FI98216C - Menetelmä insuliinien puhdistamiseksi kromatografisesti - Google Patents
Menetelmä insuliinien puhdistamiseksi kromatografisesti Download PDFInfo
- Publication number
- FI98216C FI98216C FI914150A FI914150A FI98216C FI 98216 C FI98216 C FI 98216C FI 914150 A FI914150 A FI 914150A FI 914150 A FI914150 A FI 914150A FI 98216 C FI98216 C FI 98216C
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- insulin
- buffer
- group
- glycine
- process according
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/62—Insulins
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Steroid Compounds (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Treatment Of Liquids With Adsorbents In General (AREA)
- Medicines Containing Plant Substances (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Description
98216
Menetelmä insuliinien puhdistamiseksi kromatografisesti
Keksintö koskee menetelmää insuliinin ja/tai insu-liinijohdannaisten puhdistamiseksi kromatografoimalla ve-5 sipitoisissa, puskuroiduissa liuottimissa, jotka sisältävät veteen sekoittuvia orgaanisia liuottimia, käyttäen lipofiilisesti modifioitua silikageeliä.
Analyyttisistä erotusmenetelmistä tunnetaan insuliinien tai insuliinijohdannaisten puhdistus lipofiilises-10 ti modifioiduilla käänteisfaasi-silikageeleillä ja menetelmää on käytetty monien vuosien ajan menestyksekkäästi korkeapainenestekromatografiässä (HPLC) (WS Welinder et ai., J. Chrom., 361 (1986) 357 - 367). Analyyttisessä mittakaavassa mikrogramma-alueella olevia proteiinimääriä 15 laitetaan modifioidulla silikageelillä täytettyyn teräksestä, lasista tai muovista valmistettuun pylvääseen ja sen jälkeen eluoidaan virtaavalla nesteseoksella (useimmiten happamia, vesipitoisia puskuriliuoksia, joissa on vakiona pysyvät tai vaihtelevat orgaaniset liuotinpitoisuu-20 det). Proteiinikuormitus on tällöin paljon pienempi kuin 30 pg/ml pylvään tilavuudesta.
Tähänastisissa puhdistusmenetelmissä käytetään tavallisesti hyväksi laboratoriossa käytettyjä - suhteellisen myrkyllisiä - liuottimia (asetonitriili) ja syövyttä-25 viä, kalliita puskurikomponentteja, esimerkiksi tetra-al-kyyliammoniumsuoloja, alkyylisulfonaatteja, heksafluoria-setonia, trifluoriasetaattia (E.P. Kroeff et ai., J. Chrom. 461 (1989) 45 - 61) . Käytettäessä voimakkaammin in-suliininkaltaisten aineiden likaamia seoksia nämä ajoli-30 uokset eivät johda tyydyttävään preparatiiviseen erotukseen, kun otetaan huomioon laatu, pääkomponenttien saanto ja kokonaistalteenotto (J. Rivier, R. McClintock, J. Chrom. 268 (1983) 112 - 119; Peter et ai., J. Chrom. 408 (1987) 43 - 52).
98216 2
Aiemmista kemiallisista reaktioista kuten esimerkiksi voimakkaasti happamista esterilohkaisuista tai ent-symaattisista (trans-)peptidointiprosesseista, kiteyttämällä suoritetuista puhdistuksista yms. saadut insuliinit 5 sisältävät yleensä myös samankaltaisia ominaisuuksia omaa-via aineita. Ne voidaan puhdistaa ioninvaihtokromatografi-an avulla valitsemalla tietyt pH-arvot, jos sähköiset va-rauserot ovat riittävät (US 4 129 560). Tämän menetelmän haittana on laimennusvaikutus ja siten arvokkaiden aines-10 ten häviäminen yllä oleviin nesteisiin saostusprosessien yhteydessä, suhteellisen pitkä kiertoaika tai se, että kokonaistalteenotto ja siten saanto on pieni.
Preparatiiviset erotukset voidaan periaatteessa toteuttaa suurentamalla pylvään sisällön määrää, kuormi-15 tusmäärää ja eluentin virtausta. Tähän tarvittavat orgaaniset liuotinmäärät ovat esimerkiksi käytettäessä pylväitä, joiden halkaisijat ovat yli 20 cm, kuutiometrien luokkaa. Analyyttiseen HPLC:hen käytettävät liuottimet (esimerkiksi asetonitriili, DMF, metanoli, dioksaani jne.) 20 ovat myrkyllisiä, joten näiden menetelmien käyttö prepara-tiivisessa tuotantomittakaavassa vaatii kalliita suojatoimenpiteitä.
Tämän keksinnön tehtävänä oli kehittää sellainen menetelmä insuliinien ja insuliinijohdannaisten kromato-25 grafiseksi puhdistamiseksi, jossa insuliinien biologinen teho säilyy, saavutetaan kromatografointivaihetta kohti suuri puhtaus, lyhyet kiertoajat, pylväiden kestoiäksi yli 50 käyttökertaa, stationaarisen silikageelifaasin rege-nerointi ilman aikaa vieviä pakkaustapahtumia ja myrkyttö-30 mien liuottimien käyttö, niin että preparatiivinen tuotan-tomittakaava on mahdollinen.
Nyt keksittiin menetelmä, jonka avulla insuliini ja insuliinijohdannaiset voidaan puhdistaa kromatografisesti vesipitoisissa, puskuroiduissa liuottimissa, jotka sisäl-35 tavat veteen sekoittuvia orgaanisia liuottimia, käyttäen 98216 3 lipofiilisesti modifioitua silikageeliä ja jolle on tunnusomaista, että puskuroiduissa liuottimissa on liuenneena kahtaisioneja tai liuotinseoksen pH-arvo on korkeintaan yhden pH-yksikön puhdistettavan insuliinin tai insu-5 liinijohdannaisen isoelektrisen pisteen ala- tai yläpuolella ja siinä on kahtaisioneja, jolloin kahtaisioneina käytetään «-amino- happoja tai betaiineja pitoisuudessa 10 mmol/1 - 1 mol/1.
Yllättävästi kahtaisionien läsnäolo tai kromatogra-10 fointi liuottimen pH-arvossa, joka on lähellä puhdistettavan insuliinin tai insuliinijohdannaisen isoelektristä pistettä, ja kahtaisionien läsnäolo eivät aiheuta vain arvotuotteiden ja epäpuhtauksien hyvää erottumista, vaan myös proteiinien hyvän irtoamisen stationaarisesta faasis-15 ta (lipofiilisesti modifioitu silikageeli). Saavutetut erotukset mahdollistavat jopa insuliinin kaltaisilla komponenteilla voimakkaasti likaantuneiden insuliiniliuosten puhdistamisen, kuten esimerkiksi A21-desamidoinsuliinin erottamisen insuliinista ja insuliinijohdoksista. Lisäksi 20 proteiinien edullisen kiinteästä faasista irtoamisen ansiosta saavutetaan pylväiden pakkauksille pitkät kestoiät ja mahdollistetaan insuliinien suuri kokonaistalteenotto.
