HU207100B

HU207100B - Process for purifying insulins by reverse phase chromatography

Info

Publication number: HU207100B
Application number: HU912874A
Authority: HU
Inventors: Rainer Dickhardt; Bernhard Unger; Leonhard Haefner
Original assignee: Hoechst Ag
Priority date: 1990-09-05
Filing date: 1991-09-05
Publication date: 1993-03-01
Also published as: PT98864A; US5245008A; HUT59418A; RU2037500C1; NO913476L; FI98216C; CS271791A3; IE913115A1; NO180681C; AU637255B2; JPH04230699A; LV10105B; CA2050644A1; LT3329B; AU8356891A; PL168114B1; FI914150A; EP0474213A1; GR3017750T3; UA26375A1

Description

A találmány tárgya eljárás inzulinok és/vagy inzulinszármazékok tisztítására, mely eljárás során az inzulint, illetve inzulin-származékot 2,8 és 8,5 közötti pH-értékre pufferolt oldószerben feloldjuk, lipofilra módosított kovasavgélre visszük, majd iker ionokat tartalmazó pufferolt oldószereleggyel az izoelektromos pont közelében eluáljuk.

Inzulin vagy inzulin-származékok lipofilra módosított (reverz fázisú) kovasavgélen végzett tisztítása az analitikából ismert, a nagynyomású folyadék kromatográfia évek óta sikeresen használja ezt a módszert [W. S. Welinder és munkatársai, J. Chrom. 361, 357-367 (1986)]. Elemzésre használatos mennyiségű, így pg-os mennyiségű proteint visznek módosított kovasavgéllel töltött acél-, üveg- vagy műanyag oszlopra, majd áramló folyadékeleggyel (többnyire savas, vizes pufferoldat, amely állandó vagy változó mennyiségben szerves oldószert is tartalmaz) eluálják. A felvitt proteinmennyiség a 30gg/ml oszloptérfogat értéket messze nem éri el.

Az inzulinok tisztításához gyakran a laboratóriumban használatos, viszonylag toxikus oldószereket (pl. acetonitrilt), valamint korróziót előidéző' puffer-komponenseket, pl. tetraalkil-ammónium-sókat, alkilszulfonátot, hexafluoracetont, trifluoracetátot használnak [E. P. Kroeff és munkatársai, J. Chrom. 461, 45-61 (1989)]. Ezek a futtató szerek az inzulinhoz közel álló anyagokkal erősen szennyezett elegyek tisztításakor a főkomponens minősége, hozama, valamint az összes inzulinkomponens kinyerhetősége szempontjából kielégítő preparatív szétválasztást nem tesznek lehetővé [J. Rivier, R. McClintock, J. Chrom., 268, 112-119 (1983); Peter és munkatársai, J. Chrom. 408, 43-52 (1987)].

Előző kémiai műveletekből, így erősen savas észterbontásból vagy enzimes (transz)peptidáló folyamatokból, kristályosítási tisztításból származó inzulinok gyakran olyan kísérőanyagokat tartalmaznak, amelyek tulajdonságaikban erősen hasonlítanak a főkomponenshez. Tisztításuk meghatározott pH-értéken végzett ioncserélő kromatográfiás módszerrel lehetséges, ha az elektromos töltéskülönbségek eléggé nagyok (4 129560 sz. amerikai szabadalmi leírás). A módszer hátrányai közé tartozik a felhígulás, mert kicsapott anyagok feldolgozásakor a felülúszóval értékes anyag vész el, továbbá a ciklusidő viszonylag hosszú, és az összes értékes komponens kinyerhetősége, ezzel együtt a hozam is nem kielégítő.

A WO 8901 485 szám alatt publikált PCT/AT88/OOO63 sz. nemzetközi szabadalmi bejelentés peptidek reverz fázisú kovasavgélen végzett tisztítását ismerteti. Az eljárás során kelátképzőt, előnyösen EDTA-t vagy nitriloecetsavat, valamint erősen poláros vegyületet, például hexametilénfoszfor-triamidot vagy N-metilpirrolidont alkalmaznak. Az eljárás hozama nem mindig kielégítő, és - ahogy saját reprodukációs kísérleteink bizonyították - a termék tisztasága nem éri el a gyógyszerkönyvekben támasztott követelményeket.

