PL168114B1

PL168114B1 - Sposób chromatograficznego oczyszczania insulin PL PL PL PL PL PL PL

Info

Publication number: PL168114B1
Application number: PL91291616A
Authority: PL
Inventors: Rainer Dickhardt; Bernhard Unger; Leonard Haefner
Original assignee: Hoechst Ag
Priority date: 1990-09-05
Filing date: 1991-09-04
Publication date: 1996-01-31
Also published as: YU147591A; IL99384A0; HRP940716A2; KR100191699B1; LV10105A; FI914150A; UA26375A1; DE4028120C2; JPH04230699A; DE59106519D1; NO913476D0; IE68956B1; LT3329B; CA2050644C; US5245008A; GR3017750T3; FI98216B; ES2078405T3; LTIP713A; KR920006372A

Abstract

1. Sposób oczyszczania insuliny i/albo pochodnych insuliny przez chromatografie w wodnych, buforowanych rozpuszczalnikach, które zawieraja mieszajace sie z woda rozpusz- czalniki organiczne, na lipofilowo modyfikowanym zelu krzemionkowym, znamienny tym, ze w buforowanych rozpuszczalnikach rozpuszcza sie a-aminokwasy albo betainy albo wartosc pH buforowych rozpuszczalników nastawia sie do 1 jednostki pH ponizej albo powyzej punktu izoelektryczngo przeznaczonej do oczyszczania insuliny albo pochodnej insuliny i rozpuszcza sie a-aminokwasy albo betainy, przy czym stezenie a -aminokwasów albo betain wynosi 10 mmoli/1 do 1 mola/1, w odniesieniu do wody jako rozpuszczalnika, przy czym w buforowanych rozpuszczalnikach nie sa obecne dipolarne rozpuszczalniki aprotonowe. PL PL PL PL PL PL PL

Description

Wynalazek dotyczy sposobu oczyszczania insuliny i/albo pochodnych insuliny przez chromatografię w wodnych, buforowanych rozpuszczalnikach, które zawierają mieszające się z wodą rozpuszczalniki organiczne, na lipofilowo modyfikowanym żelu krzemionkowym, przy czym w wodnym, buforowanym rozpuszczalniku są rozpuszczone jony obojnacze i/albo wartość pH rozpuszczalnika znajduje się w pobliżu izoelektrycznego punktu przeznaczonej do oczyszczania insuliny albo pochodnej insuliny.

Z analitycznych sposobów rozdzielania znane jest oczyszczanie insulin albo pochodnych insuliny na lipofilowo modyfikowanych (reversed phase) żelach krzemionkowych i jest stosowane skutecznie od wielu lat w cieczowej chromatografii wysokociśnieniowej (HPLC) (WS Welinderet al., J.Chrom., 361, (1986) 357 - 367). W skali analitycznej ilości proteiny w zakresie (lg nanosi się na wypełnioną modyfikowanym żelem krzemionkowym kolumnę ze stali, szkła albo tworzywa sztucznego i następnie eluuje się przez przepływającą mieszaninę cieczy (najczęściej kwaśne, wodne roztwory buforowe o stałym albo zmiennym stężeniu rozpuszczalników organicznych). Ładunek proteiny wynosi przy tym znacznie mniej niż 30 pg/ml objętości kolumny.

Dotychczasowe sposoby oczyszczania stosują często używane w laboratorium, stosunkowo toksyczne, rozpuszczalniki (acetonitryl) i korozyjne, drogie składniki buforowe, np. sole tetraalkiloamonowe, alkilosulfoniany, heksafluoroaceton, trifluorooctan (E.P.Kroeff et al.,

J.Chrom., 461, (1989), 45-61). Te rozpuszczalniki w przypadku zanieczyszczonych silniej substancjami insulinopodobnymi mieszanin nie prowadzą do zadowalającego rozdzielania preparatywnego pod względem jakości, wydajności składnika głównego i ogólnego odzyskania

168 114 (J.Rivier, R.McClintock; J.Chrom., 268 (1983), 112-119; Peter et al„ J.Chrom., 408 (1987) 43-52). .

Insuliny z poprzednich przekształceń chemicznych jak np. z silnie kwaśnych rozdzieleń estrowych albo enzymatycznych procesów (trans-)peptydowania, z oczyszczeń krystalizacyjnych lub podobnych zawierają przeważnie substancje towarzyszące o podobnych właściwościach. Można je oczyścić przez dobór określonych wartości pH przez chromatografię jonowymienną, jeśli występują wystarczające różnice ładunku elektrycznego (opis patentowy St.Zjedn. Ameryki nr 4 129 560). Wada tej metody polega na efekcie rozcieńczenia i tym samym stracie surowców wtórnych przy przeróbce wytrąceń, na stosunkowo długim czasie albo na tym, że ogólne odzyskanie i tym samym wydajność jest mniejsza.

Preparatywne oddzielenia można osiągnąć zasadniczo przez powiększenie zawartości kolumny, ilość załadowania i natężenie przepływu roztworu wymywającego. Potrzebne tutaj ilości rozpuszczalników organicznych mieszczą się np. w przypadku kolumn o średnicach > 20 cm w skali m³. Stosowane do HPLC rozpuszczalniki (np. acetonitryl, DMF, metanol, dioksan, itd.) są toksyczne, tak że zastosowanie tych metod w preparatywnej skali produkcji wymaga nakładochłonnych środków ochronnych. W opisie patentowym Wielkiej Brytanii GB nr 2 119 248 opisano sposób oczyszczania insuliny w obecności dipolarnych rozpuszczalników aprotonowych. Chromatograficzne oczyszczanie insuliny w obecności jonów obojnaczych takich jak α-aminokwasy albo betainy nie jest opisane w opisie patentowym GB nr 2 119 248.

