CS199577B2

CS199577B2 - Process for the purification of insuline

Info

Publication number: CS199577B2
Application number: CS83475A
Authority: CS
Inventors: Richard L Jackson; John G Stilz
Original assignee: Lilly Co Eli
Priority date: 1975-02-10
Filing date: 1975-02-10
Publication date: 1980-07-31

Description

Vynález se týká způsobu čištění insulinu ve formě soli alkalického kovu nebo soli amonné.The invention relates to a process for purifying insulin in the form of an alkali metal salt or an ammonium salt.

Předmětem vynálezu je tedy způsob čištění insulinu ve formě soli alkalického kovu nebo amonné soli, vyznačující se tím, že se nabobtná gel, schopný přijímat v suchém stavu 4 až 98 hmotnostních % vody, mající částečky o průměru 20 až 80 mikronů, nabobtnalým gelem se naplní kolona, do níž se vpustí vodný roztok soli insulinu a alkalického kovu nebo amonné soli o čistotě nejméně 80 °/o, přičemž koncentrace insulinu je v rozmezí od 1 do 8 % (hmotnostní procenta/objemová procenta) a celkové množství insulinu dostačuje k zatížení kolony v rozmezí od 0,8 do 6,7 g na litr objemu náplně v koloně, přičemž hodnota pH roztoku je v rozmezí od 7,5 do 9,5, načež se vymývá insulin z adsorbentu za teploty v rozmezí od 5 do 30 °C vodným roztokem s obsahem až 0,02 M anorganické soli o stejné hodnotě pH, jakou měl původní roztok insulinu.Accordingly, the present invention provides a method of purifying insulin in the form of an alkali metal or ammonium salt, wherein the swollen gel capable of receiving in the dry state 4 to 98% by weight of water having particles of 20 to 80 microns in diameter is filled with the swollen gel. a column into which an aqueous solution of an insulin-alkali metal salt or an ammonium salt of at least 80% purity is introduced, with an insulin concentration ranging from 1 to 8% (w / v) and the total amount of insulin sufficient to load the column in the range of 0.8 to 6.7 g per liter of column volume, the pH of the solution being in the range of 7.5 to 9.5, after which the insulin is eluted from the adsorbent at a temperature in the range of 5 to 30 ° C aqueous solution containing up to 0.02 M inorganic salt at the same pH as the original insulin solution.

Výhodným gelem je zesítněný dextran, schopný přijmout 5 až 20 % hmotnostních vody.A preferred gel is cross-linked dextran capable of receiving 5-20% by weight of water.

Od doby svého objevu v r. 1921, kdy byl insulin nalezen v pankreasu, má insulin na celém světě mimořádnou důležitost při léč2 bě cukrovky (diabetes mellitusj. Protože při postupech extrakce insulinu z pankreasové tkáně se extrahují rovněž podstatná množství jiných proteinů kromě insulinu, bylo vynaloženo mnoho úsilí na čištění insulinu, například tedy na nalezení postupů dělení insulinu od jiných proteinů. Některé z postupů čištěni insulinu jsou značně používány.Since its discovery in 1921, when insulin was found in the pancreas, insulin has been of paramount importance in the treatment of diabetes (diabetes mellitus). Since substantial amounts of non-insulin proteins are also extracted in pancreas tissue extraction procedures, Many efforts have been made to purify insulin, for example, to find methods for separating insulin from other proteins.

Jeden z těchto výrobně důležitých postupů, a to jeden z nejstarších, využívá obecného jevu, že rozpustnost proteinu je nejnižší v isoelektrickém bodě za dodržování dalších konstantních podmínek. V US patentu číslo 1 469 994 je popisován postup, vyznačující se tím, že se z vodného extraktu z pankreasu vysrážejí proteiny neinsuíinové povahy v odpovídajících isoelektrických bodech. Isoelektrické vysrážení insulinu z vodného extraktu pankreasu za hodnoty pH od asi 4 do asi 7 je popsáno v americkém patentovém spise číslo 1 520 673.One of these important manufacturing processes, one of the oldest, utilizes the general phenomenon that the solubility of the protein is lowest at the isoelectric point, while maintaining other constant conditions. U.S. Pat. No. 1,469,994 discloses a process characterized in that non-insulin-like proteins are precipitated from the aqueous pancreas extract at the corresponding isoelectric points. Isoelectric precipitation of insulin from an aqueous extract of the pancreas at a pH of from about 4 to about 7 is described in U.S. Patent 1,520,673.

Při jednom z původních někdejších postupů se provádí srážení insulinu přidáním dostatečného množství anorganické soli. V US patentu číslo 1 547 515 je popsán prvý způsob vysolení insulinu z rozpouštědla, použitého při reakci, a to. přidáním chloridu sodného. Diferenciální postup vysolování je popsán v US patentu číslo 2 449 076, a vyznačuje se vysolením insulinu přidánímIn one of the prior art processes, precipitation of insulin is accomplished by the addition of a sufficient amount of an inorganic salt. U.S. Pat. No. 1,547,515 discloses a first method of salting out insulin from a solvent used in a reaction. addition of sodium chloride. The differential salting out procedure is described in U.S. Patent No. 2,449,076, and is characterized by salting out insulin by adding

199 5 77 chloridu sodného k neutralisovanému extraktu s následující filtrací, novým rozpuštěním zbytku a opakovaným vysolením insulinu, ale za použití soli v nižší koncentraci, než jak to bylo použito v prvém stupni vysolení.199 5 77 sodium chloride to the neutralized extract, followed by filtration, redissolution of the residue and re-salting out of insulin, but using a salt at a lower concentration than that used in the first step of salting-out.

