JPH08509605A - コラゲナーゼを精製する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 粗コラゲナーゼを精製する方法が開示されている。本コラゲナーゼ精製法には、コラゲナーゼ、顔料、毒素、細菌性物質及び、クロストリパイン、トリプシン及びカゼイナーゼを含む蛋白質分解酵素不純物を含有する粗コラゲナーゼ溶液を提供することが含まれる。安定化コラゲナーゼ溶液をヒドロキシアパタイト充填物質に入れる。顔料及びカゼイナーゼを、約0.05Ｍ乃至約0.3Ｍの燐酸塩緩衝液を含む第一溶液で溶離し、次に、コラゲナーゼ、トリプシン及びクロストリパインを、約0.35Ｍ乃至約0.5Ｍの燐酸塩緩衝液で溶離し、第一回収溶液を提供する。次に、第一回収溶液をゲル濾過充填物質に入れ、中性のｐＨ緩衝溶液でコラゲナーゼ及びクロストリパインを溶離し、第二回収溶液を提供する。次にその第二回収溶液をリアクティブ・レッド・120-アガロース充填物質に入れ、中性ｐＨ緩衝溶液でコラゲナーゼを溶離し、精製コラゲナーゼを提供する。その方法は、溶離溶液の消費を低減させ、予測できないグラジエント溶離技術を回避して、極めて純粋なコラゲナーゼを高収率で提供する。

Description

【発明の詳細な説明】 コラゲナーゼを精製する方法１．発明の背景 本発明は、一般的に、精製された酵素及び、精製された酵素を生成する改良さ れた方法に関する。より特定すると、本発明は、蛋白質分解酵素、コラゲナーゼ 及び、より迅速で、より高収率の精製酵素を提供し、そしてもとのコラゲナーゼ 異性体分布を保持するコラゲナーゼ精製法に向けられている。２．関連技術の記載 蛋白質分解酵素は種々の実験室用及び治療用の用途に広範に用いられている。 典型的には、それらの用途は、細胞解離及び、結合組織網状組織を加水分解によ り分解するか又はゆるめる蛋白質分解酵素の能力により利益が得られる関連する 治療法に関与する。例えば、クロストリジウム・ヒストリチカム（Clostridium histolyticum ）から誘導される細菌由来のコラゲナーゼは、実験室における組織 培養用途において細胞を分散させるのに用いられている。その他に、コラゲナー ゼは、ランゲルハンス島及び種々の分散された腫瘍細胞を単離することに関連す るもののような細胞単離法に用途が示されてきた。コラゲナーゼに関する他の用 途は、コラゲナーゼ組成物をやけど又は潰瘍の治療及び創傷治療に用いる治療用 途における局所使用に関与する。コラゲナーゼは、ペイロニ病の治療及び、保持 された寒冷腐肉（retained cryoslough）の除去のための寒冷前立線切除の補助 として、椎間板溶解及び眼の手術における使用が含まれる。 最近、クロストリジウム・ヒストリチカムから誘導された細菌由来のコラゲナ ーゼには脂肪組織に埋め込まれた微小血管細胞の解離及び単離に関与する方法に おける用途が見出だされた。それらの方法は、一般的に、吸脂（liposuctioned ）脂肪のような微小血管を埋め込んでいる脂肪組織を、コラゲナーゼに結合組織 を崩壊させそして消化させる条件下でコラゲナーゼと化合させることに関与する 。一般的に、その崩壊法は、吸脂された組織において微小血管細胞の膜を傷付け たりせず、消化された組織から細胞を注意深く分離することにより、生存能力の あ る微小血管細胞を回収する。 それらの生存能力のある完全な微小血管細胞には特に、血管に取って変わるた めにヒト及び動物に埋め込まれた合成の小直径の血管移植片の内部における被覆 としての用途が見出だされた。同様に、微小血管細胞は、生物医学的イショク組 織片手段に改良された生物的適合性を与える、移植組織片手段の表面における沈 積物として一般的にに有用である。明らかに、微小血管細胞は、外部物質が血管 及び組織に接触して置かれるときに起こることが知られている、移植組織におけ る蛋白質沈積物及び関連細胞沈積物の防止に寄与するようである。血管移植片の 場合に、それらの沈積物は迅速に血管を閉塞させ、移植片の機能不全をもたらす 。 結合組織を消化するための粗コラゲナーゼの市販の供給源の使用に関連する１ つの問題は、前記組織が消化又は加水分解する程度が予測できないことである。 さらに、組織消化中に及び粗コラゲナーゼを用いる単離操作中に単離される細胞 は、質において劣っており、そして生存度及び効力は低い。生存能力のある細胞 がうまく単離されたとしても、収率及び生存度は予測できない。 その操作の予測不可能な特性は、粗コラゲナーゼの市販の供給源に固有なロッ トの変動による。天然の細菌から誘導されたコラゲナーゼは、そのコラーゲンに 特異的な加水分解活性そして他のプロテアーゼ及び毒素を含む不純物の量及び性 質において広範に異なる。ほとんどの市販のコラゲナーゼは、クロスチリジウム ヒストリティカム（Clostridium hitolyticum）から誘導され、その粗形態は、 加水分解活性及び純度において広範に異なっている。制御できない量の、粗コラ ゲナーゼにおいて見出だされる不純物には、汚染細菌物質、顔料、クロストリパ イン、トリプシン及びカゼイナーゼを含むプロテアーゼ及びペプチダーゼが含ま れる。 望ましくないことに、プロテアーゼ不純物は、一般的に蛋白質で活性であり、 コラゲナーゼと反応し、粗コラゲナーゼに触媒劣化をもたらしてしまう。さらに 、粗コラゲナーゼに関連する毒素不純物は、生体内及び試験管内用途の両方に関 与する操作に深刻な問題となり得る。その他に、種々の量の細菌性ＤＮＡが存在 し得て、単離した細胞又は組織消化法が生体内用途に関与する場合にその細菌性 ＤＮＡは潜在的に免疫原性又は腫瘍形成の問題を生じ得る。粗コラゲナーゼに見 出だされる蛋白質不純物は、患者に投与した場合にアナフィラキシーショックを もたらし得る感作抗原として作用し得る。 従って、毒素と同様に、蛋白質分解活性及び非反応性化合物のホストを含有す る粗コラゲナーゼ組成物の種々の予測できない性質を考慮すると、粗コラゲナー ゼを用いる治療的組織消化法及び細胞解離技術は信頼しえない。従って、効率よ く、有効にコラゲナーゼを単離し精製する操作が開発され、不純物がほとんどな い又は制御された量の不純物しか有しない活性なコラゲナーゼを予測できる程度 に供給してきた。ほとんどのコラゲナーゼ精製法は、粗コラゲナーゼの汚染プロ テアーゼ及び非反応性成分のクロマトグラフィーによる分離に関与している。 １つのコラゲナーゼ精製法では、特に、それにより提供される高純度のコラゲ ナーゼに対する認識を得ている。