Zadaniem niniejszego wynalazku było opracowanie sposobu chromatograficznego oczyszczania insulin i pochodnych insuliny, w którym zostaje zachowana biologiczna aktywność insulin, osiąga się wysokie czystości za pomocą jednego etapu chromatografii, osiąga się krótkie czasy cyklu, czasy żywotności kolumn więcej niż 50 cykli chromatografii, regenerowanie stancjonarnej fazy żelu krzemionkowego bez czasochłonnych procesów upakowania (ułożenia) i zastosowanie nietoksycznych rozpuszczalników, tak że możliwa jest preparatywna skala produkcji.

Obecnie znaleziono sposób, którym można oczyścić insulinę i/albo pochodne insuliny przez chromatografię w wodnych, buforowanych rozpuszczalnikach, które zawierają mieszające się z wodą rozpuszczalniki organiczne, na lipofilowo modyfikowanym żelu krzemionkowym, który polega na tym, że w buforowanych rozpuszczalnikach rozpuszcza się α-aminokwasy albo betainy albo wartość pH buforowanych rozpuszczalników nastawia się do 1 jednostki pH poniżej albo powyżej punktu izoelektrycznego przeznaczonej do oczyszczania insuliny albo pochodnej insuliny i rozpuszcza się α-aminokwasy albo betainy, przy czym stężenie α-aminokwasów albo betain wynosi 10 mmoli/1 do 1 molah, w odniesieniu do wody jako rozpuszczalnika, przy tym w buforowanych rozpuszczalnikach nie są obecne dipolarne rozpuszczalniki aprotonowe.

Nieoczekiwanie obecność α-aminokwasów albo betain albo chromatografia przy wartości pH rozpuszczalnika, która znajduje się w pobliżu izoelektrycznego punktu oczyszczanej insuliny albo pochodnej insuliny i obecność α-aminokwasów albo betainy, powodują nie tylko dobre rozdzielenie produktu wtórnego (wartościowego) i zanieczyszczeń, lecz również dobre odłączenie protein od fazy stacjonarnej (lipofilowo modyfikowany żel krzemionkowy). Osiągnięte rozdzielenia pozwalają na oczyszczenie nawet silnie zanieczyszczonych składnikami insulinopodobnymi roztworów insuliny, jak np. rozdzielanie A21-dezamidoinsuliny od insuliny i pochodnych insuliny. Ponadto przez korzystne odłączenie protein od fazy stałej osiąga się długie żywotności upakowań kolumn i wysoką ratę ogólnego odzyskania insulin.

W sposobie według wynalazku można stosować wszystkie insuliny, jak np. insuliny wszystkich gatunków, które są pochodzenia zwierzęcego albo ludzkiego, zwiastuny insuliny,jak np. proinsuliny albo przedproinsuliny, albo rekombinowane insuliny albo pochodne insuliny, które są wyciskane przez genetycznie modyfikowane mikroorganizmy. Ponadto można również stosować pochodne insuliny, które np. zostały wytworzone przez chemiczne albo enzymatyczne tworzenie pochodnych, np. Des-Phe-B 1 -insulina, β-ketenosulfonian insuliny, diargininoinsulina (B31, B32), monoargininoinsulina albo difenyloalaninoinsulina (B31, b32) (opis patentowy St.Zjedn.Ameryki nr 4 601 852).

Korzystnie stosuje się pochodne insuliny o wzorze, przedstawionym na załączonym rysunku, w którym R'^(> oznacza resztę dającego się kodować genetycznie L-aminokwasu,

168 114

X-oznacza grupę hydroksylową, fizjologicznie nie budzącą zastrzeżeń organiczną grupę o charakterze zasadowym zawierającą do 50 atomów węgla, dający się kodować genetycznie L-aminokwas i jego ewentualnie obecną stojącą na końcu funkcję karboksylową wolną, jako funkcję estrową, jako funkcję amidową, jako lakton albo zredukowaną, do CH2 OH, n oznacza liczbę całkowitą od 0 do l0,Y oznacza wodór albo L-fenyloalaninę i łańcuch A i B oznaczają sekwencje zwierzęcej albo ludzkiej insuliny.

Szczególnie korzystnie stosuje się pochodne insuliny o wzorze, przedstawionym na załączonym rysunku, w którym R'° oznacza L-alaninę albo L-treoninę i X oznacza jeden albo więcej L-aminokwasów z grupy obejmującej L-argininę, L-lizynę albo L-fenyloalaninę.

Insuliny i pochodne insuliny można stosować zarówno w stanie stosunkowo zanieczyszczonym, jak również w postaci wstępnie oczyszczonej (np. przez chromatografię żelową). Insulinajest po kilkakrotnej krystalizacji a także po chromatografii żelowej zanieczyszczona jeszcze insulinopodobnymi substancjami towarzyszącymi o bardzo podobnym ciężarze cząsteczkowym, które przy dobrze dobranym pH różnią się w swym stanie ładunku między sobą i od insuliny, ale z insuliną tworzą związki kompleksowe (opis patentowy St.Zjedn.Ameryki nr 4 129 560). Przykłady takich substancji stanowią: dezamidoinsuliny, arginino- i diargininoinsulina, ester etylowy insuliny i inne.

