popsán prvý způsob vysolení insulinu z rozpouštědla, použitého při reakci, a to. přidáním chloridu sodného. Diferenciální postup vysolování je popsán v US patentu číslo 2 449 076, a vyznačuje se vysolením insulinu přidáním

199 5 77 chloridu sodného k neutralisovanému extraktu s následující filtrací, novým rozpuštěním zbytku a opakovaným vysolením insulinu, ale za použití soli v nižší koncentraci, než jak to bylo použito v prvém stupni vysolení.

Třetí, provozně důležitý způsob čištění insulinu se týká vysrážení nebo krystalisace insulinu z roztoku komplexu insulinu se zinkem. Obecně se tento komplex vysráží z pufrovaného, vodného roztoku, obsahujícího zinečnaté ionty. Byly použity četné pufry, například podle US patentu číslo 2 626 228 se používá pufr, obsahující kyselinu citrónovou a její soli.

Současně používané provozně způsobilé postupy čištění insulinu zahrnují typicky všechny tři výše zmíněné způsoby. Protože komplex insulinu se zinkem je nejdůležitější obchodní formou insulinu, týká se obvykle poslední stupeň čištění tohoto komplexu krystalizaci.

V posledních letech však bylo nalezeno, že proteiny nelrisulinové povahy, mezi nimiž obvykle převažují proinsulinové a jim podobné proteiny, tvoří menší složku obchodně používaného komplexu insulinu se zinkem. Ačkoliv tyto složky obvykle představují pod asi 8 °/o hmotnostních obchodně používaného komplexu insulinu se zinkem, má se za to, že některé z těchto složek mají antigenní nebo imunogenní vlastnosti, viz například Ghance a spol., Science 161, 165 (1968); Steiner a spol., Diabetes 18, 725 (1968); Bromer BioScience 20, 701 (1970) a Rubenstein a spol., Ann. Rev. Med. 22, 1 (1971).

Stále trvajícím problémem je tedy odstranění proteinů neinsulinové povahy z insulinu za použití provozně a obchodně způsobilého postupu.

Výraz „insulin”, jak je zde používán, zahrnuje nejen insulin jako takový, ale i proteiny, podobné insulinu, jako je'desamidoinsulin. Protože insulm a proteiny podobné nsulinu se vyznačují podobnou hypoglykemickou účinností, není obvykle třeba dělit insulih od jiných pankreatických proteinů, a není tedy třeba obvykle připravovat homogenní insulin.

Jsou známé postupy dělení biologicky účinných látek na analytickém podkladu, jako je elektroforesa a chromatografie na iontoměničích, a dají se takto oddělit neinsulinové složky od insulinových složek v obchodních (nebo i surových) přípravcích insulinu. Těmito postupy je i možno dělit insulinové složky na insulin jako takový a desamidoinsuliny. Tyto postupy mají však pochybnou použitelnost při použití ve velkoprovoze.

Postup, který se dá snáze přizpůsobit zpracovávání na veliko, je gelová filtrace (což je rovnocenný pojem výrazům gelová exklusní ehromatografie a gelová permeační chromatografie. Při tomto postupu se dělí proteiny na koloně, obsahující gel, který byl zesítěn takovým způsobem, že vzniknou póry v každé částečce gelu. Tyto póry se vyznačují stálým, měřitelným objemem, který je přímo úměrný stupni nabobtnání gelu a menší molekuly mají lepší přístup k těmto pórům než větší molekuly, je postup menších molekul kolonou ztížen ve srovnání s většími molekulami, majícími pouze částečný přístup, případně vůbec žádný přístup k pórům.

V uplynulé době byla již gelová filtrace použita k čištění insulinu; při isolování insulinu z pankreatů jednotlivých koček byl surový insulin získán extrakcí alkoholem za přítomnosti kyseliny s následujícím vysrážením neúčinných složek v alkalickém prostředí, dále se zahuštěním, vysrážením v isoelektrickém bodě a posléze s vysolením za použití srážení chloridem sodným. Surový insulin se potom využije k dělení na koloně s gelem zesítěného dextranu s následujícím eluováním 1,0 M roztokem kyseliny octové, viz Davoren, Biochim. Biophys. Acta 83, 150 (1962).

