CN1313866A - 色谱纯化胰岛素的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种色谱纯化胰岛素的改进方法。本发明的特征在于,压力稳定的聚合物色谱材料用作固定相,以及移动相含有至少一种可与水混溶的有机溶剂和至少一种缓冲剂。此外,本发明的特征在于,pH值为7－11。

Description

色谱纯化胰岛素的方法
本发明涉及一种色谱纯化胰岛素的改进方法。
为了满足极高纯度的要求，除了酶工程法和/或基团工程法外，胰岛素的制备方法主要为色谱法。
术语胰岛素在这里应理解为由天然来源得到的胰岛素或动物或人类来源(例如猪胰岛素、牛胰岛素或人胰岛素)的重组体胰岛素(也就是用基团改性的微生物表达的)、前胰岛素(例如胰岛素前体、前胰岛素)或胰岛素衍生物。
胰岛素衍生物下面规定为天然存在的胰岛素即人胰岛素或动物胰岛素的衍生物，它们与对应的或相同的天然存在的胰岛素的差别在于，至少一个天然存在的氨基酸基团被取代和/或至少一个氨基酸基团和/或有机基团被加入。
人胰岛素为51个氨基酸构成的多肽。所谓的A(酸性)链由21个氨基酸基团组成，而B(碱性)链由30个氨基酸基团组成。在两个氨基酸链中，出现6个半胱氨酸基团，每两个胱氨酸基团通过二硫化物桥相互键联(两个链通过两个半胱氨酸桥相互连接)。在生物活性的人胰岛素中，A和B链通过两个半胱氨酸桥相互键联，而另一桥出现在A链中。在(生物活性的)人胰岛素中，以下的半胱氨酸基团相互连接：
A6-A11
A7-B7
A20-B19。
字母A和B表示特定的胰岛素氨基酸链和由各氨基酸链的氨基到羧基末端计算的氨基酸基团的位置数。
重组体胰岛素的制备通常在发酵和细胞分裂步骤中进行，随后为了纯化产物，进行蛋白质化学和处理工艺过程，通常为色谱过程。
基因工程法使氨基酸序列和/或氨基酸链长与人胰岛素不同的人前胰岛素或胰岛素衍生物的前胰岛素能在微生物中制备。由基因改性的大肠杆菌细胞制备的前胰岛素没有正确链联的半胱氨酸桥。制备已用大肠杆菌正确键联的半胱氨酸桥的人胰岛素的方法例如在EP0055945中公开。制备有正确键联的半胱氨酸桥的人胰岛素和胰岛素衍生物的方法在EP 0600372 A1(US 5473049)和EP 0668292 A2(US5663291)中公开。
首先从细胞中分离出由基因改性的微生物制备的前胰岛素(一种胰岛素前体)，适当地折叠，然后用酶法转化成人胰岛素。除了不希望的副产物外，在酶肽化过程中得到的分裂混合物还含有有价值的物质和不希望的类胰岛素杂质，它们在分子量和其他物理性质方面与有价值的产物没有明显的差别，这就使分离和纯化十分困难，特别是在大型工业生产规模上。
纯化工艺过程为一系列各种色谱法(例如吸附色谱、离子交换色谱、反相高压色谱或其组合)；在某些情况下，使用不同载体材料的许多阶段；在某些情况下，使用随后的晶化过程，实际的纯化用色谱达到。在这种情况下，类胰岛素杂质的除去在离子交换剂或反相氧化硅载体上发生。
最后的精加工(除去很微量的杂质，作为最后的纯化阶段)通常在高压范围使用色谱法在反相硅胶(RP-HPLC=反相高压液相色谱)上进行。
反相(即亲脂改性的，也就是憎水的)硅胶应理解为憎水基质已涂覆在上面的氧化硅材料。憎水基质的例子是链长为C3-C20、特别是C4-C18的烷烃。粒度为10-50微米，孔径为50-300埃。
根据现有技术，使用RP-硅胶(亲脂改性的硅胶)的色谱法的例子是EP0 547 544 A2(US 5621073)或EP 0474213 A1(US 5245008)。根据现有技术，只有使用反相硅胶才能满足制备高纯度胰岛素的要求。但是，反相硅胶的使用有一些严重的缺点：
