CN100368804C - 测定注射剂中高分子量物质含量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种测定注射剂中高分子量物质含量的方法，特别是采用高效液相色谱法测定疏血通注射剂中高分子量物质的含量，用人胰岛素作为参照物，测定分子量大于人胰岛素的物质的含量作为高分子量物质含量。本发明的定量分析方法，具有快速、准确、灵敏度高、干扰少、性能好等特点，可以有效地对注射剂中高分子量物质进行检测和监控，可以用来从源头上控制临床过敏反应的发生，可以取消皮试试验，减轻患者用药的痛苦，节约临床上宝贵的急救时间。
Description
技术领域
本发明涉及一种测定注射剂中高分子量物质含量的方法，特别是采用高效液相色谱法测定注射剂中高分子量物质的含量。
背景技术
含有高分子量物质的注射剂产品，从安全性角度考虑，患者在应用时需要进行皮试试验。但是皮试试验仅能对速发型I型变态反应有预测作用，且阳性符合度仅30％，即使皮试试验阴性也不能说明以后不发生过敏反应，临床可能出现的变态反应还有II、III、IV型变态反应，这是皮试试验无法预测的。
因此，为了确保临床用药的安全有效，对注射剂产品中高分子量物质的含量进行检测，对可能带入的高分子量物质进行有效地监控，从源头上控制了临床过敏反应的发生，既可以节约宝贵的临床急救时间(因注射剂在临床上大多为急救用药，用人体皮试试验过敏方法必然浪费抢救的时间)，同时也增加了临床医护人员与患者的便利性，减轻了患者的用药痛苦，具有非常重要意义。
发明内容
为此，本发明提供了一种测定注射剂中高分子量物质含量的方法。
本发明采用如下技术方案来实现发明目的：
一种测定注射剂中高分子量物质含量的方法，其特征在于用人胰岛素(分子量5800)作为参照物，测定分子量大于人胰岛素的物质的含量作为高分子量物质含量。
可采用高分子量物质测定的一般方法进行测定，例如薄层色谱法、高效液相色谱法、电泳法等。本发明优选采用高效液相色谱法(HPLC)进行测定，用人胰岛素作为参照物，测定分子量大于人胰岛素的物质的含量作为高分子量物质含量；色谱条件可为：色谱柱用凝胶为填充剂，流动相的基本组成为水、有机溶剂和酸，以及紫外检测器，其中所述的有机溶剂为乙腈、甲醇或丙酮等。
本发明所述的注射剂(injection)，是指药物制成的供注入体内的灭菌溶液、乳状液和混悬液以及供临用前配成溶液或混悬液的无菌粉末，例如溶液型注射剂、注射用无菌粉末、注射用浓溶液、混悬型注射剂或乳剂型注射剂。
本发明所述的注射剂中可能含有高分子量物质，其分子量大于人胰岛素分子量5800，例如包含水蛭提取物和/或地龙提取物的注射剂，其中所述的水蛭、地龙可以为干品，也可以为鲜品；而且所述的注射剂也可以为包含水蛭和地龙混合在一起进行提取的提取物。作为本发明优选方案之一，所述的注射剂例如是疏血通注射液。疏血通注射液是从水蛭、地龙中药材中提取有效成分并精制而成的注射剂(例如参见CN1475266A/CN1651079A/CN1660145A)，其含有动物多肽、多糖、氨基酸、次黄嘌呤等物质。
作为本发明一个具体实施方案，本发明提供了一种测定疏血通注射液中高分子量物质的方法，其包括如下步骤：
(1)供试品溶液的制备：精密量取疏血通注射液供试品适量，用流动相制成供试品溶液；
(2)对照品溶液的制备：精密量取人胰岛素适量，用流动相制成对照品溶液；
(3)测定：分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液，注入高效液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，记录色谱图，测定分子量大于人胰岛素的物质的含量。
其中，作为优选方案，所述的高效液相色谱的色谱条件为：色谱柱为凝胶色谱柱(如TSKGEL 2000SWx17.8mm×300mm)，流动相为三氟醋酸-乙腈-水，按体积比，可以为0.025～0.05∶8～30∶70～92，优选为0.025∶30∶70，紫外检测器，检测波长为214±1nm，流速为0.5～0.7ml/min，优选流速为0.7ml/min，理论板数按胰岛素峰计算应不低于5000。通过计算保留时间小于人胰岛素峰保留时间的色谱峰所对应的物质的含量，作为疏血通注射液高分子量物质含量。例如，按照面积归一化法计算，将先于人胰岛素峰(分子量5800)保留时间的峰视为高分子量物质峰，小于人胰岛素峰保留时间的峰的面积之和，占总峰面积的百分比，为高分子量物质的含量。