Třetí, provozně důležitý způsob čištění insulinu se týká vysrážení nebo krystalisace insulinu z roztoku komplexu insulinu se zinkem. Obecně se tento komplex vysráží z pufrovaného, vodného roztoku, obsahujícího zinečnaté ionty. Byly použity četné pufry, například podle US patentu číslo 2 626 228 se používá pufr, obsahující kyselinu citrónovou a její soli.A third, operationally important method of purifying insulin relates to the precipitation or crystallization of insulin from a solution of the zinc insulin complex. Generally, this complex precipitates from a buffered, aqueous solution containing zinc ions. Numerous buffers have been used, for example, according to U.S. Pat. No. 2,626,228 a buffer comprising citric acid and salts thereof is used.

Současně používané provozně způsobilé postupy čištění insulinu zahrnují typicky všechny tři výše zmíněné způsoby. Protože komplex insulinu se zinkem je nejdůležitější obchodní formou insulinu, týká se obvykle poslední stupeň čištění tohoto komplexu krystalizaci.The currently available operational purification procedures for insulin typically include all three of the above methods. Since the zinc-insulin complex is the most important commercial form of insulin, the last step of purification of the complex usually involves crystallization.

V posledních letech však bylo nalezeno, že proteiny nelrisulinové povahy, mezi nimiž obvykle převažují proinsulinové a jim podobné proteiny, tvoří menší složku obchodně používaného komplexu insulinu se zinkem. Ačkoliv tyto složky obvykle představují pod asi 8 °/o hmotnostních obchodně používaného komplexu insulinu se zinkem, má se za to, že některé z těchto složek mají antigenní nebo imunogenní vlastnosti, viz například Ghance a spol., Science 161, 165 (1968); Steiner a spol., Diabetes 18, 725 (1968); Bromer BioScience 20, 701 (1970) a Rubenstein a spol., Ann. Rev. Med. 22, 1 (1971).In recent years, however, it has been found that non-insulin-like proteins, predominantly predominantly proinsulin-like proteins, are a minor component of the commercially used zinc insulin complex. Although these components generally represent below about 8% by weight of the commercially available zinc insulin complex, some of these components are believed to have antigenic or immunogenic properties, see, for example, Ghance et al., Science 161, 165 (1968); Steiner et al., Diabetes 18, 725 (1968); Bromer BioScience 20, 701 (1970) and Rubenstein et al., Ann. Roar. Copper. 22, 1 (1971).

Stále trvajícím problémem je tedy odstranění proteinů neinsulinové povahy z insulinu za použití provozně a obchodně způsobilého postupu.Accordingly, an ongoing problem is the removal of non-insulin-like proteins from insulin using a commercially viable process.

Výraz „insulin”, jak je zde používán, zahrnuje nejen insulin jako takový, ale i proteiny, podobné insulinu, jako je'desamidoinsulin. Protože insulm a proteiny podobné nsulinu se vyznačují podobnou hypoglykemickou účinností, není obvykle třeba dělit insulih od jiných pankreatických proteinů, a není tedy třeba obvykle připravovat homogenní insulin.The term "insulin" as used herein includes not only insulin per se but also insulin-like proteins such as desamidoinsulin. Since insulin and insulin-like proteins exhibit similar hypoglycaemic activity, it is not usually necessary to separate the insulin from other pancreatic proteins and therefore it is not usually necessary to prepare homogeneous insulin.

Jsou známé postupy dělení biologicky účinných látek na analytickém podkladu, jako je elektroforesa a chromatografie na iontoměničích, a dají se takto oddělit neinsulinové složky od insulinových složek v obchodních (nebo i surových) přípravcích insulinu. Těmito postupy je i možno dělit insulinové složky na insulin jako takový a desamidoinsuliny. Tyto postupy mají však pochybnou použitelnost při použití ve velkoprovoze.Methods for separating biologically active substances on analytical substrates, such as electrophoresis and ion exchange chromatography, are known, and thus the non-insulin components can be separated from the insulin components in commercial (or even crude) insulin preparations. These methods can also separate insulin components into insulin per se and desamidoinsulins. However, these processes have dubious applicability in large-scale operations.

Postup, který se dá snáze přizpůsobit zpracovávání na veliko, je gelová filtrace (což je rovnocenný pojem výrazům gelová exklusní ehromatografie a gelová permeační chromatografie. Při tomto postupu se dělí proteiny na koloně, obsahující gel, který byl zesítěn takovým způsobem, že vzniknou póry v každé částečce gelu. Tyto póry se vyznačují stálým, měřitelným objemem, který je přímo úměrný stupni nabobtnání gelu a menší molekuly mají lepší přístup k těmto pórům než větší molekuly, je postup menších molekul kolonou ztížen ve srovnání s většími molekulami, majícími pouze částečný přístup, případně vůbec žádný přístup k pórům.A method that is easier to adapt to bulk processing is gel filtration (which is equivalent to the terms gel exclusive ehromatography and gel permeation chromatography), which separates proteins on a column containing a gel that has been cross-linked in such a way that pores form in the These pores are characterized by a constant, measurable volume that is proportional to the degree of swelling of the gel and smaller molecules have better access to these pores than larger molecules, making smaller molecules more difficult to pass through the column compared to larger molecules having only partial access, or no access to the leeks at all.