反相硅胶仅在pH值2-10的范围内才是稳定的。在发酵产物的色谱分离中，总是含有高分子量的副产物，它们被牢固地吸附，不能用常规的洗脱法脱附。这些副产物随时间延长在RP硅胶上不断浓缩(称为吸附剂老化)。通常只能用氢氧化钠稀溶液清洗进行再生和适当清理(CIP)。因此，在每一CIP过程中，一部分RP硅胶被破坏，它们不断的更换是费用很高的。而且在硅胶上还存在胰岛素变性的危险。
替换以氧化硅为基础的RP硅胶的许多努力是已知的。使用基于氧化铝或二氧化钛的RP材料(两种材料不完全是pH值稳定的，但至少比硅胶更稳定)的努力表明，分离是不充分的和所要求的有关纯度的技术规格不能达到。
色谱材料的另一必要的性质是压力稳定性。压力稳定的聚合物色谱材料应理解为这样的有机聚合物颗粒物(它们可为所有可能的形式，例如棒形，碎片形或优选球形，其直径优选为10-35微米)。它们在压力(一直到70巴)作用下的变形仅是很微小的。在色谱柱中的材料必需如此好地装填，以致没有空腔存在(装填的质量决定分离的结果)。对于色谱柱的装填来说，原则上已知两种不同的技术，它们也可组合使用。用(通常用液压操作的)臂压制填料的方法(DAC=直接轴向压制)或用高压泵按水力学方法装填色谱柱，即将液体和颗粒物的悬浮液压入色谱柱的方法。在这两种情况下，为了能尽可能紧密装填颗粒物和不产生空腔，实践表明必需有直到70巴的压力作用在色谱柱的截面上。
许多有机聚合物颗粒物不是压力稳定的，在压力作用下它们发生变形，球形物变成扁平的盘形物，它们重叠起来，阻止物流通过填料。相比，反相硅胶是相当硬的，在上述压力下难以变形。
本发明的目的是提供一种在适合的色谱材料上色谱纯化胰岛素的方法，所述的色谱材料是压力稳定的，可用于整个1-14的pH值范围，该法得到这样的高分离效率，以致为了达到所需的胰岛素纯度、同时提高这一纯化步骤的产率，只需要一段、而不是现有技术常用的一个或多个串联的色谱段。
用这样一种胰岛素色谱纯化方法来达到这一目的，该法的特点在于，压力稳定的有机聚合物色谱材料用作固定相，而移动相含有至少一种可水混溶的有机溶剂和至少一种缓冲剂物质，以及pH值为7-11。
令人吃惊的是，已发现用pH值范围为7-11、即碱性范围的色谱法、在压力稳定的有机聚合物色谱材料上可达到很好的分离。pH值优选为9-10。
本发明的方法的一个特别的好处在于，在这一碱性pH值范围，去酰氨胰岛素的生成受到抑制，它是通常在酸性介质中生成的一种杂质，根据胰岛素制备的技术规格，应将它除去，达到很低的残留量。
用于洗脱的移动相含有可水混溶的有机溶剂，例如C1-C4醇、酮、乙酸甲酯或乙腈。优选的醇例如为1-或2-丙醇(正丙醇或异丙醇)、甲醇或乙醇。可水混溶的有机溶剂的浓度为1-90％(体积)、优选10-50％(体积)。
为了使洗脱液的pH值保持不变，移动相还含有缓冲剂物质。适合的缓冲剂物质例如为磷酸盐、碱金属盐或碱土金属盐(例如柠檬酸钠或乙酸钾)、柠檬酸铵、乙酸铵、硫酸铵或氯化铵。
通过加入盐酸或氢氧化钠溶液来调节pH值。
洗脱可恒稳态(isocratically)进行，也就是其中具有恒定的缓冲物质浓度和恒定的有机溶剂比例或优选线性梯度的有机溶剂比例，即溶剂比例递增。
压力稳定的有机聚合物色谱材料的平均粒度优选为5-300微米、更优选10-50微米。粒度越小，分离越清晰、越好。但是，较小颗粒的压力稳定性较低。
胰岛素是相对小的多肽(分子量约6000)，并可毫无问题地扩散到直径为10纳米的孔中(无空间阻碍)。小孔径的材料更适合，因为其比表面积大，因此吸附容量更大。压力稳定的有机聚合物色谱材料的平均孔径优选为5-500纳米、更优选10-50纳米。
对于本发明的方法来说，优选由聚苯乙烯/二乙烯基苯或聚甲基丙烯酸酯组成的压力稳定的有机聚合物色谱材料是特别适用的。可商购的压力稳定的有机聚合物色谱材料的例子列入表1，它们优选用于本发明的方法。
表1：可商购的色谱材料
    制造商     商品名 材料 最小粒度[微米] 孔径[纳米]
