CZ300604B6

CZ300604B6 - Zpusob chromatografického cištení inzulinu

Info

Publication number: CZ300604B6
Application number: CZ20010646A
Authority: CZ
Inventors: Sievers@Werner; Bicker@Richard; Desch@Dieter; Eysmondt@Jörg Von; Keller@Reinhold; Richard@Frank
Original assignee: Sanofi - Aventis Deutschland GmbH
Priority date: 1998-08-24
Filing date: 1999-08-11
Publication date: 2009-06-24
Also published as: CN1198843C; DE59914580D1; HUP0103325A2; CN1313866A; ZA200101096B; BR9913092A; RU2222546C2; DE19838097A1; US6710167B1; HK1039130A1; KR100703578B1; CY1107877T1; PL201880B1; CA2341355A1; HU227753B1; DK1107988T3; EP1107988A2; HUP0103325A3; CZ2001646A3; TR200100634T2

Abstract

Je popsán zlepšený zpusob cištení inzulinu, který spocívá v tom, že se jako stacionární fáze používá organický polymerní chromatografický materiál pro chromatografii na reverzní fázi stabilní na tlak, mobilní fáze pro eluci obsahuje alespon jedno organické rozpouštedlo mísitelné s vodou a nejméne jeden pufr a hodnota pH ciní 7 až 11.

Description

Způsob chromatografického čištění inzulínů

Oblast techniky

Vynález se týká zlepšeného způsobu chromatografického čištění inzulínů.

Dosavadní stav techniky

Aby byly splněny extrémně vysoké požadavky na čistotu, vyznačují se postupy výroby inzulínů v podstatě vedle enzymatických nebo/a gentechnických způsobů chromatografíckými způsoby.

Pod pojmem inzulíny se zde rozumí inzulíny pocházející z přírodních zdrojů nebo rekombinantní inzulíny (to znamená exprimované geneticky modifikovanými mikroorganismy) zvířecího nebo lidského původu (například prasečí inzulín, hovězí inzulín nebo humánní inzulín), proinzuliny (například prekurzory inzulínu, preinzuliny) nebo deriváty inzulínu.

Jako deriváty inzulínu jsou označovány následující deriváty přírodně se vyskytujících inzulínů, totiž humánního inzulínu nebo zvířecích inzulínů, které se liší substitucí alespoň jednoho přírodně se vyskytujícího esteru aminokyseliny nebo/a adicí alespoň jednoho zbytku aminokyseliny nebo/a organického zbytku odpovídajícího, jinak stejného, přírodně se vyskytujícího inzulínu.

Humánní inzulín je polypeptid, který je vybudován z 51 aminokyselin. Tak zvaný A (kyselý) řetězec sestává z 21, B (bazický) řetězec z 30 zbytků aminokyselin. U obou řetězců aminokyselin se vyskytuje 6 cysteinových zbytků, přičemž jsou vždy dva cysteinové zbytky spolu spojeny přes disulfidový můstek (oba řetězce jsou spolu spojeny dvěma cysteinovými můstky). V biologicky aktivním humánním inzulínu jsou A- a B-řetězce spolu spojeny přes dva cysteinové můstky a další můstek jev A-řetězci. Následující cysteinové zbytky jsou spolu spojeny v (biologicky účinném) humánním inzulínu:

A6-A11

A7-B7

A20-B19

Písmena A nebo B označují příslušné řetězce inzulínové aminokyseliny, číslice označují polohu zbytku aminokyseliny, která se počítá od aminového konce ke karboxylovému konci příslušného řetězce aminokyseliny.

Výroba rekombinantního inzulínu probíhá obvykle ve stupních fermentace a otevření buněk, následovaných protein-chemickými a technologickými výrobními postupy, obvykle chromatografíckými procesy čištění produktu.

Gentechnícké způsoby umožňují vyrábět lidský proinzulin nebo proínzulín (proinzulin od derivátů inzulínu), který má jednu aminosekvenci nebo/a délku řetězce aminokyseliny odlišnou od humánního inzulínu, v mikroorganizmech. Proinzuliny vyrobené geneticky pozměněnými buňkami Escherichia colí nemají žádné korektně spojené cysteinové můstky. Způsob získávání humánního inzulínu s korektně spojenými cysteinovými můstky je známý například z EP 0 055 945. Zlepšené způsoby výroby humánního inzulínu a derivátů inzulínu s korektně spojenými cysteinovými můstky jsou popsány v EP 0 600 372 Al (US 5 473 049) a v EP 0 668 292 A2 (US 5 663 291).