V uplynulé době byla již gelová filtrace použita k čištění insulinu; při isolování insulinu z pankreatů jednotlivých koček byl surový insulin získán extrakcí alkoholem za přítomnosti kyseliny s následujícím vysrážením neúčinných složek v alkalickém prostředí, dále se zahuštěním, vysrážením v isoelektrickém bodě a posléze s vysolením za použití srážení chloridem sodným. Surový insulin se potom využije k dělení na koloně s gelem zesítěného dextranu s následujícím eluováním 1,0 M roztokem kyseliny octové, viz Davoren, Biochim. Biophys. Acta 83, 150 (1962).Recently gel filtration has been used to purify insulin; In isolating insulin from pancreas of individual cats, crude insulin was obtained by extraction with alcohol in the presence of acid followed by precipitation of the inactive ingredients in an alkaline medium, followed by concentration, precipitation at the isoelectric point, and then salting out using sodium chloride precipitation. The crude insulin is then used for separation on a cross-linked dextran gel column followed by elution with a 1.0 M acetic acid solution, see Davoren, Biochim. Biophys. Acta 83,150 (1962).

Při isolování insulinu z ryb se homogenisují žlázy ve vodě, a proteiny se vysrážejí roztokem kyseliny trichloroctové. Sraženina se extrahuje ethanolem, obsahujícím kyselinu, a z extraktů se methylenchloridem odstraní lipidní složky. Zbývající pevné podíly se isolují, a po rozpuštění v 5,0 M roztoku kyseliny octové se roztok filtruje na koloně se zesítěným dextranem za použití 5,0 M roztoku kyseliny octové jako elučního rozpouštědla, viz Humbel, Biochem. Bjophys. Res. Communs, 12, 333 (1963). Uvádějí se výtěžky okolo 80 %. Je třeba poznamenat, že Humbel uvádí, že pro dobré dělení insulinů od dalších proteinů se mají volit podmínky při eluování, podporující disociacl molekul insulinu. Dále tvrdí Humbel, že 1,0 M roztok kyseliny octové není uspokojujícím rozpouštědlem, protože podle sdělení Yphantise a Waugha, viz Biochim. Biophys. Acta 26, 218 (1957), není tamže insulin dostatečně disoeiován.When fish insulin is isolated, the glands are homogenized in water, and the proteins are precipitated with a trichloroacetic acid solution. The precipitate is extracted with acid-containing ethanol and the lipid components are removed from the extracts with methylene chloride. The remaining solids were collected, and after dissolution in 5.0 M acetic acid solution, the solution was filtered on a cross-linked dextran column using a 5.0 M acetic acid solution as the elution solvent, see Humbel, Biochem. Bjophys. Res. Communs, 12, 333 (1963). Yields of about 80% are reported. It should be noted that Humbel states that for good separation of insulins from other proteins, elution conditions should be chosen to promote dissociation of insulin molecules. Humbel further claims that the 1.0 M acetic acid solution is not a satisfactory solvent because, according to Yphantis and Waugh, see Biochim. Biophys. Acta 26, 218 (1957), insulin is not sufficiently dissociated there.

Surový extrakt z pankreasu hovězího dobytka se filtruje na gelu zesítěného dextranu, jak to popisuje Epstein a spol., Biochemistry 2, 461 (1963). Jako eluční rozpouštědlo byl použit 0,2 M roztok hydrogenuhličitanu amonného, tedy rozpouštědlo, o kterém se již zmiňuje Humbel (citace výše). Epstein a spol. uvádějí výtěžek asi 60%.The crude bovine pancreas extract is filtered on a cross-linked dextran gel as described by Epstein et al., Biochemistry 2, 461 (1963). A 0.2 M ammonium bicarbonate solution, the solvent already mentioned by Humbel (cited above), was used as the eluting solvent. Epstein et al. reported a yield of about 60%.

Insulin byl isolován z pankreatu lidí; žlázy byly nejprve homogenisovány, a potom extrahovány, frakcionací síranem amonným byly odstraněny určité podíly inaktivních materiálů, insulin byl vysrážen, nejprve chloridem sodným, potom vysrážením v isoelektrickém bodě. Získaný insulin byl rozpuštěn v 0,5 N roztoku kyseliny octové, a roztok byl filtrován na gelu zesítěného dextranu. Filtrovaný insulin byl převeden na komplex insulinu se zinkem, viz Jackson a spol., Diabetes, 18, 206 (1969). Výtěžek insulinu po gelové filtraci činí asi 60 %.Insulin was isolated from human pancreas; the glands were first homogenized, and then extracted, by fractionation with ammonium sulfate, some of the inactive materials were removed, insulin was precipitated, first with sodium chloride, then by precipitation at the isoelectric point. The obtained insulin was dissolved in a 0.5 N acetic acid solution, and the solution was filtered on a cross-linked dextran gel. Filtered insulin was converted to a zinc-insulin complex, see Jackson et al., Diabetes, 18, 206 (1969). The yield of insulin after gel filtration is about 60%.