上述定量分析方法，具有快速、准确、灵敏度高、干扰少、性能好等特点，可以有效地对注射剂中高分子量物质进行检测和监控，可以用来从源头上控制临床过敏反应的发生，可以取消皮试试验，减轻患者用药的痛苦，节约临床上宝贵的急救时间。
附图说明
图1：核糖核酸酶A(分子量13700)色谱图
图2：人胰岛素(分子量5800)色谱图
图3：胸腺肽α1(分子量3108)色谱图
图4：人生长激素释放抑制素(分子量1521)色谱图
图5：四种标准分子量物质混合进样色谱图
图6：五种标准分子量物质混合进样色谱图
图7：疏血通注射液(0212031)色谱图
图8：疏血通注射液(0212051)色谱图
具体实施方式
以下通过实施例进一步说明本发明，但不构成对本发明保护范围的限制。实施例1：高效液相色谱法测定高分子量物质含量
一、试验材料与仪器
1、标准蛋白分子量物质
| 名称 | 分子量 | 批号 | 规格 | 来源 |
| 核糖核酸酶A(Ribonuclease)人胰岛素(Insulin)胸腺肽α<sub>1</sub>(Thymosinα<sub>1</sub>)人生长激素释放抑制素(Somatostatin) | 13700580031081521 | 140653-2003301140654-2003301140655-2003301140656-2003301 | 1mg/支1mg/支1mg/支1mg/支 | 中国药品生物制品检定所 |
2、仪器
可见紫外分光光度计(日本日立U-3210)
高效液相色谱仪Waters 600系统
高效液相色谱仪Agilent Hp1100
3、试剂
三氟醋酸 化学纯(理工大学化工与材料学院)
乙腈 色谱纯(迪马公司)
二、色谱条件
色谱柱：凝胶色谱柱(TSK GEL 2000 SWx1 7.8mm×300mm)；
流动相：三氟醋酸-乙腈-水，按体积比为0.025∶30∶70；
紫外检测器，检测波长为214±1nm；
流速为0.7ml/min。
三、测定
取标准分子量物质，核糖核酸酶A13700，人胰岛素5800，胸腺肽α1 3108，人生长激素释放抑制素1521，色氨酸204，分别加流动相溶解成1mg/ml的浓度，取适量样分析，测定结果见表1和图1～6。
表1线性试验结果
| 分子量 | 13700 | 5800 | 3108 | 1521 | 204 | 线性关系r |
| 单一进样 | 10.74 | 11.90 | 12.36 | 13.42 | -0.9942 | |
| 混合进样 | 10.48 | 11.77 | 12.20 | 13.22 | -0.9924 | |
| 混合进样 | 10.37 | 11.75 | 12.15 | 13.25 | 15.76 | -0.9974 |
试验结果表明，该方法对分子量13700～204范围是呈线性分离的，即以分子量对数为纵坐标，以保留时间为横坐标，用最小二乘法，进行线性回归计算，方程：LogM＝7.7074-0.3422tR，线性关系r＝-0.9974。
实施例2：重复性试验
取人胰岛素标准品适量，加流动相稀释成3个不同浓度，分别测定3次，结果见表2。
表2重复性试验结果
| 浓度测定次数 | 80％ | 100％ | 120％ | 平均值 | RSD | ||||||
| 1 | 2 | 3 | 1 | 2 | 3 | 1 | 2 | 3 | |||
| 保留时间tR | 11.7511.75 | 11.74 | 11.7611.77 | 11.78 | 11.7511.81 | 11.76 | 11.76 | 0.18 | |||
试验结果说明本发明方法重复性非常好。
实施例3：高效液相色谱法测定疏血通注射液中高分子量物质含量
供试品溶液制备：取供试品疏血通注射液(批号0212031和0212051，规格2ml/支，牡丹江友博制药有限责任公司生产)，加流动相稀释5倍，摇匀，作为供试品溶液。
对照品溶液制备：取人胰岛素(分子量5800)适量，用流动相制成每1ml中含0.1mg的溶液，作为对照品溶液。
测定：取对照品溶液及供试品溶液各20ul分别注入高效液相色谱仪中，记录色谱图，将先于胰岛素峰保留时间的峰视为高分子量物质峰，按面积归一化法计算，小于胰岛素峰保留时间的峰面积之和。
结果见表3和图7和8。
表3疏血通注射液高分子量物质的测定结果
| 批号 | 标准规定 | 检验结果 | 结论 |
| 0212031 | 不得过1％ | 未检出 | 合格 |
| 0212051 | 不得过1％ | 0.06％ | 合格 |