この方法は、ボンド（Bond）らによる“Purifi cation and Separation of Indivisual Collagenases of Clostridium histolyt icum Using Red Dye Ligand Chromatography”、23巻、13号、3077-3091頁（198 4年）に記載されており、その方法は、種々のタイプの吸収剤及びゲルによるク ロマトグラフィー分離に関し、顔料及び汚染プロテアーゼを除去する。この方法 に関連する重要な欠点は、時間がかかる工程及びグラジエント溶離操作である。 特にグラジエント溶離操作は、多量の溶媒を必要とし、各精製操作を再現するこ とが困難である。加えて、その方法は、時間を消費する再充填操作を頻繁に必要 とし、価値を有する作用物質の損失を招く、亀裂の入ったクロマトグラフィーカ ラム充填物質に煩わされる。結局、従来技術の方法では、細菌性汚染物質及び、 生体内に痕跡量ほどの粗コラゲナーゼが投与されたとしてもアナフィラキシーシ ョックを起こす多くの関連感作抗原及び毒素を有効に除去できない。 従って、本発明の目的は、再現可能なそして予測可能な方法で結合組織を消化 することができる純粋なコラゲナーゼを再現可能性を有して供給する、粗コラゲ ナーゼを精製する方法を提供することである。 本発明の他の目的は、低減された量の溶離溶媒を用い、低減された時間で純粋 な酵素を提供する、コラゲナーゼ精製法を提供することである。 本発明の他の目的は、クロマトグラフィーカラム充填物質に亀裂が入るのを防 ぐ、コラゲナーゼ精製法を提供し、頻繁なる再充填の必要性を減らすことである 。 又、本発明の他の目的は、細菌性汚染物質及び細菌性汚染物質に関連する毒素 を除去するコラゲナーゼ精製法を提供することである。発明の概要 本発明は、実質的に溶離溶媒の消費量を低減させて、純粋なコラゲナーゼを高 収率で、再現可能に生成する改良された効率により特徴付けられるクロマトグラ フィー精製法を提供することにより上記の目的を達成する。得られた純粋なコラ ゲナーゼは、種々の治療的及び実験室の用途において、再現性及び信頼性を有し て組織消化及び埋め込まれた細胞の単離に寄与する。本発明により精製されたコ ラゲナーゼは、毒素及び公知でない非反応性の蛋白質性成分含まず、従って、そ の精製されたコラゲナーゼは生体内使用に安全である。本発明の方法は有効に、 コラゲナーゼを劣化してしまう、非コラーゲンに活性なプロテアーゼを除去する ので、得られた純粋なコラゲナーゼは、触媒劣化特性がかなり低減される。その 結果、精製されたコラゲナーゼは改良された長期安定性を有し、溶液中で保存さ れたときでさえ、高レベルの酵素活性を保持する。 費用がかかり、時間を消費し、困難な溶媒グラジエント溶離技術に依存する従 来技術法とは異なり、本発明の方法は、単一のイオン強度の溶離溶液を用いて回 分工程で粗コラゲナーゼ調製物質をクロマトグラフィー分離することに関する。 加えて、本発明は、充填物質の物理的結合性及び機能的寿命を安定にし増大する クロマトグラフィー溶離溶液を用いる。従って、本発明の実施により、本質的に 純粋なコラゲナーゼを高収率で、かなり低減された時間と低減された物質コスト で、より再現性がある方法で提供する。 より特定すると、本発明の例示的な方法には、コラゲナーゼ、顔料、毒素、細 菌性物質及び、クロストリパイン及びトリプシンを含む蛋白質分解酵素不純物を 含有する、安定化粗コラゲナーゼを供給する工程、安定化粗コラゲナーゼ溶液を ヒドロキシアパタイト充填物質を含有するカラムに入れ、約0.05モル乃至約0.3 モルの燐酸カリウム及び非イオン性界面活性剤を含む第一の溶液でカラムから顔 料を溶離する工程が含まれる。顔料の実質的部分がヒドロキシアパタイト充填物 質から溶離されるまで、溶離を続ける。次に、約0.35モル乃至約0.5モルの燐酸 塩緩衝液及び非イオン性界面活性剤を含む第二の溶液でヒドロキシアパタイト充 填物質からコラゲナーゼ及び蛋白質分解酵素不純物を溶離し、コラゲナーゼと蛋 白質分解酵素不純物を含む第一の回収された溶液を供給する。 次に、その第一回収溶液を、ゲル濾過充填物質を含有するカラムに入れそのカ ラムを、N-［トリス（ヒドロキシメチル］-メチル］グリシン（トリシン）、CaC l₂及びNaClを含み、ｐＨ7.5に緩衝された第三の溶液で溶離し、クロストリパイ ンとコラゲナーゼを含む第二の回収溶液を供給する。 次に第二の回収された溶液を、リアクティブ・レッド・120-アガロース（Reac tive Red 120-Agarose）充填物質を含有するカラムに入れ、トリシン、CaCl₂及 びNaClを含み、ｐＨ7.5に緩衝された第四の溶液で溶離し、精製されたコラゲナ ーゼを本質的に含む、第三の回収溶液を提供する。 本発明により、各々の溶離工程は、カラムクロマトグラフィー技術及び装置を 用いて行われる。従って、各溶離工程で用いられた充填物質は、クロマトグラフ ィーカラム中に供給され、各クロマトグラフィー分離工程に関するクロマトグラ フィー技術は、クロマトグラフィーカラムで混合物の成分を分離するための技術 において公知の一般的な方法を用いて行われる。典型的には、その技術は、クロ マトグラフィーカラムを選ばれた充填物質で充填し、そのカラムを溶離溶液で平 衡にし、試料をクロマトグラフィー分離に付し、選ばれた溶離溶液で溶離し、そ の溶離液を回収し、分析することに関する。 第三の回収溶液におけるコラゲナーゼの純度は、各々の汚染成分に関する検定 の結果により示される。従って、本発明により精製されたコラゲナーゼは、純粋 な蛋白質又は酵素は410ｎｍの波長において吸光度を全く示さないので、410ｎｍ において吸光度がないことにより示されるときに顔料成分を含まない。同様に、 280ｎｍにおける吸光度に対する260ｎｍにおける吸光度の低減された割合により 、汚染プロテアーゼ酵素に関連する酵素活性は無視できるほどであることが証明 されるとき、核酸物質がない。 本発明の精製されたコラゲナーゼは、本質的に顔料、ＤＮＡ及び非コラゲナー ゼ活性プロテアーゼを含まないので、そのコラゲナーゼは、予測できるコラーゲ ン劣化特性を示す。加えて、本発明の精製されたコラゲナーゼでは、毒素が有効 に除去されているので、後で行う生体内治療的用途のために細胞を単離するのに 用いられる酵素組成物において特に有用である。 さらに、図面と組みあわせて例示的態様の詳細な記載を考慮することによって 、本発明の目的、特徴及び利点は、当業者には明らかになるであろう。図面の簡単な説明 図１（Fig．１）は、本発明による例示的方法を示すフローチャートである。 図２（Fig．２）は、本発明によるその他の例示的方法を示すフローチャート である。例示的態様の詳細な説明 本発明は、工程時間及び物質の実質的低減をさせ、高度の再現性を有して純粋 なコラゲナーゼを高収率で生成する、改良されたクロマトグラフィー酵素精製法 を提供する。本発明により精製されたコラゲナーゼは、再現性を有し、信頼性を 有して、種々の治療的及び実験室での用途における組織消化及び組織に埋め込ま れた細胞の単離に寄与する。