Przez lipofilowo modyfikowany żel krzemionkowy rozumie się żel krzemionkowy, na który została naniesiona hydrofobowa matryca. Przykłady hydrofobowej matrycy stanowią alkany o długości łańcucha 3 do 20 atomów węgla. Szczególnie korzystnymi lipofilowo modyfikowanymi materiałami żelu krzemionkowego są np.:

^(R) Nucleosil, firma Macherey i Nagel: sferyczne i nie sferyczne materiały o różnych wielkościach ziarna do 45 pm, wielkość poru 100 A, C8 - lub C18-modyfikowany;

(R) Lichroprep, firma Merck: nie sferyczne i sferyczne materiały o różnych wielkościach ziarna do 40 pm, wielkość poru 60-250 A, C8-C18-modyfikowany;

(R) Lichrospher Select B, firma Merck: sferyczny materiał do 25 pm wielkości ziarna, C8-modyfikowany;

(R) Waters Prep, C18-modyfikowany, wielkość poru 100 A;

(R) Zorbax Pro 10, firma DuPont: C8-modyfikowany, 10 pm, sferyczny, wielkość poru 100 A;

(R) Kromasil, firma EKA Nobel: C4-, C8-C18-modyfikowany, do 16 pm, sferyczny, wielkość poru 100, 150 albo 200 A.

Jony obojnacze stanowią związki, które mogą pobierać protony a także oddzielać, to znaczy w kwaśnym roztworze tworzą kationy a w alkalicznym roztworze aniony, jak na przy kład α-aminokwasy albo betaina.

Punkt izoelektryczny (IEP) insuliny albo pochodnej insuliny jest to ta wartość pH roztworu insuliny, w którym liczba ładunków kationowych i ładunków anionowych rozpuszczonej insuliny jest równa zeru. Na przykład IEP insuliny świńskiej wynosi między 5,3 i 5,4 (H.Neurath,

K.Bailey, Protein Hormones, tom IEA, The Proteins, str. 636). Pojęcie w pobliżu punktu izoelektrycznego oznacza w szczególności wartości pH, które mieszczą się o około 1 jednostkę pH powyżej albo poniżej IEP przewidzianej do oczyszczenia insuliny.

Szczególnie korzystne są wartości pH, które wynoszą do 0,5 jednostek pH powyżej albo poniżej IEP.

Roztwory wymywające zawierają substancję buforową, aby utrzymać niezmienną wartość pH roztworu wymywającego. Odpowiednie substancje buforowe są znane w literaturze, np. fosforany, sole metali alkalicznych albo metali ziem alkalicznych, takich jak cytrynian sodu albo octan potasu, cytrynian, octan, siarczan albo chlorek amonu. Ponadto roztwory wymywające zawierają mieszające się z wodą rozpuszczalniki jak np. alkohole, ketony, octan metylu, dioksan, dwumetylosulfotlenek albo acetonitryl. Korzystne są alkohole takie jak n- albo izo-propanol, metanol, etanol albo octan metylu.

Stężenie mieszających się z wodą rozpuszczalników organicznych wynosi między 1 i 90%, korzystnie między 10 i 60%, szczególnie korzystnie między 10 i 35%. Stężenie substancji buforowej wynosi między 1 mmol/1 i 2 mole/1, w odniesieniu do wody jako rozpuszczalnika, korzystnie między 25 mmol/1 i 1 mol/1. Stężenie jonów obojnaczych może się wahać w szerokim

168 114 zakresie. Korzystne ilości wynoszą między 10 mmoli/1 i 1 mol/1, w odniesieniu do wody jako rozpuszczalnika, korzystnie między 20 mmoli/1 i 500 mmoli/1.

Temperatura podczas chromatografii wynosi między 0°C i 50°C, korzystnie między 15 i 30°C, szczególnie korzystnie między 15 i 20°C. Ciśnienie robocze podczas chromatografii jest w znacznym stopniu niezmienne. Chromatografię można przeprowadzać pod różnym ciśnieniem, np. można przeprowadzić chromatografię pod ciśnieniem 0,5 do 40 MPa,w szczególności 2 do 10MPa.

Załadowanie kolumn, chromatografię i wymywanie insulin i pochodnych insuliny przeprowadza się znanymi, powszechnie przyjętymi metodami technicznymi. Załadowanie kolumny przeznaczonym do oczyszczania roztworem insuliny przeprowadza się korzystnie za pomocą wodno-alkoholowego albo czysto wodnego roztworu buforowego. Zawartość proteiny w roztworze insuliny wynosi między 1 i 10%, korzystnie 3%.

Wymywanie insulin przeprowadza się sposobem według wynalazku przy niezmiennym stężeniu substancji buforowych (izokratycznie) albo przez zmianę udziału mieszającego się z wodą rozpuszczalnika organicznego w buforze. Zmianę rozpuszczalnika organicznego przeprowadza się w ten sposób, że stężenie użytego rozpuszczalnika organicznego wzrasta w zależności od objętości elucji, i to korzystnie w zależności liniowej.

Oddzielanie insuliny po chromatografii z eluatów przeprowadza się przez wytrącanie za pomocą cynku albo przez krystalizację. Przy tym roztwór, do wyboru, można uprzednio za pomocą destylacji próżniowej uwolnić w znacznej mierze od rozpuszczalnika albo zredukować jego stężenie przez rozcieńczenie wodą. W każdym razie stężenie rozpuszczalnika przed strącaniem albo krystalizacją powinno wynosić 10%o albo mniej, aby utrzymać zawartość proteiny <50 mg/l. Powstałe czyste osady insuliny można wyodrębnić przez dekantowanie, wirowanie albo sączenie i następnie wysuszyć.

Sposób według wynalazku nadaje się nie tylko do chromatografii analitycznej, lecz również do chromatografii preparatywnej, w szczególności jeśli sposób według wynalazku przeprowadza się za pomocą preparatywnego urządzenia HPLC.