Při isolování insulinu z ryb se homogenisují žlázy ve vodě, a proteiny se vysrážejí roztokem kyseliny trichloroctové. Sraženina se extrahuje ethanolem, obsahujícím kyselinu, a z extraktů se methylenchloridem odstraní lipidní složky. Zbývající pevné podíly se isolují, a po rozpuštění v 5,0 M roztoku kyseliny octové se roztok filtruje na koloně se zesítěným dextranem za použití 5,0 M roztoku kyseliny octové jako elučního rozpouštědla, viz Humbel, Biochem. Bjophys. Res. Communs, 12, 333 (1963). Uvádějí se výtěžky okolo 80 %. Je třeba poznamenat, že Humbel uvádí, že pro dobré dělení insulinů od dalších proteinů se mají volit podmínky při eluování, podporující disociacl molekul insulinu. Dále tvrdí Humbel, že 1,0 M roztok kyseliny octové není uspokojujícím rozpouštědlem, protože podle sdělení Yphantise a Waugha, viz Biochim. Biophys. Acta 26, 218 (1957), není tamže insulin dostatečně disoeiován.

Surový extrakt z pankreasu hovězího dobytka se filtruje na gelu zesítěného dextranu, jak to popisuje Epstein a spol., Biochemistry 2, 461 (1963). Jako eluční rozpouštědlo byl použit 0,2 M roztok hydrogenuhličitanu amonného, tedy rozpouštědlo, o kterém se již zmiňuje Humbel (citace výše). Epstein a spol. uvádějí výtěžek asi 60%.

Insulin byl isolován z pankreatu lidí; žlázy byly nejprve homogenisovány, a potom extrahovány, frakcionací síranem amonným byly odstraněny určité podíly inaktivních materiálů, insulin byl vysrážen, nejprve chloridem sodným, potom vysrážením v isoelektrickém bodě. Získaný insulin byl rozpuštěn v 0,5 N roztoku kyseliny octové, a roztok byl filtrován na gelu zesítěného dextranu. Filtrovaný insulin byl převeden na komplex insulinu se zinkem, viz Jackson a spol., Diabetes, 18, 206 (1969). Výtěžek insulinu po gelové filtraci činí asi 60 %.

Posléze byl postup gelové filtrace a chromatografie na iontoměničích kombinován podle jihoafrického patentového spisu číslo 69/5280 (odpovídajícího belgickému patentu číslo 737 257], V jediném příkladu gelové filtrace (viz příklad 1) se filtruje komplex , insulinu se zinkem na koloně se zesítěným dextranem, a to za dosažení výtěžku 80 %. Jako roztok při eluování se použije 1,0 M roztok kyseliny octové. Je třeba poznamenat, že Schlichtkrull a spol., zjistili, že je třeba po filtrování provádět postup vysolení za dodržení isoelektrickéhovysrážení a krystalizace zinečnetého komplexu při isolování komplexu insulinu se zinkem.

Při každém z předchozích postupů gelové filtrace pří čištění insulinu byla zaznamenána podstatná ztráta insulinu. Dále pak podle předchozích postupů zde není spolehlivý odkaz na to, že lze získat pouze insulin (počítaje v to proteiny, podobné insulinu, jak je o nich výše řeč J v důsledku použití gelové filtrace.

Obecně řečeno, může se použít jakýkoli gel, bobtnatelný vodou, to za použití roztoků proteinů a postupu podle tohoto vynálezu. Avšak takový gel se má vyznačovat za sucha, nebo v nenabobtnalém stavu schopností poutat vodu v množství nejméně hmotnostně 4 %, přepočteno na hmotnost suchého gelu, jakož i částečkami o průměru pod asi 100 mikronů. S výhodou ěiní schopnost gelu poutat vodu od asi 4 do asi 98 °/o, a nejvýhodněji od asi 5 do asi 20 %. S výhodou mají být průměry suchých, částeček gelu menší než asi 80 mikronů a zvláště výhodné rozmezí průměru částeček činí od asi 20 do asi 80 mikronů.

Jako příklady vhodných gelů lze uvést mezi četnými jinými (počítaje v to kukuřičný škrob) zesítěný galaktomannan, zesítěný dextran, agar nebo agarosu, polyakrylamidy, kopolymery akrylamidu a methylen-bis-akrylamidu, kopolymery mB.thylen-bis-akrylamidu s vinylethylkarhinolem a s vinylpyrrolidonem, a podobně. Výhodnými gely jsou zesítěné dextrany, jako je sefadex.