Posléze byl postup gelové filtrace a chromatografie na iontoměničích kombinován podle jihoafrického patentového spisu číslo 69/5280 (odpovídajícího belgickému patentu číslo 737 257], V jediném příkladu gelové filtrace (viz příklad 1) se filtruje komplex , insulinu se zinkem na koloně se zesítěným dextranem, a to za dosažení výtěžku 80 %. Jako roztok při eluování se použije 1,0 M roztok kyseliny octové. Je třeba poznamenat, že Schlichtkrull a spol., zjistili, že je třeba po filtrování provádět postup vysolení za dodržení isoelektrickéhovysrážení a krystalizace zinečnetého komplexu při isolování komplexu insulinu se zinkem.Subsequently, the gel filtration and ion exchange chromatography procedure was combined according to South African Patent No. 69/5280 (corresponding to Belgian Patent No. 737,257). In one example of gel filtration (see Example 1), the zinc insulin complex on a cross-linked dextran column was filtered. A 1.0 M acetic acid solution was used as the elution solution It should be noted that Schlichtkrull et al. found that after filtering a salting-out procedure was carried out while maintaining the isoelectric precipitation and crystallization of the zinc complex in the isolating the insulin-zinc complex.

Při každém z předchozích postupů gelové filtrace pří čištění insulinu byla zaznamenána podstatná ztráta insulinu. Dále pak podle předchozích postupů zde není spolehlivý odkaz na to, že lze získat pouze insulin (počítaje v to proteiny, podobné insulinu, jak je o nich výše řeč J v důsledku použití gelové filtrace.In each of the previous gel filtration procedures for insulin purification, significant insulin loss was noted. Furthermore, according to the foregoing procedures, there is no reliable reference to the fact that only insulin can be obtained (including insulin-like proteins as discussed above due to the use of gel filtration).

Obecně řečeno, může se použít jakýkoli gel, bobtnatelný vodou, to za použití roztoků proteinů a postupu podle tohoto vynálezu. Avšak takový gel se má vyznačovat za sucha, nebo v nenabobtnalém stavu schopností poutat vodu v množství nejméně hmotnostně 4 %, přepočteno na hmotnost suchého gelu, jakož i částečkami o průměru pod asi 100 mikronů. S výhodou ěiní schopnost gelu poutat vodu od asi 4 do asi 98 °/o, a nejvýhodněji od asi 5 do asi 20 %. S výhodou mají být průměry suchých, částeček gelu menší než asi 80 mikronů a zvláště výhodné rozmezí průměru částeček činí od asi 20 do asi 80 mikronů.In general, any water swellable gel can be used using the protein solutions and process of the invention. However, such a gel should be characterized by dry or non-swollen water-binding properties in an amount of at least 4% by weight, calculated on the weight of the dry gel, as well as particles with a diameter below about 100 microns. Preferably, the gel has a water-binding capacity of from about 4 to about 98%, and most preferably from about 5 to about 20%. Preferably, the diameters of the dry, gel particles should be less than about 80 microns, and a particularly preferred particle diameter range is from about 20 to about 80 microns.

Jako příklady vhodných gelů lze uvést mezi četnými jinými (počítaje v to kukuřičný škrob) zesítěný galaktomannan, zesítěný dextran, agar nebo agarosu, polyakrylamidy, kopolymery akrylamidu a methylen-bis-akrylamidu, kopolymery mB.thylen-bis-akrylamidu s vinylethylkarhinolem a s vinylpyrrolidonem, a podobně. Výhodnými gely jsou zesítěné dextrany, jako je sefadex.Examples of suitable gels include numerous other (including corn starch), cross-linked galactomannan, cross-linked dextran, agar or agarose, polyacrylamides, acrylamide-methylene-bis-acrylamide copolymers, copolymers of mB. etc. Preferred gels are cross-linked dextrans, such as sefadex.

Typ kolony, použité při postupu podle tohoto vynálezu, nemá rozhodující význam. Volba výšky kolony, průměr kolony, nebo její tvar je vždy závislý na žádoucích parametrech postupu. Je jasné, že jak se výška kolony zvyšuje, snižuje se průtoková rychlost, či jinak řečeno, zpětný tlak je přímo úměrný výšce kolony. Z těchže důvodů je sestava patrové kolony pokládána za výhodnou, například v úpravě, jako je „Pharmacia Sectional Column KS-370”. Pro účely normální produkce slouží dobře patro se šesti sekcemi.The type of column used in the process of this invention is not critical. The choice of column height, column diameter or shape is always dependent on the desired process parameters. It is clear that as the column height increases, the flow rate decreases, or in other words, the back pressure is proportional to the column height. For the same reasons, the tray column assembly is considered advantageous, for example, in a treatment such as "Pharmacia Sectional Column KS-370". For the purposes of normal production, the six-section floor serves well.