Pod pojęciem chromatografia preparatywna rozumie się sposób oczyszczania, mający na celu uzyskanie czystych produktów a nie tylko analizowanie. Ilość czystych produktów może się wahać w szerokich granicach, np. od 1 mg do 50 kg, korzystnie między 50 mg i 15 kg.

W następujących przykładach opisano szczegółowo sposób według wynalazku. Dane procentowe odnoszą się do ciężaru, jeśli nie podano inaczej.

Przykład I.

Bufor A: 0,2 M siarczanu amonu, 0,1 M glicyny, 0,05 M cytrynianu sodu, pH 5,5, czysto wodny;

Bufor B: 0,1 M siarczanu amonu, 0,1 M glicyny, 0,05 M cytrynianu sodu; pH 5,5, woda/n-propanol w stosunku 1:1.

Sorbent: Nucleosil C 18,15-25 μm sferyczny, wielkość poru 100 A, firmaMachery i Nagel, Dureń;

Obmiar kolumny: 40 mm x 250 mm.

Naładowanie kolumny przeprowadza się za pomocą 3,5 g insuliny ludzkiej (HI) otrzymanej z rozszczepiania kwasem trójfluorooctowym z ludzkiej insuliny- B30-di-tert.butyloestru/eteru, z zawartością proteiny 79,1%. Wymywanie insuliny przeprowadza się w ten sposób, że roztwór buforowy A i B miesza się za pomocą odpowiedniej pomp/ wysokociśnieniowej z urządzeniem mieszającym, tak że wytwarza się gradient propanolu 14 do 20%. Wymywanie insuliny przeprowadza się przy około 17,5% propanolu po 23 minutach, gdy pompuje się 46 ml/min.

Po frakcjonowaniu i wyodrębnieniu krystalizowanej insuliny ludzkiej (HI) otrzymuje się produkt o 97% proteiny z 88,5 wydajnością we frakcji głównej i 7,5% wydajności frakcji ubocznej z udziałem proteiny 85,7%. Ogólna wydajność wynosi zatem 96,0% wniesionej insuliny.

Przykład II.

Bufor A: 0,1 M siarczanu amonu, 0,1 M glicyny, 0,025 M cytrynianu sodu, pH 5,5, czysto wodny;

168 114

Bufor B: 0,05 M siarczanu amonu, 0,1 M glicyny, 0,025 M cytrynianu sodu, pH 5,5 woda/n-propanol w stosunku 1:1. _o

Sorbent: Nucleosil C18-P, 15-25 pm sferyczny, wielkość poru 100 A, firma Macherey i Negel;

Obmiar kolumny: 40 mm x 250 mm.

Kolumnę załadowuje się 7,0 g insuliny ludzkiej (HI) (udział proteiny 86,1%) z rozszczepiania estrowego ludzkiej insuliny-di-tert.butylo-estru/eteru w postaci 3% roztworu w 0,1 M buforze glicyna/HCl, pH 2,8, za pomocą pompy wysokociśnieniowej. Następnie przeprowadza się wymywanie za pomocą wyżej opisanych roztworów buforowych pod ciśnieniem w gradiencie n-propanolu. W ciągu 60 minut wzrasta stężenie propanolu z 14 do 17,5%. Po frakcjonowaniu i krystalizacji w wyżej wymieniony sposób otrzymuje się produkt o udziale 98,7% proteiny. Wydajność oczyszczonej insuliny ludzkiej wynosi 91% zastosowanej insuliny.

Przykład III.

Bufor A: 0,1 M siarczanu amonu, 0,1 M glicyny, 0,025 M octanu sodu, pH 5,5, czysto wodny;

Bufor B: 0,05 M siarczanu amonu, 0,1 M glicyny, 0,02 M octanu sodu, pH 5,5, woda/npropanol w stosunku 1:1.

Sorbent: Lichrospher Select B, C8, 15-25 pm, wielkość poru 60 A, firma Merck.

Obmiar kolumny: 50 mm x 250 mm.

Kolumnę załadowuje się roztworem 10 g mieszaniny reakcyjnej z przeamidowania insuliny świńskiej z trypsyną, rozpuszczoną w 200 ml 0,1 M buforu glicyna/HCl, pH 2,8. W ciągu 120 minut są eluowane oddzielnie poszczególne składniki proteinowe przy strumieniu 40 ml/min i zwiększeniu stężenia propanolu z 14 do 30%. Otrzymuje się po krystalizacji lub strąceniu i suszeniu jako frakcję główną ludzką insulinę- B30-diitert.butylotteonino-ester/eter o czystości > 97% z wydajnością 93%, w odniesieniu do użytej insuliny.

Przykład IV.

Bufor A: 0,1 M chlorku sodu, 0,1 M glicyny, 0,02 M octanu sodu, pH 5,5, czysto wodny;

Bufor B: 0,05 M chlorku sodu, 0,1 M glicyny, 0,025 M octanu sodu, pH 5,5, woda/n-propanol w stosunku 1:1.

Sorbent: Zorbax Pro10, C8, 10 pm, firma DuPont.

Obmiar kolumny: 5 cm x 25 cm.

Pompowano 7,5 g HI z rozszczepieniem kwasem trójfluorooctowym ludzkiej insuliny-B30-(Ji-tert.butylotreonino-ester/eter w 100 ml 0,1 M roztworu glicyna/HCl na kolumnę i eluowano przy strumieniu 80 ml/min. Stężenie buforu B wzrastało w ciągu 60 minut z 18 do 25%. Czas retencji (Rt) wynosił tutaj około 37 minut. Z frakcji głównej dało się wyodrębnić po krystalizacji i suszeniu 96,8% HI z wsadu o czystości > 97%, frakcja uboczna zawierała 2,2% HI o czystości < 50%.