Typ kolony, použité při postupu podle tohoto vynálezu, nemá rozhodující význam. Volba výšky kolony, průměr kolony, nebo její tvar je vždy závislý na žádoucích parametrech postupu. Je jasné, že jak se výška kolony zvyšuje, snižuje se průtoková rychlost, či jinak řečeno, zpětný tlak je přímo úměrný výšce kolony. Z těchže důvodů je sestava patrové kolony pokládána za výhodnou, například v úpravě, jako je „Pharmacia Sectional Column KS-370”. Pro účely normální produkce slouží dobře patro se šesti sekcemi.

Například lze uvést vyhovující dělení a čištění insulinu na koloně s možným zatížením asi 4,5 g soli insulinu s alkalickým kovem nebo amonné soli insulinu na litr lože kolony, což je rozmezí nejvýhodnější. Avšak zatížení kolony může obvykle kolísat od asi 0,8 do asi 6,7 g na litr lože kolony, přičemž výhodným rozmezím je rozsah od asi 3,5 do asi 5,0 g na litr lože kolony. Pochopitelně lze stanovit optimální podmínky velmi snadno pokusně pro každou kolonu.

Gel je možno bobtnat, nebo je možno plnit kolonu nabobtnalým gelem jakýmkoli možným postupem, jak jsou známé odborníkům na tomto úseku. Obecně se gel bobtná elučním prostředím. Jinak je možno bobtnat gel 30% vodným ethanolem, přičemž se jemné podíly dekantují, a bobtnací prostředí se nahradí elučním prostředím.

Obecně <se sůl insulinu a alkalického kovu, nebo amonná sůl insulinu rozpustí v destilované vodě, a hodnota pH se upraví jak je to žádoucí zředěným roztokem báze nebo zředěným roztokem organického pufru. Jako vhodné báze lze uvést hydroxid sodný, hydroxid draselný, hydroxid lithný, vodný roztok amoniaku a podobně. Jako výhodnou sloučeninu lze uvést hydroxid sodný. Co příklad vhodpého organického pufru lze uvést kombinaci glycinu a hydroxidu sodného, tris-(hydroxymethyljaminomethan, a podobně.

Obecně řečeno, může se sůl Insulinu a alkalického kovu nebo amonná sůl insulinu připravovat známými postupy. Je však výhodné připravovat sůl insulinu a alkalického kovu, nebo amonnou sůl insulinu postupem podle US patentu číslo 3 719 655. Jak to zde již bylo uvedeno, má mít řečený insulin čistotu nejméně asi 80 %, což znamená, že. obsah, insulinu, počítaje v to proteiny, podobné insulinu, vyznačující, se glykemickou aktivitou, má činit nejméně asi 80 %, přepočteno na veškeré přítomné proteiny.

Koncentrace soli insulinu a alkalického kovu, či amonné soli insulinu v roztoku, použitém na té či oné koloně, činí, jak je to uvedeno výše, od asi 1 do asi 8 %,. uvedeno jako hmotnost na objem. Výhodnou koncentrací je rozsah od asi 4 do asi 6 .%.

Pro uspokojivé výsledky se má sůl insulinu a alkalického kovu nebo amonná sůl insulinu rozpustit v Objemu rozpouštědla, který je nižší než objem, použitý při dělení, jak je o tom výše řeč.

Při chromatografování je distribuční koeficient K_d definován jako poměr koncentrace rozpuštěné složky v pohyblivé fázi ke koncentraci rozpuštěné složky ve stacionární fázi. Při gelové filtraci je pohyblivá fáze definována jako rozpouštědlo, pohybující se ve volném prostoru mezi částečkami gelu, a stacionární fázi je rozpouštědlo, jímž jsou zaplněny částečky gelu, tj. podíl rozpouštědla, uzavřeného v pórech každé z částeček gelu. Takže K_d značí onu frakci zachyceného rozpouštědla, jež obsahuje rozpuštěnou složku.

Za použití elučního objemu K_d lze podíl V_e rozpuštěné složky vyjádřit rovnicí:

' V_e = V₀ + K_d. Vi kde V_o je objem kolony a V_; je objem zadr199577 ženého rozpouštědla. Řešením pro K_d se dá rovníce upravit na

Jestliže se hustota vody pokládá za rovnou 1, pak Ví = a . W_r, kde a je výška suchého gelu a W_r je podíl zadržené vody. Takže K_d činí což mohou odborníci na tomto úseku stanovit experimentálně.