A preparatív (azaz kinyerés céljából végzett) szétválasztás elvileg az oszlop térfogatának, a felvitt anyag mennyiségének és az eluálószer mennyiségének növelésével érhető el. A szerves oldószerek szükséges mennyisége pl. a 20 cm-t meghaladó átmérőjű oszlopon végzett oszlopkromatográfia esetén köbméteres nagyságrendben van. Az elemzés céljából végzett HPLC során alkalmazott oldószerek (pl. acetonitril, dimetil-formamid, metanol, dioxán stb.) toxikusak, ezért a preparatív termeléshez szükséges mennyiségekben történő alkalmazásuk költséges védőintézkedéseket tenne szükségessé.

A találmány feladata inzulinok és inzulin-származékok tisztítására alkalmas kromatográfiás eljárás kifejlesztése volt, amely eljárás során az inzulinok biológiai aktivitása megmarad, egy kromatográfiás lépéssel nagy tisztaság, továbbá rövid ciklusidő, az oszlop 50 ciklust meghaladó élettartama, az álló kovasavgél-fázis gyors, töltetcsere nélküli regenerálása érhető el és az alkalmazott oldószerek nem toxikusak, úgyhogy preparatív termelési lépték válik lehetővé.

A fenti feladatot olyan eljárással oldottuk meg, amellyel inzulinokat és/vagy inzulin-származékokat vízzel elegyedő szerves oldószert tartalmazó, vizes, pufferolt oldószereleggyel lipofilra módosított kovasavgélen, az izoelektromos pont közelében, iker ionok jelenlétében tisztítunk meg. Az eljárásra jellemző, hogy az eluálást iker ionokat 0,02-0,5 mól/1 koncentrációban tartalmazó eluálószerrel végzik, amelynek pH-értéke 3,5 és 8,5 közötti, előnyösen legfeljebb 1 pH-egységgel a tisztítani kívánt inzulin vagy inzulin-származék izoelektromos pontja feletti vagy alatti.

Meglepő módon a fenti paraméterek pontos betartása nemcsak az értékes anyag és a szennyeződés jó szétválaszthatóságát, hanem ezen túlmenően a proteinnek az álló fázisról (lipofil kovasavgélről) való jó leválását eredményezi. A szétválasztás annyira jó, hogy még inzulinhoz hasonló komponensekkel erősen szennyezett inzulin-oldatok is tisztíthatok, így például inzulinok és inzulin-származékok A21-dezamido-inzulintól elválaszthatók. Mert a proteinek jól válnak le a szilárd fázisról, a töltött oszlop sokáig üzemeltethető, és az inzulinok összkinyerhetősége is jó.

A találmány szerinti eljárás mindkét változata bármely inzulin tisztítható, így állati vagy emberi eredetű inzulin, inzulin-prekurzorok, pl. proinzulin vagy preproinzulin, vagy genetikailag módosított mikroorganizmusok által termelt rekombinált inzulinok. Olyan inzulin-származékokat is alkalmazhatunk, amelyeket pl. kémiai vagy enzimes átalakítással állítottunk elő, így pl. dez-Phe-B 1-inzulin, inzulin-(3-ketén-szulfonát, diarginin-inzulin(B31, B32), monoarginin-ínzulin vagy difenilalanin-inzulin(B31, B32) (4601852 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás). Az az eljárás, amely szerint az izoelektromos pontnál legfeljebb 1 pH-egységgel kisebb vagy nagyobb pH-érték mellett és iker ionok jelenlétében végezzük a kromatográfiás tisztítást, esetenként valamennyivel jobb hozamot ad.

Az inzulinok vagy inzulin-származékok viszonylag szennyezett állapotban, de (pl. gélkromatográfiásari) előtisztított formában is vihetők az eljárásba. Az inzu2

HU 207 100 B lin többszörös kristályosítás és gélkromatográfiai tisztítás után még mindig igen hasonló móltömegű, inzulinszerű kísérőanyagokat tartalmaz; ezek megfelelően választott pH-érték mellett töltésállapotukban különböznek az inzulintól és egymástól, de inzulinnal komplexeket képeznek (4129560 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás). Az ilyen anyagok például dez-amido-inzulinok, arginin- és diarginin-inzulin, inzulin-etilészter és mások.

Lipofilra módosított kovasavgélen olyan kovasavgélt értünk, amelyre hidrofób mátrixot vittek fel. A hidrofób mátrix lehet például 3-20 szénatomos alkán. Különösen előnyös lipofilra módosított kovasavgélek például az alábbiak:

- ^(R)Nucleosil, Macherey & Nagel cég: gömb alakú és nem-gömb alakú, különböző, de legfeljebb 45 μτη-es szemcseméretű részecskék, pórusméret 100 Á, C8-, illetve C18-módosított.