Například lze uvést vyhovující dělení a čištění insulinu na koloně s možným zatížením asi 4,5 g soli insulinu s alkalickým kovem nebo amonné soli insulinu na litr lože kolony, což je rozmezí nejvýhodnější. Avšak zatížení kolony může obvykle kolísat od asi 0,8 do asi 6,7 g na litr lože kolony, přičemž výhodným rozmezím je rozsah od asi 3,5 do asi 5,0 g na litr lože kolony. Pochopitelně lze stanovit optimální podmínky velmi snadno pokusně pro každou kolonu.For example, satisfactory separation and purification of the insulin on a column with a possible load of about 4.5 g of the alkali metal insulin salt or the ammonium insulin salt per liter of bed of the column may be mentioned, which is the most preferred range. However, column loading can typically vary from about 0.8 to about 6.7 g per liter of column bed, with a preferred range being from about 3.5 to about 5.0 g per liter of column bed. Of course, optimal conditions can be determined very experimentally for each column.

Gel je možno bobtnat, nebo je možno plnit kolonu nabobtnalým gelem jakýmkoli možným postupem, jak jsou známé odborníkům na tomto úseku. Obecně se gel bobtná elučním prostředím. Jinak je možno bobtnat gel 30% vodným ethanolem, přičemž se jemné podíly dekantují, a bobtnací prostředí se nahradí elučním prostředím.The gel can be swelled, or the column can be filled with swollen gel by any method known to those skilled in the art. Generally, the gel swells by the elution medium. Alternatively, the gel can be swelled with 30% aqueous ethanol, the fine fractions being decanted, and the swelling medium replaced with an eluting medium.

Obecně <se sůl insulinu a alkalického kovu, nebo amonná sůl insulinu rozpustí v destilované vodě, a hodnota pH se upraví jak je to žádoucí zředěným roztokem báze nebo zředěným roztokem organického pufru. Jako vhodné báze lze uvést hydroxid sodný, hydroxid draselný, hydroxid lithný, vodný roztok amoniaku a podobně. Jako výhodnou sloučeninu lze uvést hydroxid sodný. Co příklad vhodpého organického pufru lze uvést kombinaci glycinu a hydroxidu sodného, tris-(hydroxymethyljaminomethan, a podobně.Generally, the alkali metal salt of insulin or the ammonium salt of insulin is dissolved in distilled water, and the pH is adjusted as desired with a dilute base solution or a dilute organic buffer solution. Suitable bases include sodium hydroxide, potassium hydroxide, lithium hydroxide, aqueous ammonia solution and the like. A preferred compound is sodium hydroxide. An example of a suitable organic buffer is a combination of glycine and sodium hydroxide, tris (hydroxymethyl) aminomethane, and the like.

Obecně řečeno, může se sůl Insulinu a alkalického kovu nebo amonná sůl insulinu připravovat známými postupy. Je však výhodné připravovat sůl insulinu a alkalického kovu, nebo amonnou sůl insulinu postupem podle US patentu číslo 3 719 655. Jak to zde již bylo uvedeno, má mít řečený insulin čistotu nejméně asi 80 %, což znamená, že. obsah, insulinu, počítaje v to proteiny, podobné insulinu, vyznačující, se glykemickou aktivitou, má činit nejméně asi 80 %, přepočteno na veškeré přítomné proteiny.In general, the alkali metal salt of Insulin and the ammonium salt of insulin can be prepared by known methods. However, it is preferable to prepare an alkali metal salt of insulin or an ammonium salt of insulin according to the method of U.S. Pat. No. 3,719,655. As mentioned hereinbefore, said insulin should have a purity of at least about 80%, which means that. the insulin content, including insulin-like proteins, characterized by glycemic activity, should be at least about 80%, calculated on all proteins present.

Koncentrace soli insulinu a alkalického kovu, či amonné soli insulinu v roztoku, použitém na té či oné koloně, činí, jak je to uvedeno výše, od asi 1 do asi 8 %,. uvedeno jako hmotnost na objem. Výhodnou koncentrací je rozsah od asi 4 do asi 6 .%.The concentration of the insulin-alkali metal salt or the ammonium insulin salt in the solution used on one or the other column is, as mentioned above, from about 1 to about 8%. given as weight per volume. A preferred concentration is in the range of about 4 to about 6%.

Pro uspokojivé výsledky se má sůl insulinu a alkalického kovu nebo amonná sůl insulinu rozpustit v Objemu rozpouštědla, který je nižší než objem, použitý při dělení, jak je o tom výše řeč.For satisfactory results, the alkali metal salt of insulin or the ammonium salt of insulin should be dissolved in a volume of solvent that is less than the volume used in the separation, as discussed above.

Při chromatografování je distribuční koeficient K_d definován jako poměr koncentrace rozpuštěné složky v pohyblivé fázi ke koncentraci rozpuštěné složky ve stacionární fázi. Při gelové filtraci je pohyblivá fáze definována jako rozpouštědlo, pohybující se ve volném prostoru mezi částečkami gelu, a stacionární fázi je rozpouštědlo, jímž jsou zaplněny částečky gelu, tj. podíl rozpouštědla, uzavřeného v pórech každé z částeček gelu. Takže K_d značí onu frakci zachyceného rozpouštědla, jež obsahuje rozpuštěnou složku.In chromatography, the distribution coefficient K _{d is} defined as the ratio of the concentration of the dissolved component in the mobile phase to the concentration of the dissolved component in the stationary phase. In gel filtration, the mobile phase is defined as the solvent moving in the free space between the gel particles, and the stationary phase is the solvent by which the gel particles are filled, i.e. the proportion of solvent enclosed in the pores of each of the gel particles. Thus, K _d denotes the fraction of entrapped solvent which contains the dissolved component.