Proinzulin vyrobený geneticky modifikovanými mikroorganizmy, prekurzor inzulínu, se nejdříve izoluje z buněk, korektně se složí a pak se enzymaticky přemění na humánní inzulín. Štěpná směs, vzniklá při enzymatických peptizačních procesech, obsahuje vedle nežádoucích vedlejších

-1 CZ 300604 B6 produktů také cennou látku jakož i nežádoucí doprovodné látky podobné inzulínu, které se od cenného produktu neliší zřetelně ani molekulovou hmotností ani jinými fyzikálními vlastnostmi, což značně ztěžuje dělení a čištění právě ve velkoprovozním měřítku.

Provozně technické postupy pro vyčištění jsou různé, za sebou zařazené chromatografieké způsoby (například adsorpční chromatografie, ionexová chromatografie, vysokotlaká chromatografie s obrácenými fázemi nebo jejich kombinace), částečně ve více stupních s různými nosnými materiály, zčásti s navazující krystalizaci, přičemž se vlastní vyčištění dosahuje chromatografií. K oddělení doprovodných látek podobných inzulínu dochází přitom na iontoměníčích nebo na nosičích na bázi silikagelu s obrácenými fázemi.

Konečné oddělení nejmenších nečistot jako poslední stupeň čištění se obvykle provádí v oblasti vysokého tlaku pomocí chromatografie na silikagelu s obrácenými fázemi (RP-IIPLC = Reversed Phase High Pressure Liquid Chromatography = vysokotlaká kapalinová chromatografie s obrácenými fázemi).

Pod pojmem silikagel s obrácenými fázemi (to znamená lipofílně modifikovaný, tedy hydrofobní silikagel) se rozumí křemičitanový materiál, na který byla nanesena hydrofobní vrstva. Pro hydrofobní vrstvu se použijí například alkany s délkou řetězce o 3 až 20 atomech uhlíku, zejména o 4 až 18 atomech uhlíku. Velikosti zrn leží v rozmezí 10 až 50 pm, velikosti pórů v rozmezí 50 až 300 . 10 ¹⁰ m.

Jako příklady chromatografických způsobů, které používají podle stavu techniky silikagely s obrácenými fázemi (lipofílně modifikované silikagely), je možno jmenovat postupy podle

EP 0 547 544 A2 (US 5 621 073) nebo EP 0 474 213 Al (US 5 245 008). Podle stavu techniky mohou být splněny vysoké požadavky na čistotu inzulínů, které mají být vyrobeny, pouze použitím silikagelu s obrácenými fázemi. Použití silikagelu s obrácenými fázemi však má značné nevýhody.

Silikagely s obrácenými fázemi jsou v rozmezí od pH 2 do pH 10 stabilní. Při chromatografii fermentačních produktů se získají vždy vy sokomo leku lární vedlejší produkty, které jsou nevýhodně absorbovány a obvyklou eluci nemohou být desorbovány. Vedlejší produkty se časem obohacují na silikagelu s obrácenými fázemi (hovoří se o stárnutí adsorbčního prostředku). Regenerace, popřípadě čištění na místě (ClP-cleaning in plače) se většinou daří jen promýváním zře35 děným louhem sodným. Tím se při každém postupu CIP rozruší část silikagelu s obrácenými fázemi, jehož stálé nahrazování je velmi nákladné. Dále existuje pro inzulíny na silikagelech denaturační nebezpečí.

Je známa řada pokusů, jak nahradit silikagely s obrácenými fázemi na bázi silikátů. Pokusy s materiálem s obrácenými fázemi na bázi oxidu hlinitého nebo oxidu titaničitého (oba materiály nejsou zcela pH-stabilní, ale alespoň stabilnější nežli silikagel) ukázaly, že dělení je pouze nedostatečné a že požadované specifikace, popřípadě čistoty nelze dosáhnout.