- ^(R)Lichroprep, Merck cég: gömbalakú és nemgömbalakú, különböző, de legfeljebb 40 pm-es szemcseméretű részecskék, pórusméret 60-250 Á, C8-C18-módosított.

- ^(R)Lichrospher Select B, Merck cég: gömb alakú, legfeljebb 25 pm-es részecskék, C8-módosított;

_ ^(R)Waters Prep, C18-módosított, 50-105 pm-es, nem-gömb alakú részecskék, pórusméret 100 Á;

- ^(R)Zorbax ProlO, DuPont cég: C8-módosított, 10 pm, gömb alakú, pórusméret 100 Ί;

- ^(R)Kromasil, gyártja: EKA Nobel: C4-, C8-C18módosított legfeljebb 16 pm-es, gömb alakú részecskék, pórusméret 100,150 vagy 200 Á.

Iker ionok olyan vegyületek, amelyek protonokat felvehetnek, de le is adhatnak, azaz savas oldatban kationokat, lúgos oldatban anionokat képeznek; ilyenek például az α-aminosavak, bétáin és betain-származékok. Előnyös iker ionok a glicin, glutamin és bétáin (N-trimetil-glicin). Különösen előnyös a glicin.

Egy inzulin vagy inzulin-származék izoelektromos pontja (IEP) az inzulin oldatának az a pH-értéke, amelynél az oldott inzulin kationos és anionos töltéseinek száma a nullával egyenlő. A sertésinzulin izoelektromos pontja például 5,3 és 5,4 pH között van (H. Neurath, K. Bailey, Protein Hormones, Vol. II/A, The Proteins, 636. old.), ami azt jelenti, hogy ez esetben az oldószerelegy pH-jának 4,5 és 6,5 között kell lennie. Különösen előnyös az olyan pH-érték, amely legfeljebb 0,5 pH-egységgel van az IEP felett vagy alatt.

Az eluálószer pufferoló anyagot tartalmaz, hogy az eluálószer pH-értékét állandó értéken lehessen tartani. Alkalmas pufferanyagok az irodalomból ismertek, például: foszfátok, alkálifém- és alkáliföldfémsók, így nátriumcitrát vagy kálium-acetát, ammónium-citrát, -acetát -szulfát vagy -klorid. Az eluálószer továbbá vízzel elegyedő szerves oldószert is tartalmaz, például az alábbiakat: alkoholok, ketonok, metil-acetát vagy dioxán. Az alkoholokat, így n- vagy izopropanolt, metanolt, etanolt vagy metil-acetátot előnyben részesítjük.

A vízzel elegyedő szerves oldószer koncentrációja és 90%, előnyösen 10 és 60%, különösen előnyösen 10 és 35% között van. A pufferanyag 1 mmól/1 és mól/1 közötti koncentrációban van jelen, vízre mint oldószerre vonatkoztatva. Az iker ionok koncentrációja 20 mmól/1 és 500 mmól/1 közötti, vízre mint oldószerre vonatkoztatva.

A kromatográfiás tisztítást 0 °C és 50 °C közötti hőmérsékleten, előnyösen 15 °C és 30 °C közötti hőmérsékleten, különösen 15 °C és 20 °C közötti hőmérsékleten végezzük. Kromatografálás alatt a nyomás messzemenően állandó és lehet pl. 0,5x10⁶-4Oxl0⁶ Pa, előnyösen 2xl0⁶-10⁷ Pa.

Az inzulint vagy inzulin-származékot ismert módon visszük az oszlopra és eluáljuk onnan. A tisztítani kívánt inzulint előnyösen vizes, alkoholos vagy tisztán vizes pufferoldatban visszük az oszlopra. Az inzulinoldat proteinkoncentrációja 1-10%-ot, előnyösen 3%ot tesz ki.

Az inzulinok eluálásához állandó koncentrációjú pufferoldatot alkalmazunk (izokráciás módszer), vagy a pufferben lévő, vízzel elegyedő szerves oldószer részarányát megváltoztatjuk. Ez a megváltoztatás úgy értendő, hogy a szerves oldószer koncentrációját az eluálószer göngyelített térfogatával arányosan, előnyösen lineárisan arányosan emeljük.

Kromatografálás után az inzulint cinkkel végzett kicsapás vagy kristályosítás útján elválasztjuk az eluálószerből. Az oldatot vákuumdesztillációval oldószermentesíthetjük, vagy az oldószer koncentrációját vizes hígítással csökkenthetjük. Mindenesetre célszerű ha az oldószer koncentrációja kicsapás vagy kristályosítás előtt legfeljebb 10%-ot tesz ki, mert így a felülúszóban a proteintartalom 50 mg/l-nél kisebb marad. A kapott tiszta inzulincsapadékot dekantálással, centrifugálással vagy szűréssel különítjük el, majd szárítjuk.