Keksintö koskee siten menetelmää insuliinin ja/tai insuliinijohdannaisten puhdistamiseksi kromatografoimalla 25 vesipitoisissa, puskuroiduissa liuottimissa, jotka sisältävät veteen sekoittuvia orgaanisia liuottimia, käyttäen lipofiilisesti modifioitua silikageeliä, jolle menetelmälle on tunnusomaista, että puskuroiduissa liuottimissa on liuenneena kahtaisioneja tai liuotinseoksen pH-arvo on 30 korkeintaan yhden pH-yksikön puhdistettavan insuliinin tai insuliinijohdannaisen isoelektrisen pisteen ala- tai yläpuolella ja siinä on kahtaisioneja, jolloin kahtaisioneina ' käytetään «-amino- happoja tai betaiineja pitoisuudessa 10 mmol/1 - 1 mol/1.
4 98216
Keksinnön mukaisessa menetelmässä voidaan käyttää kaikkia insuliineja, kuten esimerkiksi kaikkia insuliini-lajeja, jotka ovat ihmis- tai eläinalkuperää, insuliinin esiasteita, kuten esimerkiksi proinsuliineja tai preproin-5 suliineja, tai insuliinien tai insuliinijohdannaisten yh distelmiä, joita geneettisesti modifoidut mikro-organismit ilmentävät. Lisäksi voidaan käyttää myös insuliinijohdannaisia, joita on valmistettu käyttäen esimerkiksi kemiallista tai entsymaattista johdannaisen valmistusta, esimer-10 kiksi Des-Phe-Bl-insuliini, insuliini-p-keteenisulfonaat-
ti, diarginiini-insuliini(B31, B32), monoarginiini-insu-liini tai difenyylialaniini-insuliini(B31, B32) (US
4 601 852).
Edullisesti käytetään insuliinijohdannaisia, joilla 15 on kaava I
S-S A21 -!_I_
H- A-ketju Asn —QH
| |
S S
20 I I {I) B2 | |_B29 Y— Vai B-ketju Ly s —R30-Xn jossa 25 R30 tarkoittaa geneettisesti koodattavissa olevan L-aminohapon ryhmää, X tarkoittaa hydroksyyliryhmää, fysiologisesti vaaratonta orgaanista emäksisen luonteen omaavaa ryhmää, jossa on korkeintaan 50 C-atomia, geneettisesti koodattavissa 30 olevaa L-aminohappoa, jossa mahdollisesti mukana pääteryhmänä oleva karboksyyliryhmä voi olla vapaa, esteriryhmänä, amidiryhmänä, laktonina tai ryhmäksi CH2OH pelkistyneenä, n tarkoittaa kokonaislukua 0 - 10, Y on vety tai L-fenyylialaniini 35 ja A- ja B-ketju ovat eläin- tai ihmisinsuliinin sekvenssejä.
|S Iti'! Bitti 1 1 ! It· 98216 5
Erityisen edullisesti käytetään insuliini johdannaisia, joilla on kaava I, jossa R30 tarkoittaa L-alaniinia tai L-treoniinia ja X tarkoittaa yhtä tai useampaa L-aminohappoa ryh-5 mästä L-arginiini, L-lysiini tai L-fenyylialaniini.
Insuliineja ja insuliinijohdannaisia voidaan käyttää sekä suhteellisen epäpuhtaana että esipuhdistettuna (esimerkiksi geelikromatografiän avulla). Insuliinissa on vielä monta kertaa suoritetun kiteytyksen ja myös geeli-10 kromatografoinnin jälkeen jäljellä epäpuhtautena hyvin samanlaisen molekyylipainon omaavia insuliinin kaltaisia aineita, jotka eroavat sopivasti valitulla pH-arvolla va-raustilansa suhteen toisistaan ja insuliinista, mutta muodostavat insuliinin kanssa komplekseja (US 4 129 560) . 15 Esimerkkejä sellaisista aineista ovat deamidoinsuliinit, arginiini- ja diarginiini-insuliini, insuliinietyyliesteri ym.
Lipofiilisesti modifioidulla silikageelillä tarkoitetaan silikageeliä, jolle on levitetty hydrofobinen mat-20 riisi. Esimerkkejä hydrofobisesta matriisista ovat alkaanit, joiden ketju koostuu 3-20 hiiliatomista. Erityisen edullisia lipofiilisesti modifioituja silikageelimateriaa-leja ovat esimerkiksi:
Nucleosil , valmistaja Macherey & Nagel: pallomai-25 siä ja ei pallomaisia, vaihtelavan, korkeintaan 45 pm:n hiukkaskoon omaavia materiaaleja, huokoskoko 100 Ä, C8- ja Cl8-modifioitu.
Lichroprep , valmistaja Merck: ei pallomaisia ja pallomaisia, vaihtelevan, korkeintaan 40 pm:n hiukkaskoon 30 omaavia materiaaleja, huokoskoko 60 - 250 Ä, C8-C18-modi-fioitu;
Lichrospher Select B , valmistaja Merck: pallomainen materiaali, jonka hiukkaskoko korkeintaan 25 pm, C8-modifoitu; 35 Waters Prep®, C18-modifioitu, 50 - 105 pm, ei pal lomainen, huokoskoko 100 A; 98216 6
Zorbax ProlO®^ valmistaja DuPont: C8-modifioitu, 10 pm, pallomainen, huokoskoko 100 A;
Kromasil®, valmistaja EKA Nobel: C4-, C8-Cl8-modi-fioitu, korkeintaan 16 pm, pallomainen, huokoskoko 100, 5 150 tai 200 A.
Kahtaisionit ovat yhdisteitä, jotka voivat sitoa ja . myös vapauttaa protoneja, eli ne muodostavat happamassa liuoksessa kationeja ja emäksisessä liuoksessa anioneja, kuten esimerkiksi a-aminohapot, betaiini tai betaiinijoh-10 dokset. Edullisia kahtaisioneja käytettäväksi tämän keksinnön mukaisesti ovat glysiini, glutamiini tai betaiini (N-trimetyyliglysiini). Erityisen edullinen on glysiini.
Insuliinin tai insuliinijohdannaisen isoelektrinen piste (IEP) on sellainen insuliinin liuoksen pH-arvo, jos-15 sa liuotetun insuliinin kationisten varausten ja anionis-ten varausten lukumäärä on nolla. Esimerkiksi sianinsulii-nin IEP on pH-välillä 5,3 - 5,4 (H. Neurath, K. Bailey, Protein Hormones, Voi. II/A, The Proteins, s. 636). Keksinnön mukaisesti käsitteellä "lähellä isoelektristä pis-20 tettä" tarkoitetaan erityisesti pH-arvoja, jotka ovat noin yhden pH-yksikön verran puhdistettavan insuliinin IEP:n ylä- tai alapuolella. Erityisen edullisia ovat pH-arvot, jotka ovat korkeintaan 0,5 pH-yksikköä IEP:n ylä- tai alapuolella.