 TosoHassPharmaciaPerseptiveMitsubishiBiosepraMacherey & NagdPolymer Laborabries AmberchromeSourcePorosCHP20PRPC PolyBioNucleogelPLRP  PMAStDVBStDVBStDVBStDVBStDVBStDVB     35151035102010-15     100100200100301010
PMA=聚甲基丙烯酸酯StDVB=苯乙烯/二乙烯基苯
本发明的方法适用于分析色谱、半制备色谱、特别是制备色谱。术语“制备色谱”应理解为在工业规模上制备纯产品。
为了达到胰岛素制剂所需的纯度，加入至少一个另外的反相色谱或离子交换色谱，如果需要，在反相色谱以前加入晶化步骤是必需的，例如EP 0547544 A2(US 5621073)或EP 0474213 A1(US 5245008)所述。在本发明的方法中，用聚合物载体上的单段色谱达到相同的结果。使用本发明的方法，因为将几个工艺段组合成一段减少了产率损失，所以胰岛素制剂的总产率大大提高。
本发明的方法适用于本文开始所引定义的所有胰岛素的色谱纯化，即天然来源得到的胰岛素或动物或人类来源(例如猪胰岛素、牛胰岛素或人胰岛素)的重组体胰岛素(即基因改性的微生物表达的)、前胰岛素(例如胰岛素前体、前胰岛素)或胰岛素衍生物，胰岛素衍生物应理解为天然存在的胰岛素、即人胰岛素或动物胰岛素的衍生物，它们与对应或相同的天然存在的胰岛素的差别在于，至少一个天然存在的氨基酸基团被取代和/或至少一个氨基酸基团和/或有机基团被加入。
这样的胰岛素的例子是人胰岛素、牛胰岛素、猪胰岛素、EP0368187(US 5656722)的胰岛素，例如Gly(A21)、Arg(B31)、Arg(B32)人胰岛素、EP 0821006(ZA 97/6645)的胰岛素或EP 0547544 A1(US 5621073)、EP 0474213 A1(US 5245008)、EP 0600372 A1(US5473049)或EP 0668292(US 5663291)中公开的胰岛素。(字母A和B表示各胰岛素氨基酸链、天然存在的氨基酸基团位置数，它被括号前给出的氨基酸基团代替。)
实施例
实施例1：pH值的变化
在实施例1中，在直径10毫米和长120毫米的半制备色谱柱上进行试验，所述色谱柱装有PLRP-S 10-15μm 100A(PolymerLaboratories)。其目的是按这样的方式纯化其纯度为95％(面积)的预纯化的胰岛素，以使纯度大于98.5％(面积)。
这样调节加入的数量，以致聚合物色谱材料的负荷为6克/升床层体积。加入的缓冲剂和移动相为水/丙醇混合物，含有0.05M乙酸铵和0.1M甘氨酸，用盐酸或NaOH调节到各自的pH值。空管速率为150厘米/小时。调节到三个pH值：pH值3.5、pH值6.8、pH值9。按各馏分收集洗脱液。
表2列出结果。只有在pH值为9下才能达到98％(面积)以上的纯度，从而满足技术规格要求。可清楚地看到，在聚合物色谱材料上胰岛素的纯化只有在碱性介质中才有所需的效率。
表2：使用聚合物色谱材料PLRP-S 10-15 100在不同pH值下胰岛素
的纯度和浓度
pH3.5  pH6.8  pH9
馏分 纯度[面积％] 浓度[毫克/毫升] 纯度[面积％] 浓度[毫克/毫升] 纯度[面积％] 浓度[毫克/毫升]
 1     95.22     0.236     92.74     0.565
 2     96.74     0.449     94.68     0.196     96.70     1.310
 3     96.69     0.690     94.84     0.274     98.59     1.362