Za použití elučního objemu K_d lze podíl V_e rozpuštěné složky vyjádřit rovnicí:Using the elution volume K _d , the fraction V _{e of the} dissolved component can be expressed by the equation:

' V_e = V₀ + K_d. Vi kde V_o je objem kolony a V_; je objem zadr199577 ženého rozpouštědla. Řešením pro K_d se dá rovníce upravit na'V _e = V ₀ + K _d . Vi where V _o is the column volume and V _; is the volume of solvent retained. The solution for K _d can be adjusted to

Jestliže se hustota vody pokládá za rovnou 1, pak Ví = a . W_r, kde a je výška suchého gelu a W_r je podíl zadržené vody. Takže K_d činí což mohou odborníci na tomto úseku stanovit experimentálně.If the water density is assumed to be equal to 1, then V 1 = a. W _r , where a is the height of the dry gel and W _r is the fraction of water retained. Thus, K _d does, which can be determined experimentally by those skilled in the art.

Za předpokladu, že roztok obsahuje 2 rozpuštěné složky, lze elučni objem pro každou složku vyjádřit takto:Assuming that the solution contains 2 dissolved components, the elution volume for each component can be expressed as follows:

V’_e = V_o + K_d’Vj V”_e = V„ + K_d”ViV ' _e = V _o + K _d ' Vj V ' _e = V' + K _d 'Vi

Dělící objem, V_s, je rozdíl mezi elučními objemy obou dvou rozpuštěných složek:Partition volume, V _s , is the difference between the elution volumes of the two dissolved components:

V_s = V_e” - V’_e V _s = V _e ”- V ' _e

V_s = (K_d - KďjViV _s = (K _d - K djVi

Z předchozího je zjevné, že stupeň dělení dvou (či více) složek je z části závislý na zatížení kolony. Jak se množství rozpuštěných složek o nižší molekulové hmotnosti blíží limitu dostupných pórů, musí nutně dojít ke snížení dělení mezi dvěma rozpuštěnými složkami. Mezi limitními hodnotami zatížení, jak jsou specifikovány jako část tohoto vynálezu, může stupeň zatížení kolísat. V některých případech se může volit vyšší zatížení kolony k vyvážení dělení proti produktivitě.It is apparent from the foregoing that the degree of separation of the two (or more) components depends in part on the column load. As the amount of lower molecular weight dissolved components approaches the limit of available pores, the separation between the two dissolved components must necessarily be reduced. Between the load limit values as specified as part of the present invention, the degree of load may vary. In some cases, a higher column load may be chosen to balance partitioning against productivity.

Jak to zde již bylo uvedeno výše, může mlt elučni prostředí hodnotu pH v rozmezí od asi 7,5 do asi 9,5. Obvykle se jako eluční prostředí používá vodný roztok stejné báze nebo pufru, jak byl použit při přípravě roztoku insulinu.As mentioned hereinabove, the elution medium may have a pH in the range of about 7.5 to about 9.5. Typically, an aqueous solution of the same base or buffer as used in the preparation of the insulin solution is used as the eluent.

Je-li to žádoucí, může elučni prostředí obsahovat až do asi 0,02 molů anorganické soli na litr, tedy například chloridu sodného, draselného, amonného a podobně. Za výhodnou koncentraci lze pokládat 0,01 M, a za výhodnou sůl je třeba pokládat chlorid sodný. Použití takové soli je výhodné pro zlepšení dělení, přičemž je znemožněno navíc adsorbování bazických látek na gelu.If desired, the elution medium may contain up to about 0.02 moles of inorganic salt per liter, e.g. sodium, potassium, ammonium chloride and the like. A preferred concentration is 0.01 M, and a preferred salt is sodium chloride. The use of such a salt is advantageous for improving the separation, while it is also impossible to adsorb the basic substances on the gel.

Eluování kolony se dá provádět za teplot v rozmezí od asi 5 do 30 °C. S výhodou se postup provádí za teploty od 20 °C níže.Elution of the column can be carried out at temperatures ranging from about 5 to 30 ° C. Preferably, the process is carried out at a temperature of from 20 ° C below.

Eluování se provádí jakýmkoli běžným postupem, a jako zvláště použitelný postup lze uvést měření ultrafialové absorpce při 280 nm u každé frakce. Ty frakce, které obsahují podle zjištění jako složku vyčištěný in8 sulin, se spojují a obvykle se převedou na komplex Insulinu se zinkem.Elution is accomplished by any conventional method, and a particularly useful method is the measurement of ultraviolet absorption at 280 nm for each fraction. Those fractions that contain purified inulin sulin as a component are found to be pooled and usually converted to insulin-zinc complex.