A találmány szerinti eljárást nemcsak az elemző kromatográfiában lehet alkalmazni, hanem a preparatív kromatográfiában is, főleg, ha a megvalósításhoz HPLC-berendezés áll rendelkezésre

A „preparatív” kromatográfián itt olyan eljárást értünk, amely célja nem a termék elemzése, hanem tiszta formában történő kinyerése. A kinyert mennyiség széles tartományon belül változhat, például 1 mg és 50 kg, előnyösen 50 mg és 15 kg között van.

Az alábbi példákkal a találmányt közelebbről ismertetjük. A százalékos adatok tömegszázalékok, ha mást nem kötünk ki. A pufferoldatok mól-adatai 1 literre vonatkoznak.

7. példa

Puffer A: 0,2 mól ammónium-szulfát, 0,1 mól glicin, 0,05 mól nátrium-citrát, pH 5,5, tisztán vizes;

Puffer B: 0,1 mól ammónium-szulfát, 0,1 mól glicin, 0,05 mól nátrium-citrát, pH 5,5, víz és n-propanol 1:1.

Szorbens: Nucleosil C18, 15-25 pm, gömb alakú részecskék, pórusméret 100 angström, gyártja: Macherey & Nagel

Oszlop: 40 mmx250 mm

HU 207 100 B

Humáninzulin-B30-di-terc-butilészter/éter trifluorecetsavas bontásából nyert 3,5 g humáninzulint (proteintartalom 79,1%) nagynyomású szivattyúval, 0,1 mól/1 glicint tartalmazó 2,8 pH-jú HCl-pufferben felviszünk az oszlopra. Alkalmas keverőberendezéssel ellátott nagynyomású szivattyún keresztül adagoljuk az A- és B-puffert keverve úgy, hogy 14% és 20% közötti propanolgradiens jön létre. Az inzulin kb. akkor eluálódik, amikor a gradiens 17,5% propánok tartalmaz. 46 ml/perc áramlási sebesség mellett ez a 23. perc után következik be.

A kristályosított humáninzulin frakcionálása és izolálása után 88,5%-os hozammal 97% proteint tartalmazó terméket kapunk főfrakcióként; 7,5%-os hozammal mellékfrakciót is nyerünk, ennek 85,7% a proteintartalma. Ez azt jelenti, hogy a bevitt inzulin 96,0%-át sikerült kinyerni.

2. példa

Puffer A: 0,1 mól ammónium-szulfát, 0,1 mól glicin, 0,025 mól nátrium-citrát, pH 5,5, tisztán vizes;

Puffer B: 0,05 mól ammónium-szulfát, 0,1 mól glicin, 0,025 mól nátrium-citrát, pH 5,5, víz és npropanolltl.

Szorbens: Nucleosil C18-P, 15—25 pm, gömb alakú részecskék, pórusméret 100 angström, gyártja: Macherey & Nagel.

Oszlop:40 mmx250 mm

Humáninzulin-di-terc-butilészter/éter észterbontásából származó 7,0 g humáninzulint (proteintartalom 86,1%) nagynyomású szivattyú segítségével felviszünk az oszlopra 2,8 pH-jú 0,1 mól glicin/HCl-pufferrel készített 3%-os oldat alakjában. Eluáláshoz az 1. példában leírt n-propanol-gradienst használunk, nyomás alatt. 60 perc alatt a propanolkoncentrációt 14%-ról 17,5%-ra növeljük.

Frakcionálás és kristályosítás után 98,7% proteint tartalmazó terméket kapunk. A tisztított humáninzulin hozama a bevitt inzulin 91%-ának felel meg.

3. példa

Puffer A: 0,1 mól ammónium-szulfát, 0,1 mól glicin, 0,025 mól nátrium-acetát, pH 5,5, tisztán vizes;

Puffer B: 0,05 mól ammónium-szulfát, 0,1 mól glicin, 0,025 mól nátrium-acetát, pH 5,5, víz és npropanol 1:1.

Szorbens: Lichrospher Select B, C8, 15-25 pm, 60 angström pórusméret, Merck

Oszlop: 50 mmx250 mm

Sertésinzulin tripszines átamidálásának reakcióelegyéből 10 g-ot 200 ml 2,8 pH-jú 0,1 mól glicin/HCl-pufferben feloldunk, és az oldatot oszlopra visszük, A propanol koncentrációt 120 perc alatt 14%-ról 30%-ra növeljük, 40 ml/perc áramlási sebesség mellett. Az egyes protein komponensek külön-külön eluálódnak. Kristályosítás, illetve kicsapás és szárítás után főfrakcióként a bevitt inzulinra vonatkoztatva 93% hozammal kapjuk a humáninzulinB30-di-terc-butil-treoninészter/étert (tisztaság 97% felett).