有利なことに、本発明の方法は、多量の溶離溶液の 消費及び、従来技術のグラジエント溶離技術に関連する再現性問題の煩わしさを 回避する。さらに、本発明の方法は、クロマトグラフィーカラムを再充填する危 険及び煩わされる充填物質の亀裂を本質的になくすことによって精製操作中の試 料の損失を回避する。 さらに、本発明の方法は、粗コラゲナーゼ中に見出だされる細菌性汚染物質に 関連するデオキリボ核酸及び毒素を消化し、除去するための方法を提供するもの である。本発明により精製されたコラゲナーゼは、それらの細菌性不純物を含ま ないので、アナフィラキシー反応又は関連免疫性合併症の恐れが重要である生体 内用途において有用である。特に、本発明の精製されたコラゲナーゼは、移植組 織片の性能を改良するために生物医療的移植組織片の表面を被覆させるために、 脂肪組織に埋め込ませた微小血管細胞を単離するのに有用である。 本発明により精製されたコラゲナーゼは、非コラーゲン特異的蛋白質分解酵素 を本質的に含まず、従って、自触媒劣化特性をかなり低減させた。このことは、 精製されたコラゲナーゼは、溶液中で保存された場合でさえ、改良された長期安 定性を有し、高レベルの触媒活性を維持することを意味する。 本発明は、単一のイオン強度の溶離溶液を用いて回分式工程で、粗コラゲナー ゼ調製物質をクロマトグラフィー分離することにより、従来の、時間を消費する 、多量の溶媒を必要とするグラジエント溶媒溶離方法を回避する発見に基づいて いる。さらに、特定の安定化添加剤及び界面活性剤を溶離溶液中に添加すること により、クロマトグラフィー充填物質は、改良された物理的結合性及びより長い 機能寿命が備えられる。従って、本発明の実施により、時間をかなり減らし、そ の操作に関連する原料コストを低減させる一方、本質的に純粋なコラゲナーゼを 高収率で提供する。 より特定すると、本発明は、コラゲナーゼ、顔料、クロストリパイン及びトリ プシンを含む蛋白質分解酵素不純物及びその他の細菌性物質のコラゲナーゼ組成 物を精製するのに有用な酵素精製法を提供する。図１の流れ図に例示されている ように、本発明の例示的方法は、コラゲナーゼ、顔料、細菌性毒素物質及び蛋白 質分解酵素不純物を含み得る安定化粗コラゲナーゼ溶液を供給する工程、その安 定化粗コラゲナーゼ溶液をヒドロキシアパタイトカラムにおいて、約0.05モル乃 至約0.3モルの燐酸カリウム及び非イオン性界面活性剤を含む第一の溶液で溶離 する工程を広範に含む。顔料の実質的部分がヒドロキシアパタイトカラムから溶 離されるまで、溶離を続ける。次に、コラゲナーゼ及び蛋白質分解酵素不純物を 、ヒドロキシアパタイト充填物質において0.35モル以上の燐酸塩緩衝液及び非イ オン性界面活性剤を含む第二の溶液で溶離し、コラゲナーゼと蛋白質分解酵素不 純物の第一の回収された溶液を供給する。 本発明の開示の目的のために、燐酸カリウムは、本技術分野で公知の方法によ り所望のモル濃度（イオン強度）及び溶液ｐＨを備えるように調製された量で存 在する一塩基性燐酸カリウムと二塩基性燐酸カリウムをいう。好ましい態様では 、第一及び第二の溶離溶液は、約6.7の溶液ｐＨを有する。しかし、他のｐＨも 同様に用いられる。 次の工程は、第一の回収溶液を、ゲル濾過充填物質において、N-［トリス（ヒ ドロキシメチル］-メチル］グリシン（トリシン）、CaCl₂及びNaClを含み、適す る酸の又は塩基の溶液でｐＨ7.5に調整された第三の溶液で溶離し、クロストリ パインとコラゲナーゼの第二の回収溶液を供給することを含む。 最後に第二の回収された溶液を、リアクティブ・レッド・120-アガロース （Reactive Red 120-Agarose）充填物質において、トリシン、CaCl₂及びNaClを 含み、約7.5のｐＨに調整された第四の溶液で溶離し、精製されたコラゲナーゼ の第三の回収溶液を供給することを含む。 当業者には、本発明の上記の溶離工程は、クロマトグラフィーカラムで混合物 成分を分離するための技術において公知の液体カラムクロマトグラフィー法を用 いて行わせることが好ましいことがわかるであろう。典型的には、それらの技術 は、選ばれた充填物質でクロマトグラフィーカラムを充填し、そのカラムを溶離 溶液で平衡にし、クロマトグラフィー分離するための試料を入れ、その試料を選 ばれた溶離溶液で溶離し、溶離液を回収し、分析することに関する。 下記のように、本発明において用いられる充填物質と溶離溶液との組み合わせ は、精製されたコラゲナーゼを提供するのに主要なことである。好ましいヒドロ キシアパタイト、ゲル濾過充填物質及びリアクティブ・レッド・120-アガロース 充填物質は、カラムクロマトグラフィー操作に適する活性、純度及び粒度を有す る。従って、適する充填物質で適当に充填されたなら、充填されたカラムは適す る溶離溶液で平衡にされ得て、次に、本発明により粗コラゲナーゼ成分の分離を させるのに用いられる。 本発明の実施において有用であることが公知のヒドロキシアパタイト充填物質 は、バイオ・ラッド（Bio-Rad）を含むいくつかの商業的供給先から入手できる 。ゲル濾過充填物質に関して、成分の大きさ又は分子量により溶液の成分を分離 させる、いずれの充填物質も適している。本発明の目的のために、好ましいゲル 濾過充填物質は、セファクリル（Sephacryl）系であり、特に、ファーマシア・ ＬＫＢ・バイオテクノロジー（Pharmacia LKB Biotechnology）から入手可能な セファクリルｓ-200ＨＲである。好ましいリアクティブ・レッド・120-アガロー スゲルは、クロマトグラフィー級のリアクティブ・レッド・120-アガロースゲル 、タイプ3000ＣＬ、であり、シグマ・ケミカル・カンパニー（Sigma Chemical C ompany）から市販されている。 本発明の特徴として、安定化粗コラゲナーゼ溶液には、CaCl₂及びアルギニン を含有する水性緩衝液中に粗コラゲナーゼを含有する。CaCl₂とアルギニンの組 み合わせは、コラゲナーゼを安定化させ、トリプシン不純物の蛋白質分解活性を 抑制する。このことは、溶液中で迅速にコラゲナーゼを加水分解することができ るトリプシンによる蛋白質分解性加水分解によりコラゲナーゼ活性の損失の低減 に寄与する。好ましくは安定化コラゲナーゼ溶液には、約１ｍＭのCaCl₂、約５ ｍＭのアルギニン及び、ｐＨ6.7の.15Ｍの燐酸カリウム緩衝液のような適する緩 衝液を含む。本発明の開示の目的のために、特定のｐＨを有する燐酸カリウム溶 液に対するすべての言及は、一般に、一塩基性及び二塩基性燐酸カリウムを、特 定のｐＨを与える組み合わせで含む燐酸カリウム塩をいう。 