Przykład V.

Bufor A: 0,2 M siarczanu sodu, 0,1 M glicyny, 0,03 M octanu amonu, pH 5,5, 10% octan metylu;

Bufor B: 0,05 M siarczanu sodu, 0,1 M glicyny, 0,03 M octanu amonu, pH 5,5,20% octan metylu. _o

Sorbent: Kromasil C8, 13 pm, wielkość poru 100 A, firma EKA Nobel.

Obmiar kolumny: 5 cm x 25 cm.

Wprowadzono 8 g insuliny bydlęcej na litr objętości kolumny za pomocą 0,1 M buforu glicyna/HCl na kolumnę, zrównoważone przy 30%buforu B.W ciągu 90 minut wzrosło stężenie buforu B do 80% (=18% octanu etylu);

Insulina bydlęca eluowała po 65 minutach z czystością > 97,5% we frakcji głównej (wydajność 63,5%) i została wytrącona po rozcieńczeniu wodą za pomocą chlorku cynku. Ogólna wydajność wynosiła 92,5%.

Przykład Vl.

Bufor A: 0,1 M siarczanu amonu, 0,1 M glicyny, 0,025 M octanu sodu, pH 5,5, 5% n-propanol;

168 114

Bufor B: 0,05 M siarczanu amonu, 0,1 M glicyny, 0,025 M octanu sodu, pH 5,5, woda/n-propanol w stosunku 1:1.

Sorbent: Kromasil C8, 13 pm, wielkość poru 100 A, firma EKA Nobel.

Obmiar kolumny : 5 cm x 25 cm.

Naładowanie kolumny wynosiło 4 g (= 8 g/l) ludzkiej insuliny z rozszczepiania kwasem trifluorooctowym ludzkiej insuliny- B30-di-tert. butylo-treoninoester/eter o czystości około 92%. W gradiencie z 18 do 25% buforu B w ciągu 90 minut eluowała insulina ludzka po 45 minutach z czystością > 97% we frakcji głównej (wydajność 91,8%) i 80,5% we frakcji ubocznej (wydajność 4,7%).

Przykład VII.

Bufor A: 0,1 M siarczanu amonu, 0,1 M glicyny, 0,026 M octanu sodu, pH 5,5, 10% n-propanol;

Sorbent: kromasil C8, 13 pm, wielkość poru 100 A, firma EKA Nobel.

Obmiar kolumny: 10 cm x 40 cm.

Na kolumnę podano 18 g insuliny świńskiej w 1,8 10,1 M buforu glicyna/HCl, pH 3,0, z 5% n-propanolu. Gradient przebiegał od 9% buforu B (= 13,6% n-propanolu) do 11% buforu B (= 14,4% n-propanolu) w ciągu 70 minut.

Insulina świńska eluowała po 50 minutach z zawartością > 98% proteiny we frakcji głównej (wydajność 89%).-Ogólna wydajność wynosiła 96,8% wsadu.

Przykład VIII.

Bufor A: 0,2 M chlorku amonu, 0,1 M glicyny, 0,025 M cytrynianu sodu, 5% n-propanolu, pH 5,5;

Bufor B: jak bufor A jednak dodatek 50% n-propanolu.

Sorbent: Kromasil C8, 13 pm, wielkość poru 100 A, firma EKA Nobel, Szwecja.

Obmiar kolumny: 50 mm x 250 mm.

g wytworzonej genotechnicznie insuliny ludzkiej (udział proteiny 89,5%) rozpuszcza się w 0,1 M buforu glicyny, pH 3,0, jako 2% roztwór proteiny i pompuje przez pompę wysokociśnieniową na kolumnę. Wymywanie przeprowadza się przez gradient liniowy z 13% do 16% n-propanolu w ciągu 70 minut przy strumieniu 80 ml/min. Po frakcjonowaniu i krystalizacji otrzymuje się we frakcji głównej insulinę ludzką o zawartości proteiny 98% z wydajnością 93%.

Ogólna wydajność wynosi 98% w odniesieniu do wsadu.

Przykład IX.

Bufor A: 0,2 M siarczanu amonu, 0,1 M glicyny, 0,025 M cytrynianu amonu, 5% etanolu, pH 5,5;

Bufor B: jak bufor A, jednak dodatek 50% etanolu.°

Sorbent: Kromasil C8, 10 pm, wielkość poru 100 A, firma EKA Nobel, Szwecja.

Obmiar kolumny: 50 mm x 250 mm.

W 250 ml buforu glicyny, pH 3,0,rozpuszcza się 4,5 g wytworzonej genotechnicznie insuliny ludzkiej (udział proteiny 86,2%) i następnie pompuje na kolumnę. Do chromatografii proteiny wytwarza się przez dwie pompy wysokociśnieniowe liniowy gradient z obydwu buforów A i B. Wymywanie przeprowadza się po 100 minutach przy stężeniu etanolu 33% i niezmiennym strumieniu 80 ml/min. Po frakcjonowaniu i krystalizacji otrzymuje się w frakcji głównej insulinę ludzką o zawartości proteiny 96% przy ogólnej wydajności 93% w odniesieniu do produktu wsadowego.

Przykład X.

Bufor A: 0,2 M chlorku amonu, 0,1 M glicyny, 0,025 M cytrynianu sodu, 10% octanu metylu, pH 5,5;

Bufor B: takie samo stężenie soli jak w buforze A, jednak 20% octanu metylu.

Sorbent: Kromasil C8, 10 pm, wielkość poru 100 A, firma EKA Nobel, Szwecja.