 4     97.43     1.020     95.38     0.454     99.54     2.020
 5     97.39     1.240     96.84     1.120     98.99     2.230
 6     97.14     1.330     97.95     2.236     99.24     1.730
 7     96.07     1.250     97.82     3.140     98.80     1.340
 8     94.94     1.120     97.64     3.120     98.46     1.200
 9     93.30     0.974     97.12     2.080     97.28     0.960
实施例2：压力稳定性和色谱柱的装填
用DAC(直接轴向压制)技术来装填色谱柱(ProchromLC50、直径50毫米)。将色谱材料(固定相)加到100％甲醇中，并装在色谱柱中。在各种流速下测量正丙醇混合物的压力损失为11％。色谱柱的装填压力在5-80巴之间变化。
研究了以下的色谱材料：PLRP-S 10-15 100(Polymer Laboratories)Source15 RPC(Amersham Pharmacia Biotech)Kromesil13-120(Akzo Nobel)
这些材料有近似相同的颗粒直径(球形颗粒物)。PLRP和Source为聚合物；Kromasil为高等级级RP硅胶。
表3：丙醇/水混合物的压力损失(巴/厘米)
    装填压力5巴     装填压力20巴     装填压力40巴 装填压力80巴
 厘米/小时 PLRP Source PLRP Source PLRP Source Kromasil
    50100150  0.310.621.00     0.400.801.50  0.320.721.04     0.851.853.14  0.501.081.67     3.336.339.33     0.51.01.6
1巴/厘米的比压力损失意味着在30厘米高的填料中压降为30巴，它是在工业色谱中常见的。
实施例3：按制备规模纯化人胰岛素
3个实施例描述如下，其中人胰岛素在工业色谱柱中纯化，该色谱柱按DAC原理用可移动臂装填。使用Prochrom色谱柱，LC50型。对于所有的实验来说，每一情况的填料都有相同的尺寸：直径50毫米，床层长110-120毫米。
纯度为95％(面积)的人胰岛素将达到大于98.5％(面积)的纯度。
使用三种色谱载体：PLRP-S 10-15 100(Polymer Laboratories)Source15 PRC(Amersham PHarmacia Biotech)KromasilC4 13-120 (Akzo Nobel)
正如在实施例2中描述的，PLRP和Source为聚合物，而Kromasil为高级硅胶载体。
加入的缓冲剂和移动相对应于实施例1的详细内容。负荷以克人胰岛素/升床层体积表示。产率应理解为纯度大于98.5％(面积)的洗脱液的比率。
表4：人胰岛素制备纯化中的产率
    载体     负荷 pH值 装填压力 产率
PLRP-S 10-15 100Source15 RPCKromasilC4 13-120 6克/升床层体积6克/升床层体积6克/升床层体积     993.5     40巴25巴80巴     60％73％68％
在表4中比较了所达到的产率。对于约12厘米的床层长度来说，60-70％的数值令人吃惊地好。现有技术(使用硅胶载体的纯化，在这种情况下为Kromasil)和使用聚合物载体的色谱分离之间的重大差别是pH值差别：这一水平的产率仅能在pH值为9下达到。