本発明によれば、安定化粗コラゲナーゼ溶液から、細菌性のＤＮＡと毒素を除 去するためのヒドロキシアパタイトカラムの能力を増大させるために、安定化粗 コラゲナーゼ溶液をヒドロキシアパタイトにおいて溶離する前に、安定化粗コラ ゲナーゼにデオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮアーゼ）を添加することができる。 より特定すると、デオキシリボヌクレアーゼを約40ｕ／mlのデオキシリボヌクレ アーゼ活性を与えるのに十分な量、安定化粗コラゲナーゼ溶液に加えることによ り、粗溶液中に存在する大きな分子量の核酸が消化される［１クニッツ（Kunitz s）単位は、ｐＨ4.6、25℃で0.001／分／mlの△Ａ₂₆₀を生成する］。この工程に より核酸の分子量分布が低減され、そして同時に粗コラゲナーゼ溶液の粘度が低 減され、それによってクロマトグラフィーカラムの分画が促進される。 本発明の他の特徴として、安定化粗コラゲナーゼ溶液及び、第一及び第二溶離 溶媒に非イオン性界面活性剤を加えることによって、ヒドロキシアパタイト充填 物質は、亀裂が入る又はカラム中の容量を変化させる傾向を減ずる。このことは 、高濃度の有機物質を用いて使用された場合、ヒドロキシアパタイトカラムに関 連する通常の問題である。一端、カラムに亀裂が入ると、カラムは役に立たなく なり、全工程を再開始させなければならないので特に厄介な問題である。さらに 、この亀裂が入る問題は、高価な物質及び回収できない作用物質の頻繁な損失を もたらす。非イオン性界面活性剤は、湿った充填物質を維持させるのに役立ち、 すべての充填物質を均質に通過する溶離溶媒を維持するようである。コラゲナー ゼと相溶性であるどの水溶性非イオン性界面活性剤も本発明における使用に適し ている。シグマ・ケミカル・カンパニー（Sigma Chemical Co.）から入手可能な ツイーン20製品、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレートを含むポリソル ベ ート非イオン性界面活性剤は特に適している。 本発明による安定化粗コラゲナーゼ溶液の溶離は、安定化粗コラゲナーゼをヒ ドロキシアパタイトを充填した液体クロマトグラフィーの上部に入れ、第一溶液 をヒドロキシアパタイトに連続的に流動させることに関与する。この溶離工程は 、280ｎｍにおける吸光度が10％未満に落ちるまで続ける。当業者は、通常の実 験の評価により、連続的に流動させる第一溶液を、安定化粗コラゲナーゼ溶液の 残存する成分から顔料の効率のよい分離をさせるような速度で流動させるように 調整することを認識するであろう。本発明の目的のためには、適する溶離溶液流 動速度は約0.5cm／時間乃至約５cm／時間である。 ヒドロキシアパタイトにおいて粗コラゲナーゼ溶液を分離するためにグラジエ ント溶離技術を用いる技術を用いる従来技術のコラゲナーゼ精製法とは異なり、 本発明の方法は、充填されたヒドロキシアパタイトカラムにおいて２つの工程の 溶離技術を含む。さらに特定すると、上記のように、ヒドロキシアパタイトにお いて、約0.05モル乃至約0.3モルの燐酸カリウム濃度を有する第一溶液で安定化 粗コラゲナーゼ溶液を溶離する。好ましくは、第一溶離溶液は、6.7のｐＨを有 する0.15モルの燐酸カリウムである。その他に、連続的にヒドロキシアパタイト 充填物質に界面活性剤を供給するために、好ましい第一溶離溶液はさらに0.01重 量％の非イオン性界面活性剤を含有する。0.15モルの燐酸カリウム溶液により与 えられた溶液イオン強度は、安定化粗コラゲナーゼ中に見出だされる他の成分を 維持しつつ安定化粗コラゲナーゼ溶液における顔料不純物を溶離するのに十分に 強い。 ２工程ヒドロキシアパタイトカラム溶離法の二番目の工程では、0.15Ｍの燐酸 カリウム溶液で顔料を溶離した後に、二番目の溶液は、ヒドロキシアパタイト上 に残存するそのコラゲナーゼと蛋白質分解酵素不純物質を溶離する。第二の溶液 は、0.35モル以上の燐酸カリウム濃度を有し、好ましくは、ｐＨ6.7を与える燐 酸カリウム塩を用いて0.4モルの燐酸カリウム濃度を有する。上記と同じ理由の ために、好ましくは第二の溶液も0.01重量％の非イオン性界面活性剤を含む。0. 15モルよりもずっと低いイオン強度を有することが好ましい第一溶液と異なり、 第二溶液に関する、より高いイオン強度がコラゲナーゼ及び、トリプシン及びク ロストリパインを含む蛋白質分解酵素不純物をヒドロキシアパタイトから迅速に 溶離し、第一回収溶液を供給する。有利なことには、従来技術の煩わしいグラジ エント溶離法とは異なる２工程溶離法を用いることにより、ずっと少ない時間で ずっと少ない溶離溶液を用いて、粗コラゲナーゼ溶液から存在する顔料を有効に 分離させる。このことは、より少ない費用とより迅速な操作をもたらす。 一般的に、コラゲナーゼ及び蛋白質分解酵素不純物の第一回収溶液は、画分溶 液のプールされた回収であることを当業者は又、認識するであろう。より特定す ると、コラゲナーゼ及び蛋白質分解酵素不純物をヒドロキシアパタイトカラムに おいて溶離することは典型的には、画分の形態で別の少量の溶離液（eluant）を 回収し、コラゲナーゼ、トリプシン及びクロストリパイン活性について各回収画 分を本技術分野で公知の検定方法により検定することに関する。酵素活性を有す るそれらの画分をプールし、ゲル濾過充填物質において溶離するための第一回収 溶液を形成させる。この技術は、望ましくない不純物が第一回収溶液に入ってい く可能性を最小にし、第一回収溶液における溶離溶媒の量を低減させる。 ゲル濾過カラムにおける第一回収溶液を溶離することは、第一の回収溶液を、 セファクリルｓ-200ＨＲのようなゲル濾過カラムにかけ、好ましくは、ｐＨ7.5 に調整された、約1.5ＭのNaCl、約５ｍＭのCaCl₂及び約５ｍＭのトリシンを含む 溶液である第三溶液で溶離することにより達成される。この溶離工程は、コラゲ ナーゼ及びクロストリパイン活性を有する酵素は溶離され、第二回収溶液を生成 するが、トリプシンをより長くカラムに残存させる。ヒドロキシアパタイトにお いて粗コラゲナーゼ溶液を溶離することに関する、好ましい方法は、ゲル濾過溶 離離剤の画分を回収し、コラゲナーゼ、トリプシン及びクロストリパイン活性に 対してその画分を分析し、かなりのコラゲナーゼ活性及びクロストリパインの低 活性しかし、トリプシン非活性を有する画分をプールし、第二回収溶液を生成す る。 本発明の精製法における最終溶離工程は、第二回収溶液を、リアクティブ・レ ッド・120-アガロースゲルにおいて溶離し、存在し得るクロストリパインからコ ラゲナーゼを分離し、精製コラゲナーゼを提供する。