25 Eluentit sisältävät puskuriainetta eluentin pH-ar- von pitämiseksi vakiona. Sopivia puskuriaineita tunnetaan kirjallisuudesta, esimerkiksi fosfaatit, alkali- tai maa-alkalimetallisuolat, kuten natriumsitraatti tai kaliumase-taatti, ammoniumsitraatti, -asetaatti, -sulfaatti tai 30 -kloridi. Lisäksi eluentit sisältävät veteen sekoittuvia orgaanisia liuottimia, kuten esimerkiksi alkoholeja, keto-neja, metyyliasetaattia, dioksaania, dimetyylisulfoksidia tai asetonitriiliä. Edullisia ovat alkoholit, kuten n- tai isopropanoli, metanoli, etanoli tai metyyliasetaatti.
98216 7
Veteen sekoittuvien orgaanisten liuottimien pitoisuus on 1 - 90 %, edullisesti 10 - 60 I, erityisen edulli-‘ sesti 10 - 35 %. Puskuriaineen pitoisuus on 1 mmol/1 - 2 mol/1 liuottimena käytetyn veden suhteen, edullisesti 5 25 mmol/1 - 1 mol/1. Kahtaisionien pitoisuus voi liikkua laajalla alueella. Edulliset määrät ovat välillä 10 mmol/1 - 1 mol/1 liuottimena käytetyn veden suhteen, edullisesti välillä 20 mmol/1 - 500 mmol/1.
Lämpötila kromatografoinnin aikana on välillä 0 -10 50 °C, edullisesti välillä 15 - 30 °C, erityisen edulli sesti välillä 15 - 20 °C. Käyttöpaine kromatografoinnin aikana on suurin piirtein vakio. Kromatografointi voidaan suorittaa erilaisissa paineissa, esimerkiksi paineessa 5 -400 bar, erityisesti 20 - 100 bar.
15 Pylväiden täyttö, insuliinien ja insuliinijohdan naisten kromatografointi ja eluointi suoritetaan käyttäen tunnettuja, tavanomaisia, teknisiä menetelmiä. Pylvään täyttö puhdistettavalla insuliiniliuoksella suoritetaan edullisesti käyttäen vesipitoista, alkoholipitoista tai 20 pelkästään vesipitoista puskuriliuosta. Insuliiniliuoksen proteiiniosuus on välillä 1 - 10 %, edullisesti 3 %.
Insuliinien eluointi suoritetaan keksinnön mukaisella menetelmällä käyttäen puskuroivien aineiden vakiopi-toisuutta (isokraattinen) tai muuttamalla veteen sekoittu-25 van orgaanisen liuottimen osuutta puskurissa. Orgaanisen liuottimen osuuden muuttaminen suoritetaan siten, että käytetyn orgaanisen liuottimen pitoisuus kohoaa eluointi-tilavuudesta riippuen, ja edullisesti riippuvuus on lineaarinen .
30 Insuliinin erottaminen kromatografoinnin jälkeen eluaateista tapahtuu saostamalla sinkillä tai kiteyttämällä. Tällöin liuoksesta on joko etukäteen poistettu suurimmaksi osaksi liuotin alipainetislauksen avulla tai sen pitoisuutta on pienennetty laimentamalla vedellä. Joka 35 tapauksessa liuottimen pitoisuuden tulisi olla ennen saos- 98216 8 tusta tai kiteytystä noin 10 % tai sitä pienempi, jotta proteiinipitoisuus pysyisi päällä olevassa nesteessä pienempänä kuin 50 mg/1. Syntyneet puhtaat insuliinisaostumat voidaan eristää dekantoimalla, sentrifugoimalla tai suo-5 dattamalla ja kuivata.
Keksinnön mukainen menetelmä ei sovi vain analyyttiseen kromatografiaan, vaan myös preparatiiviseen kroma-tografiaan, erityisesti jos keksinnön mukainen menetelmä toteutetaan preparatiivisella HPLC-laitteistolla.
10 Käsitteellä "preparatiivinen kromatografia" tarkoi tetaan puhdistusmenetelmää, jossa tarkoituksena on saada puhtaita tuotteita eikä vain suorittaa analyysi. Puhtaiden tuotteiden määrä voi vaihdella laajoisa rajoissa, esimerkiksi 1 mg - 50 kg, edullisesti välillä 50 mg - 15 kg.
15 Seuraavissa esimerkeissä keksinnön mukaista mene telmää kuvataan yksityiskohtaisesti. Prosenttiluvut on ilmoitettu painon suhteen, mikäli toisin ei ole ilmoitettu.
Esimerkki 1 20 Puskuri A: 0,2 M ammoniumsulfaatti, 0,1 M glysiini, 0,05 M natriumsitraatti, pH 5,5, pelkkä vesiliuos;
Puskuri B: 0,1 M ammoniumsulfaatti, 0,1 M glysiini, 0,05 M natriumsitraatti, pH 5,5, vesi/n-propanoli suhteessa 1:1.
25 Sorbenssi: Nucleosil C18, 15 - 25 pm, pallomainen, huokoskoko 100 Ä, valmistaja Machery & Nagel, Diiren;
Pylvään mitat: 40 mm x 250 mm.
Pylvään täyttö suoritetaan käyttäen 3,5 g ihmisin-suliinia (HI), jota on saatu käyttäen ihmisinsuliini-B30- 30 di-tert.butyyli-esteri/eetterin trifluorietikkahappoloh-kaisua ja jossa proteiinin osuus on 79,1 I. Insuliinin eluointi suoritetaan siten, että puskuriliuos A ja B sekoitetaan käyttäen sekoituslaitteistolla varustettua korkeapa inepumppua, niin että saadaan propanoligradientti 14 35 - 20 %. Insuliinin eluointi suoritetaan noin arvolla 17,5 % propanolia 23 min:n kuluttua, kun pumpataan 46 ml/min.
98216 9
Kiteisen ihmisinsuliinin (HI) fraktioinnin ja eristyksen jälkeen saadaan tuote, joka sisältää pääfraktiossa 97 % proteiinia, jolloin pääfraktion saanto on 88,5 I, ja sivufraktiossa saanto on 7,5 % ja proteiinin osuus 85,7 %.