实施例4：疏血通注射液不同浓度样品对保留时间测定的影响
取供试品(0212031)，分别加流动相稀释成如下浓度：5倍，8倍，10倍，15倍，20倍，40倍和50倍。按照实施例3所述方法进行测定，结果见表4。
表4浓度对测定的影响
| 稀释倍数峰号 | 5 | 8 | 10 | 15 | 20 | 40 | 50 | 平均值t<sub>R</sub> | RSD％ |
| 1 | 14.14 | 14.12 | 14.11 | 14.09 | 14.09 | 14.08 | 14.12 | 14.11 | 0.15 |
| 2 | 15.05 | 15.02 | 15.03 | 15.02 | 15.01 | 14.98 | 14.97 | 15.01 | 0.19 |
| 3 | 15.78 | 15.62 | 15.61 | 15.60 | 15.60 | 15.78 | 15.53 | 15.65 | 0.62 |
| 4 | 16.28 | 16.36 | 16.34 | 16.33 | 16.33 | 16.31 | 16.30 | 16.32 | 0.16 |
| 5 | 17.44 | 17.59 | 17.63 | 17.62 | 17.62 | 17.60 | 17.60 | 17.59 | 0.37 |
试验结果说明，本发明方法，供试品在用流动相稀释5～50倍后，其测定结果几乎无变化。
实施例5：稳定性试验
取供试品(0212031)，用流动相稀释5倍，室温放置，分别在0、1、2、3、4、5小时注入测定，按照实施例3所述方法进行测定，结果见表5。
表5稳定性试验
| 时间峰号 | 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 平均值 | RSD％ |
| 1 | 14.24 | 14.24 | 14.22 | 14.22 | 14.24 | 14.22 | 14.23 | 0.08 |
| 2 | 15.12 | 15.12 | 15.11 | 15.11 | 15.13 | 15.11 | 15.12 | 0.05 |
| 3 | 15.77 | 15.78 | 15.77 | 15.78 | 15.80 | 15.77 | 15.78 | 0.07 |
| 4 | 16.22 | 16.22 | 16.22 | 16.22 | 16.24 | 16.22 | 16.22 | 0.05 |
| 5 | 17.57 | 17.57 | 17.57 | 17.57 | 17.59 | 17.57 | 17.57 | 0.05 |
| 6 | 19.85 | 20.50 | 21.25 | 21.95 | 19.75 | 20.70 | 20.67 | 4.10 |
试验结果说明，本发明方法在5小时内测定供试品溶液是可靠的。
实施例6：精密度试验
取供试品(0212031)，用流动相稀释5倍，连续进样5次，结果见表6。
表6精密度试验
| 进样次数峰号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 平均值 | RSD％ |
| 1 | 13.592 | 13.584 | 13.573 | 13.571 | 13.563 | 13.577 | 0.08 |
| 2 | 14.847 | 14.840 | 14.834 | 14.836 | 14.834 | 14.838 | 0.04 |
| 3 | 15.491 | 15.486 | 15.485 | 15.487 | 15.484 | 15.487 | 0.02 |
| 4 | 16.095 | 16.095 | 16.094 | 16.099 | 16.099 | 16.096 | 0.02 |
| 5 | 16.391 | 16.389 | 16.387 | 16.391 | 16.390 | 16.390 | 0.01 |
| 6 | 18.802 | 18.809 | 18.817 | 18.827 | 18.833 | 18.818 | 0.07 |
| 7 | 19.298 | 19.307 | 19.310 | 19.323 | 19.324 | 19.312 | 0.06 |
结果表明，本发明方法精密度符合要求。
Claims (8)