より特定するとこの工程は 、第二の回収溶液をリアクティブ・レッド・120-アガロースゲルで充填させたク ロ マトグラフィーカラムにかけ、そのカラムを、好ましくは、約1.5ＭのNaCl、約 ５ｍＭのCaCl₂及び約５ｍＭのトリシンを含み、約7.5のｐＨに調整された溶液で ある第四の溶液で溶離することにより行われる。有利なことに、第四溶離溶液の イオン強度は、コラゲナーゼがリアクティブ・レッド・120-アガロースゲルに結 合しないような強度であり、それによって、コラゲナーゼを塩グラジエントでの 長い溶離なしに、迅速に溶離させる。又、除去のために約２ＭのNaCl及び５Ｍの 尿素のような非常に高度のイオン強度溶液を必要とするので、第二回収溶液中に 残るクロストリパイン又は痕跡量の顔料はリアクティブ・レッド・120-アガロー スゲルに強く結合する。 当業者は、液体クロマトグラフィーに通常に関連する操作は一般的にクロマト グラフィー充填物質を調製すること及び、その使用の後にクロマトグラフィー充 填物質の再生に向けられる工程に関与することをさらに認識するであろう。従っ て、本発明の好ましい方法には、好ましいヒドロキシアパタイトカラム、セファ クリルゲル濾過カラム及びリアクティブ・レッド・120-アガロースゲルカラムを 調製する方法が含まれる。例えば、カラムを調製することは、１ＭのNaCl及び約 0.01重量％のツイーン20を含む溶液中にヒドロキシアパタイトカラム充填物質を 懸濁することによって、カラムを調製することを達成し、0.15Ｍの燐酸カリウム 及び約0.01重量％のツイーン20を含み、6.7のｐＨに調整された溶液中で懸濁充 填物質を洗浄することにより達成され、クロマトグラフィーカラムに充填するの に適するヒドロキシアパタイトを提供する。本技術分野において公知の方法によ りクロマトグラフィーカラムを充填した後の次の工程には、0.15Ｍの燐酸カリウ ム及び約0.01重量％のツイーン20を含み、6.7のｐＨに調整した溶液を充填物質 中に流動させることによりヒドロキシアパタイト充填カラムを平衡させる。 同様な懸濁及び平衡方法を用いてゲル濾過充填物質及びリアクティプ・レッド ・120-アガロース充填物質を調製する。例えば、1.5ＭのNaCl、約５ｍＭのトリ シン、５ｍＭのCaCl₂を含み、7.5のｐＨに緩衝された溶液中にセファクリルｓ-2 00ＨＲ又はリアクティブ・レッド・120-アガロース充填物質を懸濁し、そのカラ ムを充填し、水性懸濁溶液に類似の平衡水性溶液でカラムを平衡させることによ り、第一回収溶液を溶離するための適当に調製されたセファクリルｓ- 200ＨＲ充填カラムを提供する。図２（Fig．２）の詳細な流れ図に例示されてい るように、上記の溶液を懸濁し、平衡にすることを、第二回収溶液を溶離するの にリアクティブ・レッド・120-アガロース充填物質を調製するのに用いられる。 カラム充填物質を再生するのに向けられる方法は、充填物質が十分に長く使用 され、使用カラムで溶離する溶液の成分を分離するための有効性が低減したとき に一般的に行われる。本発明の目的のために、例えば、各精製工程の後に、効力 がなくなったヒドロキシアパタイト充填物質を再生する。好ましいヒドロキシア パタイト再生法は、１Ｍの水酸化ナトリウムを含む溶液をヒドロキシアパタイト 中に流動させ、次に0.15Ｍの燐酸カリウム及び約0.01重量％のツイーン20を含み 、ｐＨ6.7に調整された溶液を効力がなくなったヒドロキシアパタイトに流動さ せることに関する。その２工程の後に、充填物質を上記の方法により平衡させる 準備ができる。 本発明において用いられるゲル濾過充填物質を再生することは、ヒドロキシア パタイト充填物質を再生するのに用いられるものと同様な水性再生溶液を用いて 達成される。より特定すると、0.2Ｍの水酸化ナトリウムを含む溶液を効力がな くなったセファクリルｓ-200ＨＲ充填物質に流動させ、次に1.5ＭのNaCl、５ｍ Ｍのトリシン及び５ｍＭのCaCl₂を含み、7.5のｐＨに調整された溶液を流動させ ることによって、充填物質は、上記の平衡法により平衡させる準備ができる。 最終的に、本発明によりリアクティブ・レッド・120-アガロースゲルを再生す ることは、まず逐次的に、２ＭのNaClを含む溶液そしてその次に５Ｍの尿素を含 む溶液を効力をなくしたリアクティブ・レッド・安定化ゲルに流動させ、それに よって、クロイトリパイン及び顔料不純物をカラムから除去する。次に1.5ＭのN aCl、５ｍＭのトリシン及び５ｍＭのCaCl₂を含み、ｐＨ7.5に調整された溶液を もたらすことによって、リアクティブ・レッド・120-アガロースゲルは、平衡に なり、付加的な第二回収溶液を溶離するのに準備ができる。 本発明の好ましい例示的態様は、粗コラゲナーゼ溶液及び第一回収溶液を各々 の次の溶離工程のために調製することに関する付加的な方法を加える。例えば、 高分子量物質及び固体成分を除去することが企図される添加された方法工程が用 いられる。従って、より詳細な図２の流れ図において例示されているように、安 定化粗コラゲナーゼ溶液を溶離する前にそして、核酸をデオキシリボヌクレアー ゼ（ＤＮアーゼ）で消化するのに続いて、好ましくは、粗コラゲナーゼ溶液を消 化したＤＮアーゼを50,000の分子量遮断（molecular cutoff）を有する透析管を 用いて透析する。その透析溶液は、好ましくは、0.15Ｍの燐酸カリウム、５ｍＭ のアルギニン及び１ｍＭのCaCl₂を含む安定化溶液であり、透析は、その技術分 野で公知の方法により行う。次に、得られた透析物を遠心分離することにより透 析したそして安定化した粗コラゲナーゼ溶液の上清が提供される。ヒドロキシア パタイトにおいて溶離するためにこの溶液を調製するために、0.15Ｍの燐酸カリ ウム、５ｍＭのアルギニン及び１ｍＭのCaCl₂の上清溶液を適する非イオン性界 面活性剤で調製し、約0..01重量％の界面活性剤濃度にする。 本発明の好ましい方法にはさらに、セファクリルｓ-200ＨＲ充填物質において 溶離するための第一の回収された溶液を調製することに関する、同様の透析及び 遠心分離工程が含まれる。ヒドロキシアパタイトから溶離された、分析された酵 素画分をプールする工程に続いて、濃縮技術又はその技術分野で公知の同様の方 法を用いて、得られた第一回収溶液を濃縮する。その濃縮された第一回収溶液を 次に約５ｍＭのアルギニン及び約１ｍＭのCaCl₂を含む溶液に対して、好ましく は50,000分子量遮断を有する透析管を用いて透析する。この工程に続き、第一回 収溶液を再び他の溶液で透析する。その好ましい透析溶液は、約1.5ＭのNaCl、 約５ｍＭのトリシン、約５ｍＭのCaCl₂及び約５ｍＭのアルギニンを含み、ｐＨ7 .5に緩衝された溶液である。第二透析工程から得られた透析液を次に遠心分離し 、0.45ミクロンのフィルターを通して濾過し、得られた、透析し、遠心分離し濾 過した第一回収溶液を溶離する。 