Jak to zde již bylo výše uvedeno, je komplex insulinu se zinkem nejdůležitější formou insulinu. V důsledku toho se sůl insulinu s alkalickým kovem nebo amonná sůl insulinu o vysoké čistotě, jak se získá postupem podle tohoto vynálezu, převádí na komplex insulinu se zinkem. Konverse na komplex insulinu se zinkem se s výhodou provádí za hodnoty pH 6,0 za přítomnosti octanu amonného jako pufru. Není třeba isolovat sůl insulinu s alkalickým kovem nebo amonnou sůl insulinu z elučního prostředí, nebo koncentrovat roztok vyčištěného insulinu před krystalizaci se zinkem. Výhodou postupu podle tohoto vynálezu je to, že roztok insulinu, jak se eluuje, je dostatečně koncentrovaný takže vysolení nebo elektrické vysrážení není nutné, ačkoli se takové postupy mohou provádět, je-li to třeba.As mentioned hereinbefore, the zinc-insulin complex is the most important form of insulin. As a result, the alkali metal salt of insulin or the high purity ammonium salt of insulin obtained by the process of the present invention is converted to a zinc-insulin complex. Conversion to the zinc insulin complex is preferably carried out at pH 6.0 in the presence of ammonium acetate buffer. There is no need to isolate the alkali metal or insulin ammonium salt from the eluent, or concentrate the purified insulin solution prior to crystallization with zinc. An advantage of the process of the present invention is that the insulin solution as it elutes is sufficiently concentrated so that salting out or electrical precipitation is not necessary, although such processes may be performed if necessary.

Zinečnatý komplex insulinu, takto získaný, se vyznačuje lepší čistotou v důsledku použití tohoto postupu. Zvýšenou čistotu lze dokázat několika způsoby. Komplex insulinu se zinkem lze analyzovat přímo se zřetelem na zjištění neínsulinových proteinových složek, jako je prolnsulin a glukagon. Přítomnost proteinů o vysoké molekulové hmotnosti a tam patří jako typický příklad proteminása, tedy proteolytický enzym, se dá stanovit měřením stálosti protaminové suspense insulinu za zvýšených teplot. Za přítomnosti protaminasy se komplex insulinu s protamlnem disociuje v důsledku degradace protaminu. Lze měřit fyzikální vlastnosti, jako je rozpustnost komplexu Insulinu se zinkem za neutrálního pH a barva vzniklého roztoku. Posléze je možno měřit specifickou účinnost Insulinu biologickými a imunologickými testy.The zinc insulin complex thus obtained is characterized by better purity due to the use of this process. Increased purity can be demonstrated in several ways. The zinc insulin complex can be analyzed directly for non-insulin protein components such as prolnsulin and glucagon. The presence of high molecular weight proteins and, as a typical example, a proteminase, a proteolytic enzyme, can be determined by measuring the stability of the protamine insulin suspension at elevated temperatures. In the presence of protaminase, the insulin-protamine complex dissociates due to protamine degradation. Physical properties such as the solubility of the insulin-zinc complex at neutral pH and the color of the resulting solution can be measured. The specific activity of Insulin can then be measured by biological and immunoassays.

V důsledku vyšší čistoty je komplex insulinu se zinkem, získaný provedením postupu podle tohoto vynálezu, vhodným materiálem pro úpravu do různých farmaceutických přípravků insulinu, např. insulinu co takového, isofán-insulinu, protaminového komplexu insulinu se zinkem, suspense komplexu insulinu se zinkem, globin-insulinu a podobně. Dále pak dovoluje čistší forma komplexu insulinu se zinkem přípravu neutrálního insulinu, který je stálejší ve srovnání s kyselou formou insulinu; nečistoty, které přítomné v komplexu insulinu se zinkem, se často částečně vysrážejí za neutrální hodnoty pH. Takové nečistoty by často obsahovaly enzymy, odbourávající insulin, jako je trypsin a chymoprypsin, snižující účinnost insulinových přípravků. Čistší komplex insulinu se zinkem rovněž dovoluje výrobu přípravků insulinu z prasat nebo hovězího dobytka s prodlouženým účinkem, aniž by bylo třeba provádět další čistění, jak to bylo třeba v minulé době. Posléze vyžaduje příprava isofan-insulinu s čistších komplexů insulinu se zinkem méně protaminu, protože bez přítomnosti nečistot povahy kyselých proteinů je možno použití jen takového množství protaminu, jehož je třeba k vysrážení insulinu.Due to the higher purity, the zinc insulin complex obtained by carrying out the process of the present invention is a suitable material for formulation into various pharmaceutical insulin preparations, such as insulin per se, isophane-insulin, protamine insulin zinc complex, insulin zinc complex suspension, globin insulin and the like. Furthermore, the purer form of the zinc-insulin complex allows the preparation of a neutral insulin that is more stable than the acidic form of insulin; impurities present in the zinc-insulin complex are often partially precipitated at neutral pH values. Such impurities would often contain insulin-degrading enzymes such as trypsin and chymoprypsin, reducing the effectiveness of insulin preparations. The purer insulin-zinc complex also allows the production of insulin preparations from pigs or cattle with extended action without the need for further purification, as has been the case in the past. Thereafter, the preparation of isophane-insulin with purer zinc-insulin complexes requires less protamine, since in the absence of acidic protein impurities, only the amount of protamine required to precipitate insulin can be used.