Další nutnou vlastností chromatografických materiálů je jejich stabilita vůči tlaku. Pod pojmem polymerní chromatografieké materiály stabilní vůči tlaku se rozumí částice (které se mohou vyskytovat v nejrůznějších formách, jako ve formě tyčinek, ve formě zlomků nebo s výhodou v kulové formě a s výhodou mají průměr mezi 10 a 35 pm) organických polymerů, jejichž deformace pod tlakem (až 7 MPa) je jen malá. Materiál vyskytující se v chromatografieké koloně musí být tak dobře naplněn, aby nebyly přítomné žádné dutiny (kvalita plnění rozhoduje o výsledku dělení). K plnění kolon jsou v zásadě známé dvě rozdílné techniky, které mohou být použity i v kombinaci. Existuje metoda, pomocí níž se pomocí pístu (většinou hydraulicky ovládaného) náplň stlačí (DAC = Direct Axial Compression - přímé axiální stlačení), popřípadě se kolona hydrodynamicky naplní pomocí vysokotlakého čerpadla, to znamená suspenze kapaliny a částic se do kolony vtlačí. V obou případech ukazuje praxe, že na průřez kolony musí působit tlaky až

7 MPa, aby částice mohly být naplněny pokud možno hustě a bez vznikajících dutin.

-2CZ 300604 B6

Mnohé částice organických polymerů nejsou stabilní na tlak a deformují se působením tlaku natolik, že se z kuliček stanou ploché destičky, které se překrývají a zamezují průtoku náplní. Naproti tomu jsou silikagely s obrácenými fázemi samy o sobě podstatně tvrdší a téměř se půso5 bením laku nedeformují.

Podstata vynálezu

Vynález si klade za úkol poskytnout způsob chromatografického čištění inzulínů na vhodných chromatografických materiálech, které by byly stabilní vůči tlaku a byly by použitelné v celém rozsahu pH od 1 do 14, čímž by se dosahoval tak vysoký dělicí výkon, že k docílení potřebné čistoty inzulínu při současném zvýšení výtěžku by byl místo obvyklých dvou nebo více po sobě zařazených chromatografických stupňů podle dosavadního stavu techniky zapotřebí pouze jediný dělicí stupeň.

Tento úkol je vyřešen způsobem chromatografického čištění inzulínů, který spočívá v tom, že se použije jako stacionární fáze organický polymerní chromatograficky materiál stabilní vůči tlaku, mobilní fáze obsahuje nejméně jedno s vodou mísítelné organické rozpouštědlo a nejméně jeden pufr a hodnota pH činí 7 až 11.

Neočekávaně bylo zjištěno, že se chromatografií v rozmezí pH od 7 do 11, tedy v bazickém rozmezí, dosáhne velmi dobrého rozdělení na organických polymemích chromatografických materiálech. Hodnota pH činí s výhodou 9 až 10.

Zvláštní výhoda způsobu podle vynálezu spočívá v tom, že v tomto bazickém rozmezí pH je potlačena tvorba amidoinzulinu, vedlejšího produktu, který obvykle vzniká v kyselém prostředí a který se podle specifikaci inzulínových přípravků musí oddělit na velmi malá zbytková množství.

Mobilní fáze, které se použijí pro eluci, obsahují organická rozpouštědla mísitelná s vodou, jako například alkoholy, které obsahují 1 až 4 atomy uhlíku, ketony, methylacetát nebo aeetonitril. Výhodné jsou alkoholy jako například 1-propanol nebo 2-propanol (n- nebo iso propanol), methanol nebo ethanol. Koncentrace organických rozpouštědel mísitelných s vodou činí I až

90 % objemových, s výhodou 10 až 50 % objemových.

Mobilní fáze obsahují dále pufr, aby se hodnota pH elučního prostředku udržela na konstantní hodnotě. Vhodné pufry jsou například fosfáty, alkalické soli nebo soli alkalických zemin, jako citrát sodný nebo aeetát draselný, citrát amonný, aeetát amonný, síran amonný nebo chlorid amonný.

Nastavení hodnoty pH se dosahuje přídavkem kyseliny solné nebo touhu sodného.

Eluce může být provedena isokraticky, to znamená s konstantní koncentrací pufrů nebo s kons45 tantním podílem organického rozpouštědla nebo s výhodou s lineárním gradientem, tedy se zvyšováním podílu rozpouštědla.