4. példa

Puffer A: 0,1 mól nátrium-klorid, 0,1 mól glicin, 0,025 mól nátrium-acetát, pH 5,5, tisztán vizes;

Puffer B: 0,05 mól nátrium-klorid, 0,1 mól glicin, 0,025 mól nátrium-acetát, pH 5,5, víz és npropanol 1:1.

Szorbens: Zorbax ProlO, C8, 10 pm, DuPont Oszlop: 5 cmx25 cm

Humáninzulin-B30-di-terc-butil-treoninészter/éter trifluorecetsavas bontásából származó 7,5 g humáninzulin 100 ml 0,1 mól glicin/HCl-oldattal készített oldatát az oszlopra szivattyúzzuk, majd 80 ml/perc áramlási sebesség mellett eluáljuk. A B-puffer koncentrációját 60 perc alatt 18%-róI 25%-ra növeljük. A retenciós idő kb. 37 perc. Kristályosítás után a főfrakcióból a bevitt inzulin 96,8%-ának megfelelő humáninzulint nyerünk, amelynek tisztasága meghaladja a 97%-ot. A mellékfrakció 2,2% humáninzulint tartalmazott, 50% alatti tisztasággal.

5. példa

Puffer A: 0,2 mól nátrium-szulfát, 0,1 mól glicin, 0,03 mól ammónium-acetát, pH 5,5, 10% metil-acetát;

Puffer B: 0,05 nátrium-szulfát, 0,1 glicin, 0,03 mól ammónium-acetát, pH 5,5, 20% metil-acetát

Szorbens: Kromasil C8, 13 p, pórusméret 100 angström, EKA Nobel

Oszlop: 5 cmx25 cm

Az oszlopot 30% B-puffert tartalmazó puffereleggyel kiegyensúlyozzuk, majd 1 liter oszloptérfogatra vonatkoztatva 8 g szarvasmarha-inzulint viszünk fel 0,1 mól glicin/HCl-puffer segítségével. 90 perc alatt a B-puffer részarányát 80%-ra növeljük, ami 15% metil-acetátnak felel meg. A szarvasmarhainzulin 65 perc múlva eluálódik, a főfrakció tisztasága >97,5% (hozam 63,5%). Vízzel hígítjuk és a terméket cink-kloriddal kicsapjuk. Az összkinyerés 92,5%.

6. példa

Puffer A: 0,1 mól ammónium-szulfát, 0,0 mól glicin, 0,025 mól nátrium-acetát, pH 5,5, 5% propanol;

Szorbens: Kromasil C8, 13 pm, pórusméret 100 angström EKA Nobel

Oszlop: 5 cmx25 cm

Humáninzu!in-B30-di-terc-butil-treoninészter/ét er trifluorecetsavas bontásából származó 4 g ( = 8 g/1) humáninzulint (tisztaság: kb. 92%) oszlopra viszünk, majd 90 percen belül a B-puffer részarányát 18%-ról 25%-ra növeljük. 45 perc körül a humáninzulin elu4

HU 207 100 Β álódik, a főfrakció tisztasága meghaladja a 97%-ot (hozam 91,8%), a mellékfrakcióé 80,5% (hozam 4,7%).

7. példa

Puffer A: 0,1 mól ammónium-szulfát, 0,1 mól glicin, 0,026 mól nátrium-acetát, pH 5,5, 10% npropanol

Szorbens: Kromasil C8, 13 μτη, pórusméret 100 angström EKA Nobel

Oszlop: 10cmx40cm g sertésinzulint adunk fel az oszlopra 1,8 liter

3,0 pH-jú, 0,1 mól glicin/HCl-puíferben, amely 5% npropanolt tartalmaz. A B-puffer részarányát 70 perc alatt 9%-ról (13,6% n-propanol) 11%-ra (14,4% n-propanol) emeljük. A sertésinzulin 50 perc elteltével eluálódik. A főfrakció protein tartalma meghaladja a 98%-ot (hozam 89%). A bevitt inzulin 96,8%-át sikerült visszanyerni.

8. példa

Puffer A: 0,2 mól ammónium-klorid, 0,1 mól glicin, 0,025 mól nátrium-citrát, pH 5,5, 5% n-propanol;

Puffer B: a puffer A összetétellel azonos, de 50% npropanolt tartalmaz.