实施例4：块胰岛素(bolus insulin)以制备规模的纯化
在这一实施例中，块胰岛素(快速作用的胰岛素)被纯化。此外这一实施例还打算证明甚至相对差的质量可容许作为这一色谱阶段的起始条件。现有技术的作法是，胰岛素的最后纯化通常在两个色谱阶段进行。如果最后的精加工段直接送入质量差的材料，即严重污染了的材料，那么不再能同时达到所需的纯度和高产率。
令人吃惊的是，现在发现，所研究的聚合物材料在单一色谱步骤中可达到这一纯度，这可能归因于10-15微米的小颗粒直径和极好的吸附性质。
用以下起始条件进行了4个试验：
75％(面积)纯度
85％(面积)纯度
89％(面积)纯度
93％(面积)纯度
在表5中，包括达到的产率(即所用的胰岛素比率，其纯度大于98.5％(面积))。如果起始条件只有75％(面积)，那么不能达到大于98.5％(面积)的纯度。纯度仅为98.0％(面积)。
但是，如果起始条件大于85％(面积)，那么能可靠地达到大于98.5％(面积)的所需纯度，产率为60-80％。
制备条件如实施例1中所述。所有的试验都在直径50毫米和填料高度12厘米的ProchromLC50型色谱柱中进行。在每一情况下负荷为6克/升床层体积，pH值调节到9，装填压力为35巴。
表5：不同质量的块胰岛素的纯化
    载体 起始条件的纯度，％(面积)     产率(纯度大于98.5％(面积)
    RLRP-S 10-15 100PLRP-S 10-15 100PLRP-S 10-15 100PLRP-S 10-15 100     75％(面积)85％(面积)89％(面积)93％(面积)     0％64％73％73％
由表5可很容易看出，色谱分离中的产率如何随起始条件的质量而提高。这些试验清楚地表明，在单一色谱段中纯化的确是可能的。

Claims (19)

1．一种色谱纯化胰岛素的方法，其中压力稳定的有机聚合物色谱材料用作固定相，移动相含有至少一种可水混溶的有机溶剂和至少一种缓冲剂物质，以及pH值为7-11。
2．根据权利要求1的方法，其中pH值为9-10。
3．根据权利要求1或2的方法，其中可水混溶的有机溶剂为C1-C4醇。
4．根据权利要求3的方法，其中醇为1-丙醇或2-丙醇。
5．根据权利要求3的方法，其中醇为乙醇。
6．根据权利要求3的方法，其中醇为甲醇。
7．根据权利要求2的方法，其中可水混溶的有机溶剂为酮。
8．根据权利要求2的方法，其中可水混溶的有机溶剂为乙酸甲酯。
9．根据权利要求2的方法，其中可水混溶的有机溶剂为乙腈。
10．根据权利要求1-9中一项或多项的方法，其中可水混溶的有机溶剂在移动相中的浓度为1-90％(体积)。
11．根据权利要求10的方法，其中可水混溶的有机溶剂在移动相中的浓度为10-50％(体积)。
12．根据权利要求1-11中一项或多项的方法，其中洗脱恒稳态地进行。
13．根据权利要求1-11中一项或多项的方法，其中用可水混溶的有机溶剂的线性增加的梯度浓度进行洗脱。
14．根据权利要求1-13中一项或多项的方法，其中压力稳定的有机聚合物色谱材料的平均粒度为5-300微米。
15．根据权利要求14的方法，其中平均粒度为10-50微米。
16．根据权利要求1-15中一项或多项的方法，其中压力稳定的有机聚合物色谱材料的平均孔径为5-500纳米。
17．根据权利要求16的方法，其中平均孔径为10-50纳米。
18．根据权利要求1-17中一项或多项的方法，其中压力稳定的有机聚合物色谱材料由聚甲基丙烯酸酯组成。
19．根据权利要求1-17中一项或多项的方法，其中压力稳定的有机聚合物色谱材料由聚苯乙烯/二乙烯基苯组成。
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