5 Syötetyn insuliinin kokonaistalteenotto on siten 96,0 %.
Esimerkki 2
Puskuri A: 0,1 M ammoniumsulfaatti, 0,1 M glysiini, 0,025 M natriumsitraatti, pH 5,5, pelkkä vesiliuos;
Puskuri B: 0,05 M ammoniumsulfaatti, 0,1 M glysii-10 ni, 0,025 M natriumsitraatti, pH 5,5, vesi/n-propanoli suhteessa 1:1.
Sorbenssi: Nucleosil C18-P, 15 - 25 pm, pallomainen, huokoskoko 100 Ä, valmistaja Macherey & Nagel;
Pylvään mitat: 40 mm x 250 mm.
15 Pylvään täyttö suoritetaan käyttäen 7,0 g ihmisin- suliinia (HI) (proteiinin osuus 86,1 %), jota on saatu käyttäen ihmisinsuliini-B30-di-tert.butyyli-esteri/eette-rin esterilohkaisua, 3-prosenttisena liuoksena 0,1 M gly-siini/HCl-puskurissa, pH 2,8, korkeapainepumpun avulla. 20 Sen jälkeen suoritetaan eluointi edellä kuvatuilla puskuriliuoksilla paineen avulla käyttäen n-propanoligradient-tia. 60 min:n aikana propanolipitoisuus nousee arvosta 14 % arvoon 17,5 %. Edellä kuvatulla tavalla suoritetun fraktioinnin ja kiteytyksen jälkeen saadaan tuotetta, jossa 25 proteiinin osuus on 98,7 %. Puhdistetun ihmisinsuliinin saanto on 91 % käytetystä insuliinista.
Esimerkki 3
Puskuri A: 0,1 M ammoniumsulfaatti, 0,1 M glysiini, 0,025 M natriumasetaatti, pH 5,5, pelkkä vesiliuos; 30 Puskuri B: 0,05 M ammoniumsulfaatti, 0,1 M glysii ni, 0,025 M natriumasetaatti, pH 5,5, vesi/n-propanoli suhteessa 1:1.
Sorbenssi: Lichrospher Select B, C8, 15 - 25 pm, huokoskoko 60 Ä, valmistaja Merck; 35 Pylvään mitat: 50 mm x 250 mm.
98216 10
Pylvään täyttö suoritetaan käyttäen liuosta, joka sisältää 10 g reaktioseosta, joka on saatu sianinsuliinin amidoinnista trypsiinillä, liuotettuna 200 ml:an 0,1 M glysiini/HCl-puskuria, pH 2,8. 120 min:n aikana käyttäen 5 virtausta 40 ml/min ja kohottamalla propanolipitoisuus arvosta 14 % arvoon 30 % eluoidaan yksittäiset proteiinikom-ponentit erilleen. Kiteytyksen tai saostuksen ja kuivauksen jälkeen saadaan pääfraktiona ihmisinsuliini-B30-di-tert.butyylitreoniiniesteri/eetteriä, jonka puhtaus on yli 10 97 % ja saanto 93 % käytetyn insuliinin suhteen.
Esimerkki 4
Puskuri A: 0,1 M natriumkloridi, 0,1 M glysiini, 0,025 M natriumasetaatti, pH 5,5, pelkkä vesiliuos;
Puskuri B: 0,05 M natriumkloridi, 0,1 M glysiini, 15 0,025 M natriumasetaatti, pH 5,5, vesi/n-propanoli suh teessa 1:1.
Sorbenssi: Zorbax ProlO, C8, 10 pm, valmistaja
DuPont.
Pylvään mitat: 5 cm x 25 cm.
20 Pylvääseen pumpattiin 7,5 g ihmisinsuliinia (HI), jota on saatu käyttäen ihmisinsuliini-B30-di-tert.butyyli-treoniiniesteri/eetterin trifluorietikkahappolohkaisua, 100 ml:ssa 0,1 M glysiini/HCl-liuoksessa ja sitä eluoitiin käyttäen virtausta 80 ml/min. Puskurin B pitoisuus kohosi 25 60 min:n aikana arvosta 18 % arvoon 25 %. Retentioaika (Rt) oli tällöin n. 37 min. Pääfraktiosta voitiin eristää kiteytyksen ja kuivauksen jälkeen 96,8 % käytetystä HI:stä, jolloin puhtaus.oli yli 97 %, sivufraktio sisälsi 2,2 % HI:a, jonka puhtaus oli alle 50 %.
30 Esimerkki 5
Puskuri A: 0,2 natriumsulfaatti, 0,1 M glysiini, 0,03 M ammoniumasetaatti, pH 5,5, 10 % metyyliasetaattia;
Puskuri B: 0,05 M natriumsulfatti, 0,1 M glysiini, 0,03 M ammoniumasetaatti, pH 5,5, 20 % metyyliasetaattia. 35 Sorbenssi: Kromasil C8, 13 pm, huokoskoko 100 Ä, valmistaja EKA Nobel.
n 98216
Pylvään mitat: 5 cm x 25 cm.
Pylvääseen, joka oli tasapainotettu 30 prosentilla puskuria B, johdettiin 8 g naudaninsuliinia litraa kohti pylvään tilavuutta käyttäen apuna 0,1 M glysiini/HCl-pus-5 kuria. 90 minin aikana B-puskuripitoisuus kohosi arvoon 80 % (= 18 % metyyliasetaattia); naudaninsuliini eluoitiin 65 min:n kuluttua, jolloin pääfraktion puhtaus oli yli 97,5 % (saanto 63,5 %), ja vedellä laimennuksen jälkeen suoritettiin saostus sinkkikloridilla. Kokonaistalteenotto oli 10 92,5 %.
Esimerkki 6
Puskuri A: 0,1 M ammoniumsulfaatti, 0,1 M glysiini, 0,025 M natriumasetaatti, pH 5,5, 5 % n-propanolia;
Puskuri B: 0,05 M ammoniumsulfaatti, 0,1 M glysii-15 ni, 0,025 M natriumasetaatti, pH 5,5, vesi/n-propanoli suhteessa 1:1.
Sorbenssi: Kromasil C8, 13 pm, huokoskoko 100 Ä, valmistaja EKA Nobel.
Pylvään mitat: 5 cm x 25 cm.
20 Pylväs täytettiin 4 g:11a (= 8 g/1) ihmisinsulii- nia, joka oli saatu käyttäen ihmisinsuliini-B30-di-tert.-butyylitreoniiniesteri/eetterin trifluorietikkahappoloh-kaisua, jolloin puhtaus oli n. 92 %. Käyttäen puskurin B gradienttia 18 - 25 % 90 min:n ajan ihmisinsuliini eluoi-25 tiin 45 min:n kuluttua, jolloin pääfraktion puhtaus oli yli 97 % (saanto 91,8 %) ja sivufraktion 80,5 % (saanto 4,7 %) .