Szorbens: Kromasil C8, 13 pm, pórusméret 100 angström EKA Nobel

Oszlop:50 mmx250 mm g géntechnológiailag előállított humáninzulinból (proteintartalom 89,5%) 3,0 pH-jú 0,1 mól glicin-puffemel 2%-os oldatot készítünk és az oldatot nagynyomású szivattyúval az oszlopra juttatjuk. Az inzulint n-propanolos lineáris gradienssel (13%-ról 16%-ra) eluáljuk 70 perc alatt, 80 ml/perc áramlási sebesség mellett. Frakcionálás és kristályosítás után főfrakcióként 98% tisztaságú humáninzulint kapunk 93%-os hozammal; a bevitt inzulin 98%-át sikerül kinyerni.

9. példa

Puffer A: 0,21 mól ammónium-szulfát, 0,1 mól glicin, 0,0256 mól ammónium-citrát, pH 5,5, 5% etanol;

Puffer B: a puffer-A összetétellel azonos, de 50% etanolt tartalmaz;

Szorbens: Kromasil C8, 10 μτη, pórusméret 100 angström EKA Nobel

Oszlop: 50 cmx250 cm

4$ g géntechnikai úton előállított humáninzulint (86,2% proteintartalom) 250 ml 3,0 pH-jú glicin-pufferben oldunk és az oldatot oszlopra juttatjuk. Két nagynyomású szivattyú segítségével az A- és B-puffer elegyítésével lineáris gradienst hozunk létre. Az inzulin 100 perc elteltével 33% etanol-koncentráció és 80 ml/perc áramlási sebesség mellett eluálódik, Frakcionálás és kristályosítás után főfrakcióként 96%-os humaninzulint kapunk, a bevitt inzulinra vonatkoztatva a hozam 93%.

J0. példa

Puffer A: 0,2 mól ammónium-klorid, 0,1 mól glicin, 0,025 mól nátrium-citrát, pH 5,5, 10% metilacetát;

Puffer B: a puffer A összetétellel azonos, de 20% metil-acetátot tartalmaz.

Szorbens: Kromasil C8, 10 μτη, pórusméret 100 angström EKA Nobel

Géntechnikailag előállított inzulin feldolgozásából származó 4,6 g nyers humáninzulin 200 ml vizes glicin-pufferrel készített oldatát 50x250 mm-es HPLCoszlopra juttatjuk. Az oszlop anyagát A- és B-puffer összekeverésével kapott, 13% metil-acetátot tartalmazó vizes eleggyel kiegyensúlyozzuk. Az inzulint 90 perc alatt olyan lineáris gradienssel eluáljuk, amelynek metil-acetát-tartalma 13%-ról 17%-ra emelkedik. A terméket kristályosítással választjuk el az eluálószeres oldatból. 3,8 g humáninzulint kapunk, amelynek a protein-tartalma 96%. A kiindulási anyagra vonatkoztatva az összkinyerés aránya 90%.

11. példa

Puffer A: 0,2 mól ammónium-szulfát, 0,1 mól bétáin, 0,05 mól citromsav, pH 5,5 nátronlúggal; tisztán vizes

Puffer B: 0,1 mól ammónium-szulfát, 0,1 mól bétáin, 0,05 mól ciktromsav, pH 5,5 nátronlúggal, víz és izopropanol 1:1 arányban;

Szorbens: Nucleosil C18, 15-25 μιη, gömb alakú részecskék, pórusméret 100 angström

Oszlop: 40 mmx250 mm

Áramlás: 45 ml/perc

Humán-inzulin-B30-di-terc-butil-treonilészter/éter észterbontásából származó 3 g humáninzulin (79% proteintartalom) 3,0 pH-jú, 0,1 mól betain/HCl-pufferrel készített 3%-os oldatát nagynyomású szivattyú segítségével az oszlopra visszük. Az inzulint a fenti puffer-oldatokból készített, 44% B-puffert tartalmazó izokratikusan eluáljuk, a retenciós idő kb. 35 perc. Frakcionálás után a főfrakcióban 98,1%-os humáninzulint találunk (80,5% hozam). Az inzulin jellegű termékek összhozama 90,5%.