Za předpokladu, že roztok obsahuje 2 rozpuštěné složky, lze elučni objem pro každou složku vyjádřit takto:

V’_e = V_o + K_d’Vj V”_e = V„ + K_d”Vi

Dělící objem, V_s, je rozdíl mezi elučními objemy obou dvou rozpuštěných složek:

V_s = V_e” - V’_e

V_s = (K_d - KďjVi

Z předchozího je zjevné, že stupeň dělení dvou (či více) složek je z části závislý na zatížení kolony. Jak se množství rozpuštěných složek o nižší molekulové hmotnosti blíží limitu dostupných pórů, musí nutně dojít ke snížení dělení mezi dvěma rozpuštěnými složkami. Mezi limitními hodnotami zatížení, jak jsou specifikovány jako část tohoto vynálezu, může stupeň zatížení kolísat. V některých případech se může volit vyšší zatížení kolony k vyvážení dělení proti produktivitě.

Jak to zde již bylo uvedeno výše, může mlt elučni prostředí hodnotu pH v rozmezí od asi 7,5 do asi 9,5. Obvykle se jako eluční prostředí používá vodný roztok stejné báze nebo pufru, jak byl použit při přípravě roztoku insulinu.

Je-li to žádoucí, může elučni prostředí obsahovat až do asi 0,02 molů anorganické soli na litr, tedy například chloridu sodného, draselného, amonného a podobně. Za výhodnou koncentraci lze pokládat 0,01 M, a za výhodnou sůl je třeba pokládat chlorid sodný. Použití takové soli je výhodné pro zlepšení dělení, přičemž je znemožněno navíc adsorbování bazických látek na gelu.

Eluování kolony se dá provádět za teplot v rozmezí od asi 5 do 30 °C. S výhodou se postup provádí za teploty od 20 °C níže.

Eluování se provádí jakýmkoli běžným postupem, a jako zvláště použitelný postup lze uvést měření ultrafialové absorpce při 280 nm u každé frakce. Ty frakce, které obsahují podle zjištění jako složku vyčištěný in8 sulin, se spojují a obvykle se převedou na komplex Insulinu se zinkem.

Jak to zde již bylo výše uvedeno, je komplex insulinu se zinkem nejdůležitější formou insulinu. V důsledku toho se sůl insulinu s alkalickým kovem nebo amonná sůl insulinu o vysoké čistotě, jak se získá postupem podle tohoto vynálezu, převádí na komplex insulinu se zinkem. Konverse na komplex insulinu se zinkem se s výhodou provádí za hodnoty pH 6,0 za přítomnosti octanu amonného jako pufru. Není třeba isolovat sůl insulinu s alkalickým kovem nebo amonnou sůl insulinu z elučního prostředí, nebo koncentrovat roztok vyčištěného insulinu před krystalizaci se zinkem. Výhodou postupu podle tohoto vynálezu je to, že roztok insulinu, jak se eluuje, je dostatečně koncentrovaný takže vysolení nebo elektrické vysrážení není nutné, ačkoli se takové postupy mohou provádět, je-li to třeba.

Zinečnatý komplex insulinu, takto získaný, se vyznačuje lepší čistotou v důsledku použití tohoto postupu. Zvýšenou čistotu lze dokázat několika způsoby. Komplex insulinu se zinkem lze analyzovat přímo se zřetelem na zjištění neínsulinových proteinových složek, jako je prolnsulin a glukagon. Přítomnost proteinů o vysoké molekulové hmotnosti a tam patří jako typický příklad proteminása, tedy proteolytický enzym, se dá stanovit měřením stálosti protaminové suspense insulinu za zvýšených teplot. Za přítomnosti protaminasy se komplex insulinu s protamlnem disociuje v důsledku degradace protaminu. Lze měřit fyzikální vlastnosti, jako je rozpustnost komplexu Insulinu se zinkem za neutrálního pH a barva vzniklého roztoku. Posléze je možno měřit specifickou účinnost Insulinu biologickými a imunologickými testy.

V důsledku vyšší čistoty je komplex insulinu se zinkem, získaný provedením postupu podle tohoto vynálezu, vhodným materiálem pro úpravu do různých farmaceutických přípravků insulinu, např. insulinu co takového, isofán-insulinu, protaminového komplexu insulinu se zinkem, suspense komplexu insulinu se zinkem, globin-insulinu a podobně. Dále pak dovoluje čistší forma komplexu insulinu se zinkem přípravu neutrálního insulinu, který je stálejší ve srovnání s kyselou formou insulinu; nečistoty, které přítomné v komplexu insulinu se zinkem, se často částečně vysrážejí za neutrální hodnoty pH. Takové nečistoty by často obsahovaly enzymy, odbourávající insulin, jako je trypsin a chymoprypsin, snižující účinnost insulinových přípravků. Čistší komplex insulinu se zinkem rovněž dovoluje výrobu přípravků insulinu z prasat nebo hovězího dobytka s prodlouženým účinkem, aniž by bylo třeba provádět další čistění, jak to bylo třeba v minulé době. Posléze vyžaduje příprava isofan-insulinu s čistších komplexů insulinu se zinkem méně protaminu, protože bez přítomnosti nečistot povahy kyselých proteinů je možno použití jen takového množství protaminu, jehož je třeba k vysrážení insulinu.