Esimerkki 7
Puskuri A: 0,1 M ammoniumsulfaatti, 0,1 M glysiini, 30 0,026 M natriumasetaatti, pH 5,5, 10 % n-propanolia; • Puskuri B: 0,05 M ammoniumsulfaatti, 0,1 M glysii ni, 0,025 M natriumasetaatti, pH 5,5, vesi/n-propanoli suhteessa 1:1.
Sorbenssi: Kromasil C8, 13 pm, huokoskoko 100 Ä, 35 valmistaja EKA Nobel.
12 98216
Pylvään mitat: 10 cm x 40 cm.
Pylvääseen laitettiin 18 g sianinsuliinia 1,8 l:ssa 0,1 M glysiini/HCl-puskuria, pH 3,0, käyttäen 5 % n-pro-panolia. Gradientti muuttui 9 prosentista puskuria B (= 5 13,6 % n-propanolia) 11 prosenttiin puskuria B (= 14,4 % n-propanolia) 70 min:n aikana. Sianinsuliini eluoitiin 50 min:n kuluttua, jolloin proteiinin pitoisuus pääfraktiossa oli yli 98 % (saanto 89 %). Kokonaistalteenotto oli 96,8 % käytetystä insuliinista.
10 Esimerkki 8
Puskuri A: 0,2 M ammoniumkloridi, 0,1 M glysiini, 0,025 M natriumsitraatti, 5 % n-propanolia, pH 5,5;
Puskuri B: kuten puskuri A, mutta lisätty 50 % n-propanolia.
15 Sorbenssi: Kromasil C8, 13 pm, huokoskoko 100 A, valmistaja EKA Nobel, Ruotsi.
Pylvään mitat: 50 mm x 250 mm.
4 g geeniteknisesti valmistettua ihmisinsuliinia (proteiinin määrä 89,5 1) liuotetaan 0,1 M glysiinipusku-20 riin, pH 3,0, 2-prosenttiseksi proteiiniliuokseksi ja pumpataan korkeapainepumpun avulla pylvääseen. Eluointi suoritetaan käyttäen n-propanolin lineaarista gradienttia 13 - 16 % 70 min:n ajan virtauksen ollessa 80 ml/min. Frak-tioinnin ja kiteytyksen jälkeen pääfraktiosta saatiin ih-25 misinsuliinia, jonka proteiinipitoisuus oli 98 %, jolloin saanto oli 93 %. Kokonaistalteenotto oli 98 % käytetystä insuliinista.
Esimerkki 9
Puskuri A: 0,2 M ammoniumsulfaatti, 0,1 M glysiini, 30 0,025 M ammoniumsitraatti, 5 % etanolia, pH 5,5;
Puskuri B: kuten puskuri A, mutta lisätty 50 % etanolia.
Sorbenssi: Kromasil C8, 10 pm, huokoskoko 100 Ä, valmistaja EKA Nobel, Ruotsi.
35 Pylvään mitat: 50 mm x 250 mm.
98216 13 250 ml:an glysiinipuskuria, pH 3,0, liuotetaan 4,5 g geeniteknisesti valmistettua ihmisinsuliinia (proteiinin osuus 86,2 %) ja sen jälkeen pumpataan pylvääseen. Proteiinin kromatografoimiseksi tuotetaan kahdella korkeapaine-5 pumpulla molempien puskurien A ja B lineaarinen gradient-ti. Eluointi suoritetaan 100 min:n kuluttua etanolipitoi-suuden ollessa 33 % ja vakiovirtauksen ollessa 80 ml/min. Fraktioinnin ja kiteytyksen jälkeen saadaan pääfraktiossa ihmisinsuliinia, jonka proteiinipitoisuus on 96 % koko-10 naistalteenottoasteen ollessa 93 % käytetystä tuotteesta.
Esimerkki 10
Puskuri A: 0,2 M ammoniumkloridi, 0,1 M glysiini, 0,025 M natriumsitraatti, 10 % metyyliasetaattia, pH 5,5;
Puskuri B: sama suolapitoisuus kuin puskurissa A, 15 mutta 20 % metyyliasetaattia.
Sorbenssi: Kromasil C8, 10 pm, huokoskoko 100 Ä, valmistaja EKA Nobel, Ruotsi.
Kromatografointia varten 4,6 g raakaa ihmisinsuliinia, joka on peräisin geeniteknisesti valmistetun insulii-20 nin jatkokäsittelystä, liuotetaan 200 ml:an vesipitoista glysiinipuskuria ja sen jälkeen pumpataan HPLC-pylvääseen 50 x 250 mm. Pylvään materiaali tasapainotetaan etukäteen sekoittamalla kahden korkeapainepumpun avulla puskuria A ja B, niin että metyyliasetaattipitoisuus on 13 %. Täytön 25 jälkeen suoritetaan ihmisinsuliinin eluointi käyttäen lineaarista gradienttia 13 - 17 % metyyliasetaattia 90 min aikana. Päätuotteen eristys suoritetaan kiteyttämällä eluointiliuos. Tällöin saadaan 3,8 g ihmisinsuliinia, jonka proteiinipitoisuus on 96 %. Kokonaistalteenottoaste 30 lähtöaineen suhteen on tällöin 90 I.
’ Esimerkki 11
Puskuri A: 0,2 M ammoniumsulfaatti, 0,1 M betaiini, 0,05 M sitruunahappo, pH 5,5 natriumhydroksidin avulla (pelkkä vesiliuos); 35 Puskuri B: 0,1 M ammoniumsulfaatti, 0,1 M betaiini, 0,05 M sitruunahappo, pH 5,5 natriumhydroksidilla (ve-si/isopropanoli suhteessa 1:1); 98216 14
Sorbenssi: Nucleosil C18, 15 - 25 pm, pallomainen, 100 A;
Pylväs: 40 mm x 250 mm.
Virtaus: 45 ml/min.
5 Pylväs täytettiin 3 g:11a (proteiinin osuus 79 %) ihmisinsuliinia, joka oli peräisin ihmisinsuliini-di-tert.-butyyliesteri/eetterin esterilohkaisusta ja joka oli 3-prosenttisena liuoksena 0,1 M betaiini/HCl-puskurissa, pH 3,0, korkeapainepumpun avulla. Sen jälkeen eluoitiin 10 edellä mainitulla puskurisysteemillä isokraattisesti käyt täen 44 % puskuria B. Retentioaika oli n. 35 min. Frak-tioinnin jälkeen pääfraktiossa oli 98,1 % ihmisinsuliinia saannon ollessa 80,5 %. Kokonaistalteenotto oli 90,5 %.
Esimerkki 12 15 Puskuri A: 0,1 M ammoniumsulfaatti, 0,05 M glut- amiinihappo, 0,05 M sitruunahappo, pH 5,45 natriumhydrok-sidilla (pelkkä vesiliuos);
Puskuri B: 0,1 M ammoniumsulfaatti, 0,05 M glut-amiinihappo, 0,05 M sitruunahappo, pH 5,5 natriumhydroksi-20 dilla (vesi/n-propanoli suhteessa 1:1);
Sorbenssi: Nucleosil C18-P, 15 - 25 pm, pallomainen, 100 A;
Pylväs: 50 mm x 250 mm.