Postup podle tohoto vynálezu lze kombinovat, jak je to třeba, s dalšími postupy čištění, například lze roztok insulinu s alkalickým kovem, nebo amonné soli insulinu filtrovat jednou či vícekfáte před prováděním vlastní gelové filtrace. Rovněž je možno filtrovat eluovaný insulin jednou či vícekráte dříve, než se převádí na komplex insulinu se zinkem.The process of the present invention may be combined, as desired, with other purification procedures, for example, the alkali metal insulin solution or the insulin ammonium salt may be filtered one or more times prior to the actual gel filtration. It is also possible to filter the eluted insulin one or more times before it is converted to the insulin-zinc complex.

Příklad 1Example 1

5,53 g sodné soli insulinu z hovězího dobytka o účinnosti 26,4 jednotek na mg s obsahem 7,2 % hmotnostních proinsulinu se suspenduje v destilované vodě. Přidá se zředěný roztok hydroxidu sodného až k pH 9,0. Objem vzniklého roztoku činí 100 ml, načež se použije gel zesítěného dextránu, vyznačující se schopností přijímat 5 % vody, a velikostí částeček od 20 až do 80, upravených do rovnovážného stavu ve vodném roztoku hydroxidu sodného o pH 9,0. Nabobtnalý gel se použije jako náplň kolony rozměrů 4,0 na 43,0 cm s objemů 540 ml. Alikvotní část 40 ml roztoku insulinu se nanese na kolonu, načež se kolona eluuje vodným roztokem hydroxidu sodného o pH 9,0, přičemž se jímají frakce o objemu 6,5 ml. Eluování se provede měřením ultrafialové absorpce při 280 μτη. Frakce, odpovídající insulinové složce, se spojí, a okyselí se na pH 3,0 přidáním 6 N roztoku kyseliny chlorovodíkové. Vzniklý roztok se filtruje, přidá se chlorid zinečnatý, a komplex insulinu se zinkem se isoluje za pH 6,0 z pufru octanu amonného. Výtěžek komplexu insulinu se zinkem činí 1,83 g, což odpovídá výtěžku 82,5 %, přepočteno na výchozí složku. Insulin se vyznačuje účinností 26,8 jednotek/mg, a obsahem proinsulinu hmotnostně pod asi 0,05 %; přepočteno na jednotky činí výtěžek 83,8 °/o.5.53 g of bovine insulin insulin of 26.4 units per mg containing 7.2% by weight of proinsulin are suspended in distilled water. Dilute sodium hydroxide solution was added to pH 9.0. The volume of the resulting solution is 100 ml, followed by a cross-linked dextran gel, which is capable of receiving 5% water and a particle size of 20 to 80, equilibrated in aqueous sodium hydroxide solution at pH 9.0. The swollen gel was used as a packed column of 4.0 x 43.0 cm with 540 ml. An aliquot of 40 ml of the insulin solution is loaded onto the column, then the column is eluted with an aqueous sodium hydroxide solution of pH 9.0, collecting 6.5 ml fractions. Elution is performed by measuring ultraviolet absorption at 280 μτη. The fractions corresponding to the insulin component were combined and acidified to pH 3.0 by addition of 6 N hydrochloric acid solution. The resulting solution was filtered, zinc chloride was added, and the zinc insulin complex was isolated at pH 6.0 from ammonium acetate buffer. The yield of the zinc-insulin complex was 1.83 g, which corresponds to a yield of 82.5% based on the starting material. Insulin is characterized by an efficacy of 26.8 units / mg, and a proinsulin content below about 0.05% by weight; calculated in units, the yield is 83.8%.

Podíl 37,5 ml původního roztoku insulinu se převede přímo, jak je to výše popsáno, na komplex insulinu se zinkem, a to bez stupně gelové filtrace. Výtěžek činí 1,87 g, tj. 90,1% komplexu insulinu se zinkem s obsahem proinsulinu 5,4 % hmot.A portion of 37.5 ml of the original insulin solution was converted directly as described above into a zinc-insulin complex without a gel filtration step. The yield is 1.87 g, i.e. 90.1% zinc-insulin-containing complex with 5.4% proinsulin.

Claims

CLAIMS 1. A process for purifying insulin in the form of an alkali metal salt or ammonium salt, characterized in that a swollen gel capable of receiving in the dry state 4 to 98% by weight of water having particles of 20 to 80 microns in diameter is packed with a swollen gel. which comprises injecting an aqueous solution of an alkali metal salt of insulin and an ammonium salt of at least 80% purity, wherein the insulin concentration is in the range of 1 to 8% (w / v) and the total amount of insulin sufficient to support the column from 0.8 to 6.7 g per liter of packed column volume, with the pH of the solution ranging from 7.5 to 9.5, then eluting the insulin from the adsorbent at a temperature in the range of 5 to 30 ° C with aqueous solution containing up to 0.02 M inorganic salt at the same pH as the original insulin solution.

YNALEZU

2. The method of claim 1, wherein said gel is a cross-linked dextran capable of receiving from about 5% to about 20% by weight of water.

Method according to claim 1, characterized in that the loading of the column is from 3.5 to 5.0 g per liter of volume of the packed bed in the column, preferably 4.5 g per liter of bed in the column.

4. The method of claim 1, wherein a solution of inorganic salt of 0.01 M is used.

5. The process according to claim 4, wherein the inorganic salt is sodium chloride.

6. The method of claim 1, wherein the elution is carried out at room temperature.