Postup podle tohoto vynálezu lze kombinovat, jak je to třeba, s dalšími postupy čištění, například lze roztok insulinu s alkalickým kovem, nebo amonné soli insulinu filtrovat jednou či vícekfáte před prováděním vlastní gelové filtrace. Rovněž je možno filtrovat eluovaný insulin jednou či vícekráte dříve, než se převádí na komplex insulinu se zinkem.

Příklad 1

5,53 g sodné soli insulinu z hovězího dobytka o účinnosti 26,4 jednotek na mg s obsahem 7,2 % hmotnostních proinsulinu se suspenduje v destilované vodě. Přidá se zředěný roztok hydroxidu sodného až k pH 9,0. Objem vzniklého roztoku činí 100 ml, načež se použije gel zesítěného dextránu, vyznačující se schopností přijímat 5 % vody, a velikostí částeček od 20 až do 80, upravených do rovnovážného stavu ve vodném roztoku hydroxidu sodného o pH 9,0. Nabobtnalý gel se použije jako náplň kolony rozměrů 4,0 na 43,0 cm s objemů 540 ml. Alikvotní část 40 ml roztoku insulinu se nanese na kolonu, načež se kolona eluuje vodným roztokem hydroxidu sodného o pH 9,0, přičemž se jímají frakce o objemu 6,5 ml. Eluování se provede měřením ultrafialové absorpce při 280 μτη. Frakce, odpovídající insulinové složce, se spojí, a okyselí se na pH 3,0 přidáním 6 N roztoku kyseliny chlorovodíkové. Vzniklý roztok se filtruje, přidá se chlorid zinečnatý, a komplex insulinu se zinkem se isoluje za pH 6,0 z pufru octanu amonného. Výtěžek komplexu insulinu se zinkem činí 1,83 g, což odpovídá výtěžku 82,5 %, přepočteno na výchozí složku. Insulin se vyznačuje účinností 26,8 jednotek/mg, a obsahem proinsulinu hmotnostně pod asi 0,05 %; přepočteno na jednotky činí výtěžek 83,8 °/o.

Podíl 37,5 ml původního roztoku insulinu se převede přímo, jak je to výše popsáno, na komplex insulinu se zinkem, a to bez stupně gelové filtrace. Výtěžek činí 1,87 g, tj. 90,1% komplexu insulinu se zinkem s obsahem proinsulinu 5,4 % hmot.

Claims (6)

1. Způsob čištění insulinu ve formě Soli alkalického kovu nebo amonné soli, vyznačující se tím, že se nabobtná gel, schopný přijímat v suchém stavu 4 až 98 % hmotnostních vody mající částečky o průměru 20 až 80 mikronů, nabobtnalým gelem se naplní kolona, do níž se vpustí vodný roztok soli insulinu a alkalického kovu nebo amonné soli ó čistotě nejméně 80 °/o, přičemž koncentrace insulinu je v rozmezí od 1 do 8 % (hmotnostní %/objemová °/o) a celkové množství insulinu dostačuje k zatížení kolony v rozmezí od 0,8 do 6,7 g na litr objemu náplně v koloně, přičemž hodnota pH roztoku je v rozmezí od 7,5 do 9,5, načež se vymývá insulin z adsorbentu za teploty v rozmezí od 5 do 30 °C vodným roztokem obsahem až 0,02 M anorganické soli o stejné hodnotě pH, jakou měl původní roztok insulinu.

YNALEZU

2. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že se jako řečený gel používá zesítěný dextran, schopný přijmout 5 až 20 % hmotnostních vody.

3. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že zatížení kolony činí od 3,5 do 5,0 g na litr objemu vrstvy náplně v koloně, s výhodou 4,5 g na litr vrstvy v koloně.

4. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že se používá roztok anorganické soli o koncentraci 0,01 M.

5. Způsob podle bodu 4, vyznačující se tím, že se jako anorganická sůl používá chlorid sodný.

6. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že se eluování provádí za, teploty místnosti.