12. példa

A: 0,1 mól ammónium-szulfát, 0,1 mól glutaminsav,

0,05 mól citromsav, pH 5,45 nátronlúggal; tisztán vizes

Puffer B: 0,1 mól ammónium-szulfát, 0,1 mól glutaminsav, 0,05 mól citromsav, pH 5,5 nátronlúggal, víz és izopropanol 1:1 arányban;

Szorbens: Nucleosil C18, 15-25 μτη, gömb alakú részecskék, pórusméret 100 angström

Oszlop: 50 mmx250 mm

Áramlás: 60 ml/perc

Humáninzulin-B30-di-terc-butil-treoninészter/éter észterbontásából származó 6 g humáninzulin (73% proteintartalom) 3,0 pH-jú, 0,1 mólos ecetsavval készített 3%-os oldatát nagynyomású szivattyú segítségével az oszlopra visszük. Az inzulint olyan gradienssel eluáljuk, amely 25%-tól 28%-ra emelkedő mennyiségben

HU 207 100 B

B-puffert tartalmaz. A retenciós idő kb. 25 perc. Frakcionálás után a főfrakcióban 98,6%-os humáninzulint találunk (65,5% hozam). Az inzulin jellegű termékek összhozama 88,5%.

13. példa

Puffer A: 0,1 mól trisz, 0,1 mól glicin, 0,1 mól ammónium-klorid, pH 8,5 sósavval, tisztán vizes

Puffer B: 0,1 mól trisz, 0,1 mól glicin, 0,1 mól ammónium-klorid, pH 8,5 sósavval, víz és n-propanol 1:1 arányú elegye

Szorbens: Kromasil C8,13 pm, pórusméret 100 angström

Oszlop: 50 mmx250 mm

33% B-puffert tartalmazó oldószereleggyel kiegyensúlyozott oszlopra 6 g humáninzulint (trifluorecetsavas bontásból) viszünk fel 8,5 pH-jú, 0,1 M triszpufferrel készített 3%-os oldat alakjában. Az inzulin kb. 35 perc elteltével eluálódik. Frakcionálás és kristályosítás után a főfrakcióban az inzulin 86%-át találjuk 96,6%-os tisztaságban. Az összhozam 95%.

14-17. példák

Humáninzulin-di-terc-butil-treonin-észter/éter trifluorecetsavas bontásából származó 3 g humáninzulin 3 pH-jú 0,1 mól glicin-pufferrel készített 3%-os oldatát az oszlopra visszük, majd 34% és 35% közötti mennyiségben B-puffert tartalmazó gradienssel eluál juk. Szorbens: Nucleosil C18, Macherey & Nagel Oszlop: 40x250 mm

Áramlás: 45 ml/perc.

A puffereket és a kettős ionok mennyiségét az alábbiak szerint változtatjuk meg.

14. példa

Puffer A: 0,1 M citromsav, 0,2 M ammónium-szulfát, pH 3,5 sósavval, 0,1 mól glicin, tisztán vizes

Puffer B: 0,1 M citromsav, 0,1 M ammónium-szulfát, pH 3,5 sósavval, víz és n-propanol 1:1 arányú elegye

Szorbens: Nucleosil C18, Macherey & Nagel

Oszlop: 40x250 mm

Áramlás: 45 ml/perc M glicinnel.

Eredmény: a főfrakció tisztasága 96%, hozama 66%; a mellékfrakció hozama 6%.

15. példa

Puffer A: 0,1 mól ammónium-klorid, 0,025 mól citromsav, pH 4,5 ammóniával, 5 tf% n-propanol, 0,1 mól glicinbetain

Puffer B: mint A, de 50 tf% n-propanol

Eredmény: a főfrakció tisztasága 98,1%, hozama 88%; a mellékfrakció hozama 6%.

16. példa

A 15. példa szerinti puffért alkalmazzuk, de a pHértéket 5,4-re állítjuk be, és a glicinbetain helyett 0,1 mól/í glicint alkalmazunk.

Eredmény: a főfrakció tisztasága 97,9%, hozama 92%; a mellékfrakció hozama 8%.

17. példa
Puffer A:	0,15 mól ammónium-szulfát, 0,10 mól trietil-amin, pH 6,0 kénsavval, 0,1 mól glicin, tisztán vizes;
Puffer B:	0,08 mól ammónium-szulfát, 0,05 mól trietil-amin, pH 6,0 kénsavval, víz és 2propanol 1: 1 arányú elegye
Szorbens:	Nucleosil C18-P, 15-25 μιη, gömb alakú részecskék, pórusméret 100 angström
Oszlop:	50 mmx250 mm
Áramlás:	60 ml/perc
Eredmény:	a főfrakció tisztasága 94,3%, hozama 77%; a mellékfrakció hozama 13%.
Az 1. táblázat az inzulin hozama és tisztasága,

valamint a pH-érték és/vagy az iker ionok jelenléte közötti összefüggést szemlélteti.