Průměrná velikost částic organického polymemího chromatografického materiálu by měla činit s výhodou 6 až 300 μτη, s výhodou 10 až 50 pm. Čím menší je velikost částic, tím ostřejší a lepší bude dělení. Ovšem stabilita vůči tlaku je u menších částic menší.

Inzulín je relativně malý polypeptid (molekulová hmotnost přibližně 6000) a může bez problémů difundovat do pórů o průměru 10 nm (žádná stérická zábrana). Materiály s malými průměry pórů jsou vhodnější, protože specifický povrch a tím adsorpění kapacita je větší. Průměrná velikost

-3 CZ 300604 B6 pórů organického polymerního chromatografícké ho materiálu stabilního vůči tlaku činí účelně 5 až 500 nm, s výhodou 10 až 50 nm.

Pro způsob podle vynálezu jsou zvláště vhodné organické polymerní chromatografícké materiály 5 stabilní vůči působení tlaku, které jsou s výhodou tvořeny póly sty rendi viny 1 benzenem nebo polymethakrylátem. Příklady obchodně běžných organických polymemích chromatografických materiálů, stabilních vůči tlaku, které mohou být použity při způsobu podle vynálezu, jsou shrnuty v tabulce 1.

Tabulka 1

Obchodně běžné chromatografícké materiály

Výrobce	Obchodní název	Materiál	Nejmenší velí” kost částic (pm)	Průměr póru (nm)
TosoHaas	Amberchrome^R	PMA	35	100
Pharmacia	Source^R	StDVB	15	100
Perseptive	Poros*	StDVB	10	200
Mitsubishi	CHP20 P*	StDVB	35	100
Biosepra	RPCPolyBio*	StDVB	10	30
Macherey + Nagel	Nucleogel*	StDVB	20	10
Polymer La boratories	- PLRP*	StDVB	10-15	10

PMA = polymethakrylát StDVB = styrendivinylbenzen

Způsob podle vynálezu se hodí pro analytickou, pro sem i preparativní a zejména pro preparativní chromatografií. Pod pojmem „preparativní chromatografie“ se rozumí výroba čistých produktů v technickém měřítku.

Aby byla docílena čistota potřebná pro inzulínové přípravky, je třeba předřadit chromatografií s obrácenými fázemi, například podle EP 0 547 544 A2 (US 5 621 073) nebo EP 0 474 213 Al (US 5 245 008), nejméně jednu další chromatografií s obrácenými fázemi nebo katexovou chromatografii a popřípadě krystalizační operaci. Při způsobu podle vynálezu se dosahuje stejného účinku sjednostupňovou chromatografií na polymerním nosiči. Způsobem podle vynálezu se tedy celkový výtěžek při výrobě inzulínu podstatně zlepšuje, protože spojením více stupňů procesu do jednoho stupně odpadají ztráty na výtěžku.

Způsob podle vynálezu se hodí k chromatografícké mu čištění všech inzulínů podle shora uvedené definice, totiž inzulínů pocházejících z přírodních zdrojů nebo rekombinantních inzulínů (tj. exprimovaných geneticky modifikovanými mikroorganizmy), inzulínů zvířecího nebo lidského původu (například prasečího inzulínu, zvířecího nebo lidského původu (například prasečího inzu35 línu, hovězího inzulínu nebo humánního inzulínu), proinzulinů (například prekurzorů inzulínu, preinzulinů) nebo inzulínových derivátů, přičemž se pod pojmem inzulínové deriváty rozumí deriváty přírodně se vyskytujících inzulínů, totiž humánních inzulínů nebo zvířecích inzulínů,

-4CZ 300604 B6 které se liší substitucí alespoň jednoho zbytku přírodně se vyskytující aminokyseliny nebo/a adicí nejméně jednoho zbytku aminokyseliny nebo/a organického zbytku odpovídajícího, jinak stejného přírodně se vyskytujícího inzulínu.