Do chromatografii 4,6 g surowej insuliny ludzkiej, która pochodzi z przeróbki wytworzonej genotechnicznie insuliny, rozpuszcza się w 200 ml wodnego buforu glicyny i następnie pompuje na kolumnę HPLC 50 x 250 mm. Materiał kolumnowy równoważy się uprzednio przez

1658114 zmieszanie buforów A i B za pomocą dwóch pomp wysokociśnieniowych do stężenia octanu metylu wynoszącego 13% octanu metylu. Po zasileniu przeprowadza się wymywanie insuliny ludzkiej przez gradient liniowy z 13% do 17% octanu metylu w ciągu 90 minut. Wyodrębnienie produktu głównego przeprowadza się przez krystalizację roztworu z wymywania. Otrzymuje się przy tym 3,8 g insuliny ludzkiej o zawartości proteiny 96%. Ogólna wydajność w odniesieniu do materiału wyjściowego, wynosi przy tym 90%.

Przykład XI.

Bufor A: 0,2 M siarczanu amonu, 0,1 M betainy, 0,05 M kwasu cytrynowego, pH 5,5 z ługiem sodowym (czysto wodny);

Bufor B: 0,1 M siarczanu amonu, 0,1 M betainy, 0,05 M kwasu cytrynowego, pH 5,5 z ługiem sodowym (woda/izo-propanol stosunek 1:1);

Sorbent: Nucleosil C18, 15-25 μm sferyczny, 100 A;

Kolumna: 40 mm x 250 mm.

Strumień: 45 ml/min.

Kolumnę załadowano 3 g (79% udział insuliny) insuliny ludzkiej z rozszczepiania estrowego ludzkiej insuliny-di-tert. butylo-ester/eter w postaci 3% roztworu w 0,1 M buforze betaina/HCl, pH 3,0 za pomocą pompy wysokociśnieniowej. Następnie eluowano izokratycznie za pomocą wyżej wymienionego układu buforowego przy 44% buforu B. Czas retencji wynosił około 35 minut. Po frakcjonowaniu otrzymano we frakcji głównej 98,1% insuliny ludzkiej z wydajnością 80,5%. Ogólna wydajność wynosiła 90,5%.

- Przykład XII.

Bufor A: 0,1 M siarczanu amonu, 0,1 M kwasu glutaminowego, 0,05 M kwasu cytrynowego, pH 5,45 z ługiem sodowym (czysto wodny);

Bufor B: 0,1 M siarczanu amonu, 0,1 M kwasu glutaminowego, 0,05 M kwasu cytrynowego, pH 5,5 z ługiem sodowym (woda/n-propanol:1:1).

Sorbent: Nucleosil C18-P, 15-25 gm sferyczny, 100 A;

Kolumna: 50 mm x 250 mm.

Strumień: 60 ml/min.

Kolumnę naładowano 6 g (udział proteiny 73%) insuliny ludzkiej z rozszczepiania estrowego ludzkiej insuliny-di-tert.-butylo-ester/eter w postaci 3% roztworu w 0,1 M kwasie octowym, pH3,0, za pomocą pompy wysokociśnieniowej. Następnie eluowano za pomocą wyżej wymienionego układu buforowego przy 25%-28% buforu B w gradiencie. Czas retencji wynosił około 25 minut.

Po frakcjonowaniu otrzymano we frakcji głównej 98,6% insuliny ludzkiej z wydajnością 65%. Ogólna wydajność wynosiła 88,5%.

Przykład XIII.

Bufor A: 0,15 M siarczanu amonu, 0,10 M trietyloaminy, pH 6,5 z kwasem siarkowym (czysto wodny);

Bufor B: 0,08 M siarczanu amonu, 0,05 M trietyloaminy, pH 6,5 z kwasem siarkowym (woda/2-propanol: 1:1); °

Sorbent: Nucleosil C18-P, 15-25 gm sferyczny, 100 A;

Kolumna: 50 mm x 250 mm.

Strumień: 60 m/min.

Po załadowaniu kolumny 5 g ludzkiej insuliny z rozszczepiania kwasem trifluorooctowym ludzkiej insuliny-di-tert.-butylo-treonino-ester/eter w roztworze 3% eluowano między 32 i 42% buforu B. Czas retencji wynosił 40 minut. Po frakcjonowaniu i krystalizacji otrzymano 72% we frakcji głównej z czystością 92,7%.

Ogólna wydajność wynosiła 76% użytej ilości.

Przykład XIV.

bufor A: 0,1 M kwasu cytrynowego, 0,2 M siarczanu amonu, pH 2,5 z kwasem solnym, czysto wodny;

Bufor B: 0,1 M kwasu cytrynowego, 0,1 M siarczanu amonu, pH 2,5 z kwasem solnym, woda/n-propanol: 1:1.

Sorbent: Nucleosil C18, firma Macherey i Nagel.

168 114

Kolumna: 40 x 250 mm.

Strumień: 45 ml/min.

Po naładowaniu kolumny 3 g insuliny ludzkiej z rozszczepiania kwasem trifluorooctowym ludzkiej insuliny-di-tert.-butylo-treoninoester/eter w postaci 3% roztworu w 0,1 M buforu glicyny pH 3 eluowano między 34 i 35% buforu B. Czas retencji wynosił 45 minut. Po frakcjonowaniu, krystalizacji i suszeniu wyodrębniono 57% ilości wsadowej we frakcji głównej z czystością 94,8% i 16% we frakcji ubocznej (czystość 84%).

Przykład XV.

Bufor A: 0,1 M kwasu cytrynowego, 0,2 M siarczanu amonu, pH 3,5 z kwasem solnym, czysto wodny;

Bufor B: 0,1 M kwas cytrynowy, 0,1 M siarczanu amonu, pH 3,5 z kwasem solnym, woda/n-propanol 1:1.