/. táblázat

pH	Ikerion	Főfrakció tisztasága %	Hozam %	Példa
főfr.	mellékfr.
6,4	nincs	92,7	72	4	17
8,5	nincs	96,1	65	25	13
3,5	Gly	96,0	66	6	14
4,5	glicin-be- tain	98,1	88	6	15
5,4	Gly	97,9	92	8	16
5,5	Gly	98,0	93	5	8
6,0	Gly	94,3	77	13	17
8,5	Gly	96,6	86	9	13

A táblázat első két sora a 13., ill. 17. példa szerinti eluensre vonatkozik, amelyből kihagytuk az iker iont. Látható, hogy a hozam valamennyivel gyengébb.

18. példa (összehasonlító példa)

A találmány szerinti eljárást összehasonlítottuk a

PCT/AT88/00063 sz. nemzetközi bejelentésből ismert eljárással. Az említett leírás 1. és 2. példáját reprodukáltuk humáninzuIin-B30-di-terc-butiIészter trifluorecetsavas bontásából származó humáninzulint tisztítva. Az inzulin proteintartalma 79% volt. A reprodukált példák leírása az alábbi feltételeket tartalmazza.

Paraméter	1. példa	2. példa
Oszlop	60x250 mm	60x250 mm
Álló fázis	módosított Cl 8kovasavgél	módosított Cl8kovasavgél
Szemcseméret	20-40 pm	20-40 μτη
Pórusméret	100 Angström	100 Angström
Eluáló elegy	26% metanol 74% 0,1 mól/1 trimetilammóniumfoszfát pH 2,45 0,4% dimetilszulfoxid 0,05% EDTA	18% acetonitrill 82% 0,12 mól/1 trimctilammóni- umfoszfát pH 2,9 0,52% dimetil. formamid 0,05% nitriloecetsav

HU 207 100 Β

Paraméter	1. példa	2, példa
Átfolyásisebes- ség	60 ml/perc	18 ml/perc
Nyomás	15xl0⁵ Pa	20x10⁵ Pa

Az alábbi 2. táblázat a PCT/AT88/00063 sz. nemzetközi bejelentés 1. és 2. példájának reprodukálást eredményeit mutatja (3 ismétlés), emellett a találmány szerinti eljárás (8. példa) eredményeit is.

2. táblázat

Kiindulási mennyiség	Összhozam %	Tisztaság
1. példa (PCT/AT88/00063)
5g	86,2	87,5
5g	84,3	85,2
5g	78,8	86,3
2. példa (PCT/AT88/00063)
5g	89,7	94,1
5g	88,9	95,1
5g	85,9	95,7
8. példa (találmány szerint)
5g	98%	98%

A PCT/AT88/00063 1. példája szerint végzett szétválasztás olyan inzulinfrakciókat eredményez, amelyek nem felelnek meg a gyógyszerkönyvek előírásainak. A

2. példa szerinti kísérleti körülmények között már a 3. tisztítási ciklus után a nyomás nagyon emelkedett, mert az oszlop anyagában lerakódások képződtek. A kovasavgél további tisztítási műveletekre alkalmatlan volt. A találmány szerinti paraméterek mellett egy oszloppal 280 tisztítási műveletet végeztünk anélkül, hogy az oszlop töltetét ki kellett volna cserélni.

Claims

1. Eljárás inzulinok és/vagy inzulin-származékok tisztítására, mely eljárás során az inzulint, illetve inzulin-származékot 2,8 és 8,5 közötti pH-értékre pufferolt oldószerben feloldjuk, lipofilra módosított kovasavgélre visszük, majd iker ionokat tartalmazó pufferolt oldószereleggyel az izoelektromos pont közelében eluáljuk, azzal jellemezve, hogy az eluálást iker ionokat 0,020,5 mól/1 koncentrációban tartalmazó eluálószerrel végezzük, amelynek pH-értéke 3,5 és 8,5 közötti, előnyösen legfeljebb 1 pH-egységgel a tisztítani kívánt inzulin és/vagy inzulin-származék izoelektromos pontja feletti vagy alatti.

2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az oldószerelegy pH-értéke legfeljebb 0,5 pHegységgel van a tisztítani kívánt inzulin vagy inzulinszármazék izoelektromos pontja felett vagy alatt.

3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy iker ionként valamely a-aminosavat vagy betaint alkalmazunk.

4. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy iker ionként glicint, glutaminsavat vagy glicinbetaint alkalmazunk.

5. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az eljárást preparatív nagynyomású folyadék kromatográfiás berendezéssel valósítjuk meg.