Jako příklady pro takové inzulíny je možno jmenovat humánní inzulín, hovězí inzulín, prasečí inzulín, inzulíny podle EP 0 368 187 (US 5 656 722), například Gly(A21), Arg(B31), Arg(B32)~ humánní inzulín, inzulíny podle EP 0 821 006 (ZA 97/6645) nebo inzulíny popsané v EP 0 547 544 Al (US 5 621 073), EP 0 474 213 Al (US 5 245 008), EP 0 600 372 Al (US 5 473 049) nebo v EP 0 668 292 (US 5 663 291) (písmena A a B představují příslušný řetě10 zec aminokyseliny inzulínu, číslo znamená polohu zbytku přírodně se vyskytující aminokyseliny, které je nahrazen zbytkem aminokyseliny uvedené před závorkou.)

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1: Obměny hodnoty pH

V příkladu 1 byly provedeny pokusy na semipreparativní koloně o rozměrech 10 mm v průměru a 120 mm délky, která byla naplněna PLRP 10 až 15 pm 100A (Polymer Laboratories). Účelem bylo vyčistit předčištěný inzulín, který měl čistotu 95 % (podle plochy odpovídajícího píku chromatogramu) tak, aby jeho čistota byla větší 98,5 %.

Požadované množství bylo tak nastaveno, aby zatížení polymerního chromatografí ckého mate25 riálu činilo 6 g/litr (objem kolony). Pufr a mobilní fáze jsou směsi vody a propanolu s 0,05 m amoniumacetátu a 0,1 m glycinu, které byly upraveny pomocí NaOH na příslušnou hodnotu pH. Rychlost prázdné kolony činila 150 cm/hodina. Byly nastaveny tri hodnoty pH 3,5 -pH 6,8 pH 9. Eluát byl jímán po frakcích.

V tabulce 2 jsou znázorněny výsledky. Pouze při pH 9 se dosahují čistoty přes 98 % a tím se splňují specifikace. Jednoznačně je zřejmé, že čištění inzulínu na polymemích chromatografí ckých materiálech vykazuje účinnost pouze v bazickém prostředí.

-5 CZ 300604 B6

Tabulka 2

Čistota a koncentrace inzulínu při různých hodnotách pH s polymemím chromatografie kým 5 materiálem PLRP-S 10-15 100

	PH 3,	5	PH	6,8	pH	9
Frakce	č i stota	konc .	č i stota	konc .	Č i stota	konc .
	(*)^x	(mg/ml)	(%)*	(mg/ml)	(%)^x	(mg/ml)
1			95,22	0,236	92,74	0,565
2	96,74	0,449	94,68	0,196	96,70	1,310
3	96,69	0,690	94,84	0,274	98,59	1,362
4	97,43	1,020	95,38	0,454	99,54	2,020
5	97,39	1,240	96,84	1,120	98,99	2,230
6	97,14	1,330	97,95	2,236	99,24	1,730
7	96,07	1,250	97,82	3,140	98,80	1,340
8	94,94	1,120	97,64	3,120	98,46	1,200
9	93,30	0,974	97,12	2,080	97,28	0,960

*podle plochy odpovídajícího píku chromatogramu

Příklad 2

Stabilita vůči tlaku a naplnění kolony 15

Chromatografícká kolona (Prochrom^RLC50, o průměru 50 mm) byla naplněna DAC (Direct Axial Compression) - Technik. Chrom atografický materiál (stacionární fáze) byl dodán v 100% methanolu a naplněn do kolony. Při různých rychlostech průtoku byla změřena ztráta tlaku 11% směsí n-propanolu. Tlak pístu chromatografické kolony se pohyboval mezi 5 a 8 MPa.

Zkoušeny byly následující chromatografické materiály:

PLRP-S 10-15 100^R (Polymer Laboratories)

Source^R 15 RPC (Amersham Pharmacia Biotech)

Kromasil^R 13-120 (Akzo Nobel)

Materiály mají přibližně stejný průměr částic (sférické Částice). PLRP^r jsou polymery, Kromasil^Rje vysokohodnotný RP-sílikagel.