1.一种测定注射剂中高分子量物质含量的方法，其特征在于用人胰岛素作为参照物，采用高效液相色谱法测定分子量大于人胰岛素的物质的含量作为高分子量物质含量，色谱条件为：色谱柱用凝胶为填充剂，流动相为三氟醋酸-乙腈-水，按体积比为0.025∶30∶70，用紫外检测器，检测波长为214±1nm，流速为0.5～0.7ml/min。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述的注射剂包含水蛭提取物和/或地龙提取物。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述的水蛭、地龙为干品或者鲜品。
4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其中所述的注射剂包含水蛭和地龙混合在一起进行提取的提取物。
5.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其中所述的注射剂为溶液型注射剂、注射用无菌粉末、注射用浓溶液、混悬型注射剂或乳剂型注射剂。
6.一种测定疏血通注射液高分子量物质的方法，包括如下步骤：
(1)供试品溶液的制备：精密量取供试品适量，用流动相制成供试品溶液；
(2)对照品溶液的制备：精密量取人胰岛素适量，用流动相制成对照品溶液；
(3)测定：分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液，注入高效液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，记录色谱图，测定分子量大于人胰岛素的物质的含量，其中高效液相色谱条件为：色谱柱为凝胶色谱柱，流动相为三氟醋酸-乙腈-水，按体积比为0.025∶30∶70，紫外检测器，检测波长为214±1nm，流速为0.5～0.7ml/min，理论板数按胰岛素峰计算应不低于5000。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述的高效液相色谱的色谱条件为：色谱柱为TSK GEL 2000 SWx1 7.8mm×300mm色谱柱，流动相为三氟醋酸-乙腈-水，按体积比为0.025∶30∶70，紫外检测器，检测波长为214±1nm，流速0.7ml/min，理论板数按胰岛素峰计算应不低于5000。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于计算保留时间小于人胰岛素峰保留时间的色谱峰所对应的物质的含量，作为疏血通注射液高分子量物质含量。
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| CP02 | Change in the address of a patent holder |
Address after: 157013 Heilongjiang province Mudanjiang City Yangming District Yumin Road No. 288 Patentee after: Mudanjiang Youbo Pharmaceutical Co., Ltd. Address before: 157011, 6, culture street, Aimin District, Heilongjiang, Mudanjiang Patentee before: Mudanjiang Youbo Pharmaceutical Co., Ltd. |
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| C56 | Change in the name or address of the patentee | ||
| CP01 | Change in the name or title of a patent holder |
Address after: 157013 Heilongjiang province Mudanjiang City Yangming District Yumin Road No. 288 Patentee after: Mudanjiang Youbo Pharmaceutical Co.,Ltd. Address before: 157013 Heilongjiang province Mudanjiang City Yangming District Yumin Road No. 288 Patentee before: Mudanjiang Youbo Pharmaceutical Co., Ltd. |