Virtaus: 60 ml/min.
25 Pylväs täytettiin 6 g:11a (proteiinin osuus 73 %) ihmisinsuliinia, joka oli peräisin ihmisinsuliini-di-tert.-butyyliesteri/eetterin esterilohkaisusta ja joka oli 3-prosenttisena liuoksena 0,1 M etikkahapossa, pH 3,0, korkeapainepumpun avulla. Sen jälkeen eluoitiin edellä 30 mainitulla puskurisysteemillä käyttäen gradienttia 25 - 28 % puskuria B. Retentioaika oli n. 25 min. Fraktioinnin jälkeen pääfraktiossa oli 98,6 % ihmisinsuliinia saannon ollessa 65 %. Kokonaistalteenotto oli 88,5 %.
98216 15
Esimerkki 13 (ei keksinnön mukainen)
Puskuri A: 0,1 M sitruunahappo, 0,2 M ammoniumsul-faatti, pH 2,5 vetykloridihapolla, pelkkä vesiliuos
Puskuri B: 0,1 M sitruunahappo, 0,1 M ammoniumsul-5 faatti, pH 2,5 vetykloridihapolla, vesi/n-propanoli suhteessa 1:1).
Sorbenssi: Nucleosil C18, valmistaja Macherey &
Nagel
Pylväs: 40 mm x 250 mm.
10 Virtaus: 45 ml/min.
Pylvään täyttämisen jälkeen 3 g:11a ihmisinsulii-nia, joka oli peräisin ihmisinsuliini-di-tert.-butyyli-treoniiniesteri/eetterin trifluorietikkahappolohkaisusta ja joka oli 3-prosenttisena liuoksena 0,1 M glysiinipusku- 15 rissa pH 3,0, eluoitiin 34 - 45 prosentilla puskuria B. Retentioaika oli 45 min. Fraktioinnin, kiteytyksen ja kuivauksen jälkeen pääfraktiossa eristettiin 57 % käytetystä määrästä, jolloin puhtaus oli 94,8 %, ja sivufraktiossa 16 % (puhtaus 84 %).
20 Esimerkki 14 (ei keksinnön mukainen)
Puskuri A: 0,1 M sitruunahappo, 0,2 M ammoniumsul-faatti, pH 3,5 vetykloridihapolla, pelkkä vesiliuos
Puskuri B: 0,1 M sitruunahappo, 0,1 M ammoniumsul-faatti, pH 3,5 vetykloridihapolla, vesi/n-propanoli suh- 25 teessä 1:1).
Sorbenssi: Nucleosil C18, valmistaja Macherey &
Nagel
Pylväs: 40 mm x 250 mm.
Virtaus: 45 ml/min.
30 Pylvään täyttö tapahtui kuten esimerkissä 13. Re tentioaika oli n. 40 min. Fraktioinnin, kiteytyksen ja kuivauksen jälkeen pääfraktiosta saatiin 51 % käytetystä ihmisinsuliinista puhtauden ollessa 97,5 % ja 4 % sivu-fraktiossa (puhtaus 68%).
98216 16
Esimerkki 15
Puskuri A: 0,1 M tris, 0,1 M glysiini, 0,1 M ammo-niumkloridi, pH 8,5 vetykloridihapolla, pelkkä vesiliuos;
Puskuri B: 0,1 M tris, 0,1 M glysiini, 0,1 M airuno-5 niumkloridi, pH 8,5 vetykloridihapolla, vesi/n-propanoli suhteessa 1:1.
Sorbenssi: Kromasil C8, 13 pm, 100 Ä
Pylväs: 50 mm x 250 mm
Virtaus: 60 ml/min.
10 33 prosenttiin puskuria B sisältäväksi tasapaino tettu pylväs täytettiin 6g:lla ihmisinsuliinia, jota oli saatu trifluorietikkahappolohkaisusta (ks. esimerkki 13) ja joka oli 3-prosenttisena liuoksena 0,1 M trispuskurissa pH 8,5. Eluointi suoritettiin n. 35 min:n kuluttua. Frak-15 tioinnin ja kiteytyksen jälkeen pääfraktio sisälsi 96,6-prosenttista ihmisinsuliinia saannon ollessa 86 %. Kokonaistalteenotto oli 95 %.
Esimerkit 16 - 19
Esimerkeissä 16 - 19 kromatografointi suoritettiin 20 samoissa olosuhteissa kuin esimerkissä 13. Vain puskureita ja kahtaisionien määrää muutettiin.
Esimerkki 16
Puskuri kuten esimerkissä 14, lisäksi 0,1 M glysii- niä.
25 Tulos: pääfraktion puhtaus 96 %; saanto pääfrak- tiossa 66 % ja sivufraktiossa 6 %.
Esimerkki 17
Puskuri A: 0,1 M ammoniumkloridi, 0,025 M sitruuna-happo, pH 4,5 ammoniakilla, 5 til.-% n-propanolia, 0,1 M 30 glysiinibetaiini
Puskuri B: kuten puskuri A, mutta lisäksi 50 til.-% n-propanolia
Tulos: pääfraktion puhtaus 98,1 %; saanto pääfrak-tiossa 88 % ja sivufraktiossa 6 %.
90 ο Λ r 6 Δ !o 17
Esimerkki 18
Puskuri kuten esimerkissä 17, mutta pH 5,4 ja 0,1 M glysiiniä glysiinibetaiinin sijasta.
Tulos: pääfraktion puhtaus 97,9 %; saanto pääfrak-5 tiossa 92 % ja sivufraktiossa 8 %.
Esimerkki 19
Puskuri kuten esimerkissä 18, mutta pH 6,0 ja lisäksi 0,1 M glysiiniä.
Tulos: pääfraktion puhtaus 94,3 %; saanto pääfrak-10 tiossa 77 % ja sivufraktiossa 13 %.
Esimerkki 20
Taulukossa 1 esitetään yhteenveto insuliinien saannosta ja puhtaudesta eluentin pH-arvon ja kahtaisionin funktiona.