-6CZ 300604 B6

Tabulka 3

Ztráta tlaku v MPa/cm směsi propanol/voda

	Tlak pístu	Tlak pístu 2 MPa	Tlak 4 MPa	pístu	Tlak pístu 8 MPa
0,5	MPa
cm/h	PLRP^R	Source^H	PLRP^fl	Source^R	PLRP^R	Source^R	Kromasi1^R
50	0,31	0,40	0,32	0,85	0,50	3,33	0,5
100	0,62	0,80	0,72	1,85	1,08	6,33	1,0
150	1,00	1,50	1,04	3,14	1,67	9,33	1,6

Specifická ztráta tlaku 0,1 MPa/cm znamená pokles tlaku 3 MPa v 30 cm vysoké náplni, cožje v technické ehromatografii obvyklé.

io

Příklad 3

Čištění humánního inzulínu v preparativním měřítku

Dále jsou popsány celkem 3 příklady, ve kterých je humánní inzulín čištěn v technické koloně, která je podle principu DAC plněna posuvným pístem. Je použita kolona Prochrom^R, typ LC50. Pro všechny pokusy má náplň stejný průměr 50 mm, délku kolony 110 až 120 mm.

Humánní inzulín o čistotě 95 % (podle plochy odpovídajícího píku chromatogramu) by měl být přiveden na čistotu větší 98,5 %.

Byly použity tři chromatografické nosiče:

PLRPS 10-15 100^R (Polymer Laboratories)

Source^R 15 RPC (Amersham Pharmacia Biotech)

Kromasil^R 13-120 (Akzo Nobel)

Jak je již popsáno v příkladu 2, jsou PLRP a Source^T polymerní materiály, zatímco KromasiI^R je vysoce hodnotný nosič na bázi RP-silikagelu.

Pufr a mobilní fáze odpovídají údajům v příkladu 1. Náplň je uvedena v gramech humánního inzulínu na litr objemu kolony. Jako výtěžek se rozumí podíl eluátu, který má čistotu větší

98,5 %.

-7 CZ 300604 B6

Tabulka 4

Výtěžek při preparativním čištění humánního inzulínu

Nos 1 č	Náplň	pH	Tlak pístu	Výtěžek
FLRP-S 10-15 100«	6 g/l BV	9	4 mPa	60	%
Source* 15 RFC	5 g/l BV	9	2,5 MPa	73	%
Kromasil” C4 13-120	6 g/l BV	3,5	8 MPa	68	%

V tabulce 4 jsou proti sobě postaveny docílené výtěžky. Hodnoty od 60 do 70 % jsou pro délku kolony asi 12 cm překvapivě dobré. Rozhodující rozdíl mezi stavem techniky (čištění silikagelo10 vým nosičem, zde Kromasilem^R) a chromatografií s polymerním nosičem je rozdíl pH. Pouze při hodnotě pH 9 jsou dosažitelné tak vysoké výtěžky.

Příklad 4

Čištění jednorázového inzulínu v preparativním měřítku

V tomto příkladu měl být vyčištěn jednorázový inzulín (Fast-Aeting-Insulin). Příklad má kromě toho demonstrovat, že jako výchozí materiály pro tuto chromatografickou operaci jsou přípustné i horší kvality. Podle stavu techniky se konečné čištění inzulínu obvykle provádí ve dvou chromatografických stupních. Pokud se konečný stupeň naplní přímo špatným, to znamená silně znečištěným materiálem, není již možno dosáhnout požadovaných čistot a současně vysokých výtěžků.

S překvapením bylo nyní zjištěno, že zkoušený polymemí materiál tuto čistotu dosahuje v jediném chromatografickém stupni, což je umožněno malým průměrem částic od 10 do 15 pm a vynikajícími adsorpčními vlastnostmi.

Byly provedeny čtyři pokusy s následujícími výchozími stavy:

%* čistoty 85 %^x čistoty 89 %* čistoty 93 %^x čistoty *podle plochy odpovídajícího píku chromatogramu

V tabulce 5 jsou uvedeny jednotlivé výtěžky (tj. příslušný podíl použitého inzulínu, který byl eluován s čistotou větší 98,5 %). Pokud výchozí stav byl pouze 75 %, nedocílí se nikdy čistota přes 98,5 %. Čistota je v oblasti pouze 98,0 %.

Pokud však výchozí stav je přes 85 %, dosáhnou se spolehlivě požadované hodnoty vyšší 98,5 %, při výtěžcích mezi 60 a 80 %.

-8CZ 300604 B6

Preparativní podmínky byly popsány v příkladu 1. Všechny pokusy byly provedeny v koloně Prochrome^R typ LC50 o průměru 50 mm a o výšce náplně 12 cm. Náplň byla vždy 6 g/1 BV, hodnota pH byla upravena na 9 a tlak pístu byl 3,5 MPa.