Sorbent: Nucleosil C18, firma Macherey i Nagel.

Kolumna: 40 x 250 mm.

Strumień: 45 ml/min.

Naładowanie kolumny przeprowadza się jak w przykładzie XIV. Czas retencji wynosił około 40 minut. Po frakcjonowaniu, krystalizacji i suszeniu znaleziono 51% zastosowanej insuliny ludzkiej o czystości 97,5% we frakcji głównej i 4% we frakcji ubocznej (czystość 68%).

Przykład Xvi.

Bufor A: 0,1 M Tris(2-amino-2-hydroksymetylo-1,3-propandiol), 0,1 M glicyny, 0,1 M chlorku amonu, pH 8,5 z kwasem solnym, czysto wodny;

Bufor B: 0,1 M Tris(2-amino-2-hydroksymetylo-1,3-propandiol), 0,1 M glicyny, 0,1 M chlorku amonu, pH 8,5 z kwasem solnym, woda/n-propanol: 1:1.

Sorbent: Kromasil C8, 13 pm, 100 A.

Kolumna: 50 mm x 250 mm.

Strumień: 60 ml/min.

Zrównoważoną na 33% buforu B kolumnę naładowano 6 g insuliny ludzkiej z rozszczepiania kwasem trifluorooctowym (patrz przykład XIV) w postaci 3% roztworu w 0,1 M trisbuforze, pH 8,5. Wymywanie przeprowadzono po około 35 minutach. Po frakcjonowaniu i krystalizacji frakcja główna zawierała 96,6% insulinę ludzką z wydajnością 86%. Ogólne odnalezienie wynosiło 95%.

Przykład XVII.

Bufor A: 0,1 M chlorku amonu, 0,025 M kwasu cytrynowego, pH 5,5 z amoniakiem, 5% objętościowych propanolu;

Bufor B: 0,1 M chlorku amonu, 0,025 M kwasu cytrynowego, pH 5,5 z amoniakiem, 50% objętościowych n-propanolu. °

Sorbent: Kromasil C8, 13 pm, 100 A.

Kolumna: 50 mm x 250 mm.

Strumień: 60 ml/min.

Kolumnę naładowano, jak już opisano, 6 g insuliny ludzkiej z rozszczepiania kwasu trifluorooctowego (patrz przykład XIV).

W obrębie gradientu od 21% do 25% buforu B w ciągu 60 minut eluowano insulinę z czasem retencji 40 minut. Frakcja główna zawierała 91% produktu wsadowego o czystości 97,5%. Ogólna wydajność wynosiła 96%.

Przykład XVIII.

Bufor A: 0,1 M chlorku potasu, 0,025 M kwasu cytrynowego, pH 5,5 z ługiem potasowym, 5% objętościowych n-propanolu.

Bufor B: 0,1 M chlorku potasu, 0,025 M kwasu cytrynowego, pH 5,5 z ługiem potasowym, 50% objętościowych n-propanolu. _o

Sorbent: Kromasil C8, 13 pm, 100 A.

Kolumna: 50 mm x 250 mm.

Strumień: 60 ml/min.

168 114

Naładowanie i gradient jak w przykładzie XVII. Wymywanie przeprowadzono po 35 minutach. Frakcja główna zawierała 90% ilości wsadowej insuliny ludzkiej o czystości 96,5%. Ogólna wydajność wynosiła 93%.

Przykłady XIX do XXIV.

W przykładach XIX do XXIV przeprowadzono chromatografię w takich samych warunkach jak w przykładzie XIV. Zmieniono tylko bufory lub ilość jonu obojnaczego.

Przykład XIX.

Bufor A: 0,15 M siarczanu amonu, 0,1 trietyloaminy, pH 7,0 z kwasem siarkowym;

Bufor B: 0,08 M siarczanu amonu, 0,05 M trietyloaminy, pH 7,0 z kwasem siarkowym.

Wynik: 95,2% czystość frakcji głównej; 67% wydajności we frakcji głównej.

Przykład XX.

Bufory jak w przykładzie XVI jednak bez 0,1 M glicyny.

Wynik: 96,1 % czystość we frakcji głównej; 65% wydajność we frakcji głównej i 25% we frakcji ubocznej.

Przykład XXI.

Bufory jak w przykładzie XV z dodatkowo 0,1 M glicyny.

Wynik: 96% czystość we frakcji głównej; 66% wydajność we frakcji głównej i 6% we frakcji ubocznej.

Przykład XXII.

Bufor A: 0,1 M chlorku amonu, 0,025 M kwasu cytrynowego, pH 4,5 z amoniakiem, 5% objętościowych n-propanolu, 0,1 M glicynobetainy.

Bufor B: jak bufor A, ale dodatkowo 50% n-propanolu.

Wynik: 98,1% czystość we frakcji głównej; 88% wydajność we frakcji głównej i 6% we frakcji ubocznej.

Przykład XXIII.

Bufory jak w przykładzie XXII, ale pH 5,4 i 0,1 M glicyny zamiast glicynobetainy.

Wynik: 97,9% czystość we frakcji głównej i 8% we frakcji ubocznej.

Przykład XXIV.

Bufory jak w przykładzie XIII, ale pH 6,0 i dodatkowo 0,1 M glicyny.

Wynik: 94,3% czystość we frakcji głównej; 77% wydajność we frakcji głównej i 13% we frakcji ubocznej.

Przykład XXV.

Tabela podaje przegląd wydajności i czystości insulin w zależności od wartości pH i/albo jonu obojnaczego w roztworze wymywającym.