15 Taulukko 1 puhtaus saanto esim.
pH-arvo kahtais- pää- pää- sivu- nro _ioni_fraktio fraktio_fraktio_ 3,5 Gly 96,0 66 6 16 4,5 glysiini- 98,1 88 6 17 betaiini 20 5,4 Gly 97,9 92 8 18 5,5 Gly 98,0 93 5 8 6,0 Gly 94,3 77 13 19 8,5 Gly 96,6 86 9 15
Claims (6)
1. Menetelmä insuliinin ja/tai insuliinijohdannaisten puhdistamiseksi kromatografoimalla vesipitoisissa, 5 puskuroiduissa liuottimissa, jotka sisältävät veteen sekoittuvia orgaanisia liuottimia, käyttäen lipofiilisesti modifioitua silikageeliä, tunnettu siitä, että puskuroiduissa liuottimissa on liuenneena kahtaisioneja tai liuotinseoksen pH-arvo on korkeintaan yhden pH-yksikön 10 puhdistettavan insuliinin tai insuliinijohdannaisen isoelektrisen pisteen ala- tai yläpuolella ja siinä on kahtaisioneja, jolloin kahtaisioneina käytetään a-amino-happoja tai betaiineja pitoisuudessa 10 mmol/1 - 1 mol/1.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, 15 tunnettu siitä, että liuotinseoksen pH-arvo on korkeintaan 0,5 pH-yksikköä isoelektrisen pisteen ala- tai yläpuolella.
3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kahtaisionina käytetään gly- 20 siiniä, glutamiinihappoa tai glysiinibetaiinia.
4. Jonkin patenttivaatimuksista 1-3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käytetään insulii-nijohdannaisia, joilla on kaava I
25 S-S A21 _1_|_;_ H- A-ketju Asn _^Η -,-]- S S I I (1) s s
30 B2 I I_B29 y- Vai B-ketju Lys —R-^-X * n jossa R30 tarkoittaa geneettisesti koodattavissa olevan
35 L-aminohapon ryhmää, 98216 X tarkoittaa hydroksyyliryhmää, fysiologisesti vaaratonta orgaanista emäksisen luonteen omaavaa ryhmää, jossa on korkeintaan 50 C-atomia, geneettisesti koodattavissa olevaa L-aminohappoa, jossa mahdollisesti mukana pääteryh-' 5 mänä oleva karboksyyliryhmä voi olla vapaana, esteriryh- mänä, amidiryhmänä, laktonina tai ryhmäksi CH2OH pelkistyneenä, n tarkoittaa kokonaislukua 0 - 10, Y on vety tai L-fenyylialaniini 10 ja A- ja B-ketju ovat eläin- tai ihmisinsuliinin sekvenssejä.
5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kaavassa I R30 tarkoittaa L-alaniinia tai L-treoniiniä ja X tarkoittaa yhtä tai 15 useampaa L-aminohappoa ryhmästä L-arginiini, L-lysiini tai L-fenyylialaniini.
6. Jonkin patenttivaatimuksista 1-5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käytetään prepara-tiivista korkeapainenestekromatografialaitteistoa. 98216
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE4028120A DE4028120C2 (de) | 1990-09-05 | 1990-09-05 | Verfahren zur Reinigung von Insulin und/oder Insulinderivaten |
DE4028120 | 1990-09-05 |
Publications (4)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
FI914150A0 FI914150A0 (fi) | 1991-09-03 |
FI914150A FI914150A (fi) | 1992-03-06 |
FI98216B FI98216B (fi) | 1997-01-31 |
FI98216C true FI98216C (fi) | 1997-05-12 |
Family
ID=6413631
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
FI914150A FI98216C (fi) | 1990-09-05 | 1991-09-03 | Menetelmä insuliinien puhdistamiseksi kromatografisesti |
Country Status (28)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US5245008A (fi) |
EP (1) | EP0474213B1 (fi) |
JP (1) | JP3161770B2 (fi) |
KR (1) | KR100191699B1 (fi) |
AT (1) | ATE128145T1 (fi) |
AU (1) | AU637255B2 (fi) |
CA (1) | CA2050644C (fi) |
CZ (1) | CZ283356B6 (fi) |
DE (2) | DE4028120C2 (fi) |
DK (1) | DK0474213T3 (fi) |
ES (1) | ES2078405T3 (fi) |
FI (1) | FI98216C (fi) |
GR (1) | GR3017750T3 (fi) |
HR (1) | HRP940716B1 (fi) |
HU (1) | HU207100B (fi) |
IE (1) | IE68956B1 (fi) |
IL (1) | IL99384A (fi) |
LT (1) | LT3329B (fi) |
LV (1) | LV10105B (fi) |
NO (1) | NO180681C (fi) |
NZ (1) | NZ239650A (fi) |
PL (1) | PL168114B1 (fi) |
PT (1) | PT98864B (fi) |
RU (1) | RU2037500C1 (fi) |
SK (1) | SK278099B6 (fi) |
UA (1) | UA26375A1 (fi) |
YU (1) | YU147591A (fi) |
ZA (1) | ZA917006B (fi) |
Families Citing this family (21)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0547544B1 (de) * | 1991-12-18 | 1997-03-12 | Hoechst Aktiengesellschaft | Verfahren zur Gewinnung von insulinhaltigen Lösungen |
JP3279362B2 (ja) * | 1992-10-05 | 2002-04-30 | 井上 聰一 | 糖尿病判定方法及び糖尿病判定装置 |
JP3319812B2 (ja) * | 1993-04-05 | 2002-09-03 | 井上 聰一 | リウマチ判定方法及びリウマチ判定装置 |
US6869930B1 (en) * | 1993-09-17 | 2005-03-22 | Novo Nordisk A/S | Acylated insulin |
DE4405179A1 (de) * | 1994-02-18 | 1995-08-24 | Hoechst Ag | Verfahren zur Gewinnung von Insulin mit korrekt verbundenen Cystinbrücken |
DE19652713C2 (de) * | 1996-12-18 | 2001-11-22 | Aventis Pharma Gmbh | Verfahren zur Reinigung von Insulin und Insulinderivaten durch Chromatographie an stark saurem Kationenaustauscher |
DE19838097A1 (de) * | 1998-08-24 | 2000-03-02 | Hoechst Marion Roussel De Gmbh | Verfahren zur chromatographischen Reinigung von Insulinen |
US6248683B1 (en) * | 1999-04-07 | 2001-06-19 | Silicycle Inc. | Process for the regeneration of used silica gel |
US7309581B2 (en) * | 2000-11-01 | 2007-12-18 | Sysmex Corporation | Method of staining, detection and counting bacteria, and a diluent for bacterial stain |
WO2004089504A1 (en) * | 2003-04-08 | 2004-10-21 | Novo Nordisk A/S | Regeneration of chromatographic stationary phases |
KR101198346B1 (ko) * | 2003-04-08 | 2012-11-06 | 노보 노르디스크 에이/에스 | 크로마토그래피 고정상의 재생 |
RU2251426C1 (ru) * | 2003-09-18 | 2005-05-10 | Цыганков Владимир Владимирович | Способ получения инсулина из природного источника и инсулин |
KR101002296B1 (ko) * | 2005-07-06 | 2010-12-20 | 주식회사 코오롱 | 전방향족 폴리아미드 필라멘트의 제조방법 |
GB0524782D0 (en) * | 2005-12-05 | 2006-01-11 | Chiron Srl | Analysis of samples |