Tabulka 5

Čištění jednorázových inzulínů různé jakosti

Nos i č	Čistota v vu v	'ýchoz í ho sta-	Výtěžek (Čistota vyš
ší 98,5	** )
PLRP-S	10-15	100«	75	%	0	%
PLRP-S	10-15	100«	85	*	64	%
PLRP-S	10-15	100«	89	%	73	%
PLRP-S	10-15	100«	93	%	73	%

*podle potřeby odpovídajícího píku chromatogramu

Z tabulky 5 je dobře vidět, jak v závislosti na jakosti výchozího stavu přibývá výtěžek chroma15 tografie. Pokusy ukazují jednoznačně, že čištění v jediném stupni je bezpečně možné.

Claims

20 PATENTOVÉ NÁROKY

1. Způsob chromatografíckého čištění inzulínů, vyznačující se tím, že se jako stacionární fáze použije organický polymerní chromatografický materiál pro chromatografii na

25 reverzní fázi stabilní vůči tlaku, mobilní fáze pro eluci obsahuje nejméně jedno organické rozpouštědlo mísitelné s vodou a nejméně jednu pufrovaeí látku a pH je 7 až 11, částice chromatografického materiálu sestávají z organických polymerů, jejichž deformace při působení tlaku až do 7 MPa je pouze mírná.
2. Způsob podle nároku 1, v y z n a č uj í c í se t í m . že pH má hodnotu 9 až 10.
3. Způsob podle kteréhokoli z nároků 1 nebo 2, vyznačující se tím, že organickým rozpouštědlem mísitelným s vodou je alkohol obsahující 1 až
4 atomy uhlíku.

35 4. Způsob podle nároku 3, vyznačující se tím, že alkoholem je 1-propanol nebo 2propanol.
5. Způsob podle nároku 3, v y z n a Č u j í c í se t í m , že alkoholem je ethanol.

40
6. Způsob podle nároku 3, vyznačující se tím, že alkoholem je methanol.
7. Způsob podle nároku 2, vyznačující se tím, že organickým rozpouštědlem mísitelným s vodou je keton.

-9CZ 300604 B6
8. Způsob podle nároku 2, vyznačující se tím, že organickým rozpouštědlem mísitelným s vodou je methylacetát.
9. Způsob podle nároku 2, vyznačující se t í m , že organickým rozpouštědlem mísi5 telným s vodou je acetonitril.
10. Způsob podle jednoho nebo více nároků laž9, vyznačující se tím, že koncentrace organického rozpouštědla mísitelného s vodou v mobilní fázi je 1 až 90 % objemových.

io
11. Způsob podle nároku 10, vyznačující se tím, že koncentrace organického rozpouštědla mísitelného s vodou v mobilní fázi je 10 až 50 % objemových.
12. Způsob podle jednoho nebo více nároků 1 až 11, vyznačující se tím, že se eluce provádí isokraticky.
13. Způsob podle jednoho nebo více nároků 1 až 11, vyznačující se tím, že se eluce provádí za použití lineárně se zvyšujícího gradientu podílu organického rozpouštědla mísitelného s vodou.

20
14. Způsob podle jednoho nebo více nároků 1 až 13, vyznačující se tím, že organický polymemí chromatograficky materiál stabilní vůči tlaku má průměrnou velikost částic 5 až 300 pm.
15. Způsob podle nároku 14, vyznačující se tím, že průměrná velikost částic je 10 až

25 50 pm.
16. Způsob podle jednoho nebo více nároků 1 až 15, vyznačující se tím, že průměrná velikost pórů organického polymemího chromatografického materiálu stabilního vůči tlaku je 5 až 500 nm,
17. Způsob podle nároku 16, vyznačující se tím, že průměrná velikost pórů je 10 až 50 nm.
18. Způsob podle jednoho nebo více nároků 1 až 17, vyznačující se tím, že

35 organický polymemí chromatografický materiál stabilní vůči tlaku obsahuje polymethakrylát.
19. Způsob podle jednoho nebo více nároků 1 až 17, vyznačující se tím, že organický polymemí chromatografický materiál stabilní vůči tlaku obsahuje polystyren/divinylbenzen.