Tabela

Wartość pH	Jon obojnaczy	Czystość frakcja główna	Wydajność	Przykład nr
frakcja główna	frakcja uboczna
2,5	-	94,8	57	16	XIV
3,5	-	97,5	51	4	XV
6,5	-	92,7	72	4	XIII
7,0	-	95,2	67	-	XIX
8,5	-	96,1	65	25	XX
5,5	-	97,5	91	5	XVII
5,5	-	96,5	90	3	XVIII
3,5	Gly	96,0	66	6	XXI
4,5	glicynobetaina	98,1	88	6	XXII
5,4	Gly	97,9	92	8	XXIII
5,5	Gly	98,0	93	5	VIII
6,0	Gly	94,3	77	13	XXIV
8,5	Gly	96,6	86	9	XVI

168 114

Przykład XXVI (porównawczy).

Przeprowadzono chromatograficzne oczyszczanie insuliny ludzkiej według przykładów 1 i 2 z opisu patentowego Wielkiej Brytanii GB nr 2 119 248 i porównano.

Do oczyszczania zastosowano ludzką insulinę, która pochodzi z rozszczepiania kwasem trifluorooctowym ludzkiej insuliny-B30-di-tert.butyloestru z zawartością proteiny wynoszącą 79%.

Zachowano warunki doświadczenia wymienione w przykładzie 1 i 2 (według GB-2 119 248).

Materiał	Przykład 1	Przykład 2
kolumna	60 mm x 250 mm	60 mm x 250 mm
faza stacjonarna	Cis modyfikowany żel krzemionkowy	C18 modyfikowany żel krzemionkowy
wielkość ziarna	20 do 40 pm	20 do 40 pm
wielkość porów	100 A	100 A
eluent	26% metanol 74% 0,1 M fosforan trietyloamonu pH 2,45 0,4% dimetylosulfotlenek 0,05% kwas etylenodiaminotetraoctowy	18% acetonitryl 82% 0,12 M fosforan trietyloamonu pH 2,9 0,52% dimetyloformamid 0,05% kwas nitrylotrioctowy
przepływ	60 ml/minutę	18 ml/minutę
ciśnienie	15 · 10⁵Pa	20 · 105pa

Następująca tabela pokazuje wyniki każdorazowo 3 przebiegów z warunkami z przykładu 1 i 2, oraz porównanie z warunkami doświadczenia wymienionymi w przykładzie VIII według wynalazku.

Tabela

	Wsad insuliny	Wydajność całkowita	Czystość
przykład 1	5 g	86,2%	87,5%
	5 g	84,3%	85,2%
	5 g	78,8%	86,3%
przykład 2	5 g	89,7%	94,1%
	5 g	88,9%	95,1%
	5 g	85,9%	95,7%
przykład VIII
według wynalazku	5 g	98%	98%

Rozdzielanie insulin według przykładu 1 prowadzi do frakcji insuliny, które nie odpowiadają wymaganion odnośnych farmakopei. Dalej warunki doświadczenia według przykładu 2 prowadzą już po 3 doświadczeniach do silnego wzrostu ciśnienia w kolumnie.

Badanie materiału kolumny wykazuje silne osady na żelu krzemionkowym, tak że materiał kolumny jest nieużyteczny do dalszych oczyszczeń.

Za pomocą warunków doświadczenia według wynalazku przeprowadzono już do 280 oczyszczeń insuliny, bez konieczności wymiany materiału kolumny.

Claims

1. Sposób oczyszczania insuliny i/albo pochodnych insuliny przez chromatografię w wodnych, buforowanych rozpuszczalnikach, które zawierają mieszające się z wodą rozpuszczalniki organiczne, na lipofilowo modyfikowanym żelu krzemionkowym, znamienny tym, że w buforowanych rozpuszczalnikach rozpuszcza się α-aminokwasy albo betainy albo wartość pH buforowych rozpuszczalników nastawia się do 1 jednostki pH poniżej albo powyżej punktu izoelektryczngo przeznaczonej do oczyszczania insuliny albo pochodnej insuliny i rozpuszcza się α-aminokwasy albo betainy, przy czym stężenie α-aminokwasów albo betain wynosi 1θ mmoli/1 do 1 mola/1, w odniesieniu do wody jako rozpuszczalnika, przy czym w buforowanych rozpuszczalnikach nie są obecne dipolarne rozpuszczalniki aprotonowe.

2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że nastawia się wartość pH mieszaniny rozpuszczalników do 0,5 jednostek pH poniżej albo powyżej punktu izoelektrycznego.

3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się pochodne insuliny o wzorze, przedstawionym na załączonym rysunku, w którym R³⁰ oznacza resztę dającego się kodować genetycznie L-aminokwasu, X oznacza grupę hydroksylową, fizjologicznie nie budzącą zastrzeżeń organiczną grupę o charakterze zasadowym zawierającą do 50 atomów węgla, dający się kodować genetycznie L-aminokwas i jego ewentualnie obecną stojącą na końcu funkcję karboksylową wolną, jako funkcję estrową, jako funkcję amidową, jako lakton albo zredukowaną do CH 2 OH, n oznacza liczbę całkowitą od 0 do 10, Y oznacza wodór albo L-fenyloalaninę i łańcuch A i B oznaczają sekwencje zwierzęcej albo ludzkiej insuliny.

4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że stosuje się pochodne insuliny o wzorze przedstawionym na załączonym rysunku, w którym R30 oznacza L-alaninę albo L-treoninę i X oznacza jeden albo więcej L-aminokwasów z grupy obejmującej L-argininę, L-lizynę albo L-fenyloalaninę.