JP5781308B2 (ja) * | 2008-02-19 | 2015-09-16 | バイオコン・リミテッドBiocon Limited | 異種タンパク質を得る方法およびインスリン類似体 |
CA2766571A1 (en) * | 2009-07-09 | 2011-02-24 | Biocon Limited | A preparative non-linear gradient based chromatographic method and purified products thereof |
EP2464655B1 (en) * | 2009-08-11 | 2017-02-15 | Biocon Limited | Chromatographic processes |
US9422330B2 (en) | 2010-03-01 | 2016-08-23 | Novo Nordisk A/S | Preparative RP-HPLC method for purifying peptides |
EP2570183A1 (en) | 2011-09-15 | 2013-03-20 | InstrAction GmbH | Sorbent comprising on its surface an aliphatic unit for the purification of organic molecules |
WO2016014325A1 (en) | 2014-07-21 | 2016-01-28 | Merck Sharp & Dohme Corp. | Chromatography process for purification of inlsulin and insulin analogs |
CN115505035B (zh) * | 2022-08-22 | 2023-09-05 | 南京汉欣医药科技有限公司 | 一种司美格鲁肽中间体多肽的纯化方法 |
Family Cites Families (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE2629568C3 (de) * | 1976-07-01 | 1981-09-10 | Hoechst Ag, 6000 Frankfurt | Verfahren zur Reinigung von Insulin, seinen Analogen und Derivaten |
DE3101382A1 (de) * | 1981-01-17 | 1982-09-02 | Hoechst Ag, 6000 Frankfurt | "verfahren zur herstellung von humanisulin oder dessen derivaten aus schweineinsulin oder dessen derivaten" |
DE3147842A1 (de) * | 1981-12-03 | 1983-06-23 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | "verfahren zur trennung von gemischen aus insulin, insulinderivaten und gegebenenfalls verunreinigungen" |
GB2119248A (en) * | 1982-04-28 | 1983-11-16 | John Kenneth Mcmullen | Insulin formulations and method of producing them |
WO1989001485A1 (en) * | 1987-08-14 | 1989-02-23 | Gebro Broschek Kg | Purification of raw peptides by preparative medium-pressure liquid chromatography |
-
1990
- 1990-09-05 DE DE4028120A patent/DE4028120C2/de not_active Expired - Lifetime
-
1991
- 1991-09-03 US US07/754,003 patent/US5245008A/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-09-03 UA UA5001389A patent/UA26375A1/uk unknown
- 1991-09-03 IL IL9938491A patent/IL99384A/en not_active IP Right Cessation
- 1991-09-03 NZ NZ239650A patent/NZ239650A/en not_active IP Right Cessation
- 1991-09-03 RU SU915001389A patent/RU2037500C1/ru active
- 1991-09-03 FI FI914150A patent/FI98216C/fi not_active IP Right Cessation
- 1991-09-04 AU AU83568/91A patent/AU637255B2/en not_active Expired
- 1991-09-04 PL PL91291616A patent/PL168114B1/pl unknown
- 1991-09-04 YU YU147591A patent/YU147591A/sh unknown
- 1991-09-04 ES ES91114936T patent/ES2078405T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1991-09-04 NO NO913476A patent/NO180681C/no not_active IP Right Cessation
- 1991-09-04 CA CA002050644A patent/CA2050644C/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-09-04 IE IE311591A patent/IE68956B1/en not_active IP Right Cessation
- 1991-09-04 SK SK2717-91A patent/SK278099B6/sk not_active IP Right Cessation
- 1991-09-04 CZ CS912717A patent/CZ283356B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1991-09-04 DK DK91114936.7T patent/DK0474213T3/da active
- 1991-09-04 PT PT98864A patent/PT98864B/pt not_active IP Right Cessation
- 1991-09-04 ZA ZA917006A patent/ZA917006B/xx unknown
- 1991-09-04 DE DE59106519T patent/DE59106519D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1991-09-04 KR KR1019910015402A patent/KR100191699B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1991-09-04 EP EP91114936A patent/EP0474213B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1991-09-04 JP JP22324291A patent/JP3161770B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1991-09-04 AT AT91114936T patent/ATE128145T1/de not_active IP Right Cessation
- 1991-09-05 HU HU912874A patent/HU207100B/hu unknown
-
1993
- 1993-05-04 LV LVP-93-285A patent/LV10105B/lv unknown
- 1993-06-25 LT LTIP713A patent/LT3329B/lt not_active IP Right Cessation
-
1994
- 1994-10-20 HR HRP-1475/91A patent/HRP940716B1/xx not_active IP Right Cessation
-
1995
- 1995-10-16 GR GR950402850T patent/GR3017750T3/el unknown
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
FI98216C (fi) | Menetelmä insuliinien puhdistamiseksi kromatografisesti | |
CA2091873C (en) | Parathyroid hormone derivatives | |
FI114478B (fi) | Menetelmä virtsasta peräisin olevan komponentti B: ksi kutsutun proteiinin valmistamiseksi | |
JP4975895B2 (ja) | 高圧液体クロマトグラフィーによるインシュリンの単離方法 | |
CA2052375C (en) | Parathyroid hormone derivatives | |
CN102770440A (zh) | 纯化肽的制备性rp-hplc方法 | |
FI108644B (fi) | Menetelmä insuliinipitoisten liuosten valmistamiseksi | |
CN106554391B (zh) | 一种海洋生物肽Xen2174的合成方法 | |
Brückner | Enantiomeric resolution of N-methyl-α-amino acids and α-alkyl-α-amino acids by ligand-exchange chromatography | |
US4533494A (en) | Process for purifying secretin | |
KR100351389B1 (ko) | 히루딘유도체및이의제조방법 | |
CN116429950B (zh) | 多肽pd-dp-005的有关物质分析方法 | |
CN110981939A (zh) | 一种普利卡那肽的制备方法 | |
CN114324669B (zh) | 一种鲑鱼促性腺激素释放激素类似物中l-精氨酸残留量的柱前手性衍生测定方法 | |
Thompson et al. | A simple and inexpensive sample-handling method for the semi-preparative RP-HPLC of polypeptides and non-polar peptide derivatives: pre-adsorption of samples | |
Marriq et al. | Use of guanidine hydrochloride in the purification by reversed-phase high-performance liquid chromatography of thyroxinyl-and triiodothyronylpeptides derived from thyroglobulin |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
BB | Publication of examined application | ||
PC | Transfer of assignment of patent |
Owner name: SANOFI-AVENTIS DEUTSCHLAND GMBH Free format text: SANOFI-AVENTIS DEUTSCHLAND GMBH |
|
MA | Patent expired |