本発明では、精製したコラゲナーゼ溶液を提供することに関して、安定化粗コ ラゲナーゼ溶液及び第一回収溶液を調製することに関するものと同様の濃縮、透 析及び遠心分離を行う。従って、リアクティブ・レッド・120-アガロースゲルで 第二回収溶液を溶離し、分析された酵素画分をプールし、精製コラゲナーゼを生 成するのに続いて、好ましい方法にはさらに、公知の濃縮法及び標準細胞濃縮器 のような装備を用いることにより、コラゲナーゼ濃縮物を生成することが含まれ る。次にコラゲナーゼ濃縮物を、50,000分子量遮断を有する透析管を用いて、プ ラスマライト（Plasmalite）Ａ（商標名）、バクスターＩＶシステムス（Baxter -IV Systems）から入手可能な、１ｍＭのCaCl₂、を含有し、ｐＨ7.4の電解質溶 液に対して透析を行う。最後に、その透析物を0.20ミクロンのフィルターにより 濾過し、その濾液を遠心分離することにより、遠心分離された、実質的に顔料及 び蛋白質分解酵素不純物を含まない精製されたコラゲナーゼの上清を提供する。 当業者は、濃縮、透析及び遠心分離工程と同様に各溶離工程により、コラゲナ ーゼの純度が増大され得ることを認識するであろう。従って、本発明の上記の精 製方法を行った後に、得られる精製されたコラゲナーゼには、痕跡量の残存する トリプシン及びクロストリパイン活性のみしか含まれない。実際、それらの痕跡 量は、精製されたコラゲナーゼの総蛋白質の１％未満しか構成しない。ＳＤＳ− ゲル電気泳動研究により本発明により精製された高純度のコラゲナーゼが示され る。さらに、等電点電気泳動分析により、粗コラゲナーゼ溶液中に見出だされる コラゲナーゼの異性体形は精製コラゲナーゼ中に維持されることが確認される。 このことは、精製されたコラゲナーゼは、全範囲のコラーゲン蛋白質を加水分解 する能力を維持することを保証する。 当業者は、又、安定化粗コラゲナーゼ溶液をヒドロキシアパタイトにおいて溶 離することに関する２工程グラジエント法は、第一回収溶液を提供するために必 要とする第一及び第二溶離溶液の量をかなり低減させることを認識するであろう 。さらに、第一及び第二溶液中の非イオン性界面活性剤の存在により、亀裂が入 ることなしに又はそうでなければヒドロキシアパタイトカラムを役に立たなくす る事なく、安定化粗コラゲナーゼ溶液の無駄のないそして迅速な溶離を確保する 。安定化CaCl₂及びアルギニンを溶離溶液及び粗コラゲナーゼに加えることによ り、コラゲナーゼの自触媒作用損失が避けられそして高収率の精製されたコラゲ ナーゼが維持される。 上記のように、本発明の精製されたコラゲナーゼは、結合組織を加水分解する ことに関する広範囲の用途を有する。それらの用途には、結合組織から細胞を単 離し、生体内治療的処置のために単離された細胞を移植することが含まれる。有 利に、トリプシン及びクロストリパインのような非コラーゲン特異的酵素活性を 除去することにより、本発明により、コラゲナーゼを劣化し得るプロテアーゼを 実質的に含まないコラゲナーゼを提供し、従って、粗コラゲナーゼの特徴である 自触媒的劣化特性をなくす。さらに、本発明の方法は、感作抗原及びその他の毒 素をなくすので、本発明の精製されたコラゲナーゼは、生体内において移植され た又は消化された細胞中又は組織中にもし存在する場合に、アナフィラキシーシ ョック又は関連する免疫反応を生じさせない。 下記の非限定実施例は、本発明の例示的酵素精製法を例示し、さらに本発明に 関する異性体形の維持及び高収率を示すデーターを出す。 実施例例示的コラゲナーゼ精製法 ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーカラムを調製し、粗コラゲナーゼの 溶液を安定化し、下記のようにカラムにおいてクロマトグラフにかけた。製品番 号130-0151としてバイオ・ラッド（Bio Rad）から購入したヒドロキシアパタイ トバイオ（Bio）ゲルＨＴ充填物質３ｌを、1.0ＭNaCl及び0.01重量％のツイーン 20を含有する溶液中で懸濁し、次に少なくとも１時間沈降させた。上清を除去し 、懸濁工程を繰り返した。第二の上清を除去した後に、ヒドロキシアパタイトを 0.15Ｍの燐酸カリウム及び0.01重量％ツイーン20を含み、ｐＨ6.7に調整した溶 液中で再懸濁させた。 懸濁されたヒドロキシアパタイト充填物質を10cmの直径そして50cmの長さのガ ラスクロマトグラフィーカラムに充填した。ベーリンガーマンハイムから入手し た粗コラゲナーゼの20ｇ部分を、0.15Ｍの燐酸カリウムと５ｍＭの塩化マグネシ ウムを含有し、ｐＨ6.7に調整した溶液400mlに溶解させた。その溶液１ml部分を 希釈し、その溶液の光学濃度を260ｎｍ、280ｎｍ及び410ｎｍで測定した。 次に、16000ユニット（40ユニット／ml）のデオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮ アーゼ）を粗コラゲナーゼ溶液に添加し、得られた溶液を40分間静かに混合し、 その溶液中のデオキシリボース核酸を消化させた。消化の後に、消化された溶液 １ml部分を希釈し、その溶液の光学濃度を260ｎｍ、280ｎｍ及び410ｎｍで測定 した。 次に、粗コラゲナーゼ溶液を消化したＤＮアーゼを、0.15Ｍの燐酸カリウム、 ５ｍＭのアルギニン及び１ｍＭのCaCl₂を含有し、ｐＨ6.7に調整された溶液4000 mlに対して一晩、透析を行った、次に、透析された試料を４℃において20,000ｒ ｐｍで20分間、遠心分離し、上清を回収し、0.01重量％のツイーン20濃度に調整 した。 嬬動ポンプを用いて1.3cm／時間の流量で、安定化粗コラゲナーゼの回収され た試料をヒドロキシアパタイトで充填したクロマトグラフィーカラムの上部に入 れた。ヒドロキシアパタイトカラムの回収末端を、17mlの画分を回収するための 画分回収器及び、カラムから溶離した物質を特定の波長において検出するための ＵＶ検出器に取り付けた。その回収試料を、0.15Ｍの燐酸カリウム及び0.01重量 ％のツイーン20を含有する溶液で1.3cm／時間の流量で溶離した。280ｎｍでの（ 最初のピーク）ＵＶ吸光度を示す画分のコラゲナーゼ活性をＦＡＬＧＰＡ（フリ ルアクリロイルLeu-Gly-Pro-Ala）検定を用いてモニターした。カラムクロマト グラフィーを通常に実施するときに、第一ピークにコラゲナーゼ活性は見出ださ れるはずはない。 280ｎｍにおける吸光度が、全規模の10％に落ちたら、溶離溶液を、0.4Ｍの燐 酸カリウム、0.01重量％のツイーン20及び１ｍＭのCaCl₂を含み、ｐＨ6.7に調整 した第二溶液に変えた。この第二溶離溶液を用いて回収し、280ｎｍ（第二ピー ク）でのＵＶ吸光度を示す画分を、100ｍＭのアルギニンの溶液で調整し、５ｍ Ｍのアルギニン濃度を有する回収された画分を提供する。その画分を、ＵＶ吸光 度（第二ピーク）が検出されなくなるまで、コラゲナーゼ、トリプシン及びクロ ストリパイン活性について検定した。 各々の酵素を試験する前に、回収した画分を、トリプシン及びコラゲナーゼ検 定のために５倍に希釈し、クロストリパイン検定のために32倍に希釈した。それ は、燐酸塩濃度を十分に希釈し、検定緩衝液におけるCaCl₂での沈殿を排除し、 検定との干渉を防いだ。 クロストリパイン活性は、通常ピークの尾末端に現れる。吸光度が低減し、ク ロストリパイン活性が増大したときに、クロストリパイン活性（ＢＡＥＥ、ベン ゾイルＬ−アルギニンエチルエステル基質を用いて測定した）のコラゲナーゼ活 性（ＦＡＬＧＰＡ基質）に対する割合を決定した。0.25以下の割合を有し、15μ kat／ｌ（ｐＨ7.5で37℃における秒当りの加水分解されたＦＡＬＧＰＡ基質のマ イクロモル）より大きいコラゲナーゼ活性を有するすべての画分をプールした。 第一回収溶液を提供するためにすべての画分をプールした後に、１mlの第一回収 溶液を希釈し、260ｎｍ、280ｎｍ及び410ｎｍでの吸光度を測定した。260ｎｍの 280ｎｍに対する吸光度の割合が0.5未満であることは、核酸物質の除去が成功し ていることを示しており、410ｎｍの280ｎｍに対する割合が0.05未満であること は、顔料の除去が成功したことを示す。 プールされた画分の第一回収試料をアミコン攪拌細胞濃縮器（Amicon stircel l concentrator）及び、5.0重量％のホルムアルデヒド及び25％のエタノールで 安定化したＰＭ10膜を用いて60mlに濃縮した。次に濃縮した試料60mlを、５ｍＭ のアルギニン及び１ｍＭのCaCl₂を含有する溶液6000mlに対して一晩透析した。 その透析溶液を1.5ＭのNaCl、５ｍＭのトリシンン、５ｍＭのCaCl₂及び５ｍＭの アルギニンを含有し、ｐＨ7.5に調整した溶液に変え、とせソノさらに２時間続 けた。次にその透析試料を回収し、４℃で20,000ｒｐｍで20分間遠心分離し、得 られた上清を回収し、0.45ミクロンのフィルターで濾過した。 濾過した溶液を他の蛋白質分解酵素からコラゲナーゼをさらに分離するために ゲル濾過カラムでクロマトグラフにかけた。このゲル濾過分離操作は、最初に、 セファクリルｓ-200ＨＲを、1.5MのNaCl、５ｍＭのCaCl₂及び５ｍＭのトリシン を含有し、ｐＨ7.5に調整した溶液中に懸濁し、その懸濁液を、その底面（bases ）で直列に連絡しており、５cm×100cmの大きさである２つのガラスカラムに注 ぐことにより、２つのクロマトグラフィーカラムに、セファクリルｓ-200ＨＲを 充填することに関与する。第二カラムの出口は、画分回収器及び、第二カラムか ら溶離された溶液のＵＶ吸光度を検出するためのＵＶ検出器に連絡していた。蠕 動ポンプを用いて、第一及び第二のカラムに、1.5ＭのNaCl、５ｍＭのトリシン 及び５ｍＭのCaCl₂を含有し、ｐＨ7.5に調整された溶液約８ｌを約４cm／時間の 流量で通すことにより充填したカラムを平衡にした。 次に、ヒドロキシアパタイトカラムから得られた濾過した試料を第一カラムの 上部に入れ、1.5ＭのNaCl、５ｍＭのトリシン及び５ｍＭのCaCl₂を含有し、 ｐＨ7.5に調整された溶液を用いて両方のカラムで溶離した。回収された物質の 各々の画分を、コラゲナーゼ、トリプシン及びクロストリパイン活性について検 定した。1.240μkat／ｌより大きいコラゲナーゼ活性を有する画分をプールした 。1.240μkat／ｌ未満のコラゲナーゼ活性を有しない画分では、クロストリパイ ン活性のコラゲナーゼ活性に対する割合を決定し、2.0未満の割合を有し、ＢＡ ＰＮＡ（ベンゾイルＬ−アルギニンｐ−ニトロアニリンド）基質を用いて測定し た1.170μkat／ｌ未満のトリプシン活性を有する画分をプールした。次に、プー ルした画分から得られた試料を0.45ミクロンのフィルターに通した。 500mlのリアクティブ・レッド・120-アガロースゲル、タイプ3000Clを、1.5Ｍ のNaCl、５ｍＭのトリシン及び５ｍＭのCaCl₂を含有し、ｐＨ7.5に調整した溶液 中に懸濁し、その懸濁液を５cm×25cmのガラスカラムに注ぐことにより、クロマ トグラフィーカラムをリアクティブ・レッド・120-アガロース、タイプ3000Clで 充填した。そのがラスカラムの出口を画分回収器及び、そのカラムから溶離した 物質のＵＶ吸光度を検出するためのＵＶ検出器に取り付けた。 約２ｌの平衡溶液を蠕動ポンプを用いて2.1cm／時間で充填物質に通すことに より、そのカラムを平衡にした。次に、ゲル濾過カラムから出たプールされた画 分から得られた濾過試料を、リアクティブ・レッド・120-アガロース充填カラム の上部に入れ、1.5ＭのNaCl、５ｍＭのトリシン及び５ｍＭのCaCl₂を含有し、ｐ Ｈ7.5に調整された溶液で溶離した。280ｎｍにおけるＵＶ吸光度を有する回収さ れた画分を、コラゲナーゼ及びクロストリパイン活性について検定した。1.240 μkat／ｌより大きいコラゲナーゼ活性を有するすべての画分をプールした。次 に、そのプールした画分を、アミコン攪拌細胞濃縮器及びＰＭ10膜を用いて900 μkat／ｌのコラゲナーゼ活性に濃縮した。 濃縮した溶液を次に、１ｍＭのCaCl₂を含有するプラスマライトＡ電解質溶液 に対して一晩透析を行い、20,000ｒｐｍで20分間遠心分離した。その上清を回収 し、コラゲナーゼ及びクロストリパイン活性について分析し、最後に、長期保存 のために凍結乾燥した。 表Ｉは、上記精製法の各工程の前にコラゲナーゼ溶液のＵＶ吸光度における変 化により示される、ＤＮＡ不純物含量、コラゲナーゼ、トリプシン及びクロスト リパイン活性に関連するデーターを提供するものである。 表Ｉにより示されるように、各溶液のコラゲナーゼ活性は、粗コラゲナーゼに おける33ｎkat／mgの蛋白質から42.7ｎkat／mgの蛋白質の最終活性まで非常に増 大した。一方、トリプシン及びクロストリパイン活性は、それぞれ7.7及び85.5 ｎkat／mgの蛋白質から、0.2及び3.8ｎkat／mg蛋白質の最終濃度まで非常に低減 した。さらに、ＤＮＡ含量は、11.4μｇ／mgの蛋白質から0.8μｇ／mgの蛋白質 に低下した。顔料含量も、410ｎｍにおける溶液吸光度により示されたように非 常に低下した。 このように本発明の例示的態様を記載したが、当業者は、開示は、例示的のみ であり、種々の他の代替、応用および改変が本発明の範囲内で成し得ることを注 意すべきである。従って、本発明は、本明細書に例示された特定の態様に限定さ れず、下記の請求の範囲のみに限定される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ディン、タン、サン アメリカ合衆国、カリフォルニア州 92643、ガーデン・グローブ、ピニョン・ コート 12572

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．コラゲナーゼ、顔料、毒素及び細菌性物質及び、クロストリパイン、トリプ シン及びカゼイナーゼ（caseinase）を含む蛋白質分解酵素不純物を含有する粗 コラゲナーゼを精製する方法であり、 安定化粗コラゲナーゼ溶液を、ヒドロキシアパタイト充填物質を含有するカラ ムに入れる工程、 約0.05Ｍ乃至約0.3Ｍの燐酸塩を含み、約６のｐＨ乃至約８のｐＨに緩衝され た第一溶液でヒドロキシアパタイト充填物質から顔料及びカゼイナーゼを溶離す る工程、 約６のｐＨ乃至約８のｐＨに緩衝された、約0.35Ｍ乃至約0.5Ｍの燐酸塩及び 非イオン性界面活性剤を含む第二溶液で、コラゲナーゼ、クロストリパイン及び トリプシンを溶離し、第一回収溶液を提供する工程、 第一回収溶液をゲル濾過充填物質を含有するカラムに入れる工程、 中性のｐＨ緩衝液を含む第三溶液でコラゲナーゼ及びクロストリパインを溶離 し、第二回収溶液を提供する工程、 第二回収溶液を、リアクティブ・レッド・120-アガロース充填物質を含むカラ ムに入れる工程及び 中性ｐＨの緩衝液を含む第四溶液でコラゲナーゼを溶離し、精製コラゲナーゼ を含む溶液を提供する工程 を含む、方法。 ２．安定化粗コラゲナーゼ溶液が、コラゲナーゼ、CaCl₂及びアルギニンを含む 、請求項１に記載の方法。 ３．デオキシリボヌクレアーゼを、約40ｕ／mlのデオキシリボヌクレアーゼ活性 を与えるのに十分な量、安定化粗コラゲナーゼ溶液に添加する工程をさらに含む 、請求項１に記載の方法。 ４．約0.15Ｍの燐酸カリウム、約５ｍＭのアルギニン及び約１ｍＭのCaCl₂を含 み、約6.7のｐＨに緩衝された溶液に対して安定化粗コラゲナーゼ溶液を透析し 、第一透析物を提供する工程及び 第一透析物を遠心分離し、透析した安定化粗コラゲナーゼ溶液を含む上清を提 供する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。 ５．第一回収溶液を濃縮する工程、 濃縮された第一回収溶液を、NaCl、トリシン、CaCl₂及びアルギニンを含み、 約7.5のｐＨに緩衝された溶液で透析し、第二透析物を提供する工程及び 第二透析物を遠心分離し、透析された第一回収溶液を含む上清を提供する工程 をさらに含む、請求項４に記載の方法。 ６．第一溶液が、約0.15Ｍの燐酸カリウム、約0.01重量％の非イオン性界面活性 剤及び約１ｍＭのCaCl₂を含み、約6.7のｐＨに緩衝されている、請求項１に記載 の方法。 ７．第二溶液が、約0.4Ｍの燐酸カリウム、約0.01重量％の非イオン性界面活性 剤及び約１ｍＭのCaCl₂を含み、約6.7のｐＨに緩衝されている、請求項１に記載 の方法。 ８．第三溶液が、約1.5ＭのNaCl、約５ｍＭのCaCl₂及び約５ｍＭのトリシンを含 み、約7.5のｐＨに緩衝されている、請求項１に記載の方法。 ９．第四溶液が、約1.5ＭのNaCl、約５ｍＭのCaCl₂及び約５ｍＭのトリシンを含 み、約7.5のｐＨに緩衝されている、請求項１に記載の方法。 10．コラゲナーゼ、顔料、毒素及び細菌性物質及び、クロストリパイン、トリプ シン及びカゼイナーゼ（caseinase）を含む蛋白質分解酵素不純物を含有する粗 コラゲナーゼを、塩化マグネシウム、燐酸カリウム及びデオキシリボヌクレアー ゼを含む溶液中で消化させる工程、 約0.15Ｍの燐酸カリウム及び約５ｍＭのアルギニン及び約１ｍＭのCaCl₂を含 み、約6.7のｐＨに緩衝された溶液に対して、消化された粗コラゲナーゼ溶液を 、透析し、透析物を提供する工程、 透析物を遠心分離し、上清を提供する工程、 上清をヒドロキシアパタイト充填クロマトグラフィーカラムに入れる工程、 約0.15Ｍの燐酸カリウム、約0.01重量％の非イオン性界面活性剤及び約１ｍＭ のCaCl₂を含み、約6.7のｐＨに緩衝された第一溶液で顔料を溶離する工程、 約0.4Ｍの燐酸カリウム、約0.01重量％の非イオン性界面活性剤及び約 １ｍＭのCaCl₂を含み、約6.7のｐＨに緩衝された第二溶液で、蛋白質分解酵素不 純物及びコラゲナーゼを溶離し、第一回収溶液を提供する工程、 ゲル濾過充填物質を充填したクロマトグラフィーカラムに第一回収溶液を入れ る工程、 約1.5ＭのNaCl、約５ｍＭのCaCl₂及び約５ｍＭのトリシンを含み、約7.5に緩 衝された第三溶液でコラゲナーゼ及びクロストリパインを溶離し、第二回収溶液 を提供する工程、 第二回収溶液を、リアクティブ・レッド・120-アガロースを充填したクロマト グラフィーカラムに入れる工程及び 約1.5ＭのNaCl、約５ｍＭのCaCl₂及び約５ｍＭのトリシンを含み、約7.5に緩 衝された第四溶液で精製コラゲナーゼを溶離する工程 を含む、コラゲナーゼ組成物を精製する方法。 11．ヒドロキシアパタイト充填物質を水酸化ナトリウムで再生させる工程をさら に含む、請求項10に記載の方法。 12．ゲル濾過充填物質を水酸化ナトリウムで再生させる工程をさらに含む、請求 項10に記載の方法。 13．リアクティブ・レッド・120-アガロース充填物質を最初に塩化ナトリウムで 次に尿素で再生させる工程をさらに含む、請求項10に記載の方法。 14．ヒドロキシアパタイトから溶離された画分を回収する工程、 その画分を、コラゲナーゼ、トリプシン及びクロストリパイン活性について検 定する工程及び 15μkat／ｌより大きいコラゲナーゼ活性及び、0.25以下の、クロストリパイ ン活性のコラゲナーゼ活性に対する割合を有する回収画分をプールし、第一回収 溶液を提供する工程 をさらに含む、請求項10に記載の方法。 15．ゲル濾過充填物質から溶離された画分を回収する工程、 その画分をコラゲナーゼ、トリプシン及びクロストリパイン活性について検定 する工程及び 1.240μkat／ｌより大きいコラゲナーゼ活性又は、2.0以下の、クロストリ パイン活性のコラゲナーゼ活性に対する割合及び、1.170μkat／ｌのトリプシン 活性を有する回収画分をプールし、第二回収溶液を提供する工程 をさらに含む、請求項10に記載の方法。 16．リアクティブ・レッド・120-アガロース充填物質から画分を回収する工程、 その画分を、コラゲナーゼ、トリプシン及びクロストリパイン活性について、 検定する工程及び 1.24μkat／ｌより大きいコラゲナーゼ活性を有する回収された画分をプール する工程 をさらに含